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背景:加重是临床表现和自然历史的一个重要特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。核本地化p65信号的核factor-κB (NF-κB)激活。研究进行评估是否NF-κB激活修改在痰液细胞在慢性阻塞性肺病急性加重。
方法:总和核p65免疫反应性的免疫细胞化学测定痰细胞11吸烟者与中度COPD恶化和6 - 8周后临床稳定。
结果:痰液细胞总数明显增加发作期间的值(差)880(510 - 1865)到1914.5 (1065 - 3205)×103/毫升(p < 0.05)。主要的炎性细胞在痰中性粒细胞(83.2(75.4 - -92.3)%)和巨噬细胞(14.7(2.6 - -21.6)%)和它们的相对比例并没有改变在急性加重。核染色p65在痰中性粒细胞缺乏,在急性加重和稳定阶段。相比之下,巨噬细胞表达核p65显著增加的百分比在发作期间的值(差)16 (7-24)% 41.4 (6 - 69)% (p < 0.05)。
结论:痰NF-κB似乎被激活巨噬细胞而不是在慢性阻塞性肺病加重病人的痰中性粒细胞
- p65
- 慢性阻塞性肺疾病
- 痰中性粒细胞
- 痰巨噬细胞
来自Altmetric.com的统计
加重是临床表现和自然历史的一个重要特征的慢性阻塞性肺疾病(COPD),1并与瞬态acute-upon-chronic增加气道炎症有关。2在稳定的慢性阻塞性肺病有浸润T淋巴细胞(CD4 + / CD8 +比值增加)、巨噬细胞和中性粒细胞进入气道,2与炎症介质的表达增加有关如细胞因子、趋化因子、黏附分子。3许多细胞因子的基因和蛋白质参与COPD气道炎症是由核factor-κB (NF-κB)。4NF-κB p65的异质二聚体和p50,如果细胞,细胞质本地化。激活后,NF-κB把进入细胞核,它绑定到特定κB元素靶基因的启动子。4核表达p65因此NF-κB激活的信号。4诱导痰被用来描述炎症细胞和介质参与COPD急性加重。5本研究的目的是评估NF-κB是否激活修改在慢性阻塞性肺病急性加重。
方法
主题
十一个吸烟者中度COPD恶化期间检查和6 - 8周后临床稳定(表1)。增加COPD恶化被定义为呼吸困难与痰液的质量和数量的变化导致的就医。1患者登记接受临床/功能评估和痰液收集在24小时内开始发作,之前他们在药物治疗有任何变化。他们没有哮喘或其他过敏性疾病的历史。有一个当前吸烟者和其他人都> 20包年人有吸烟史的人(意思是(SE) 60.5 (12.5))。病史和体检,肺功能测试,一次痰细胞分析临床表现在急性加重和稳定。胸片发作期间进行排除肺炎。所有患者仍然在他们的治疗研究的持续时间。急性加重和全身糖皮质激素治疗,当表示,抗生素。1
这项研究是大学医院的伦理委员会批准的费拉拉和所有病人给他们书面知情同意。
肺功能
肺功能测试(Biomedin肺活量计,帕多瓦,意大利)进行如前所述。6
肺组织处理
肺实质是来自七个男性吸烟者温和稳定的慢性阻塞性肺病(74岁(1)年;吸烟史35(5.6)包年;在1秒用力呼气量(FEV1l) 1.8(0.08)、用力肺活量(FVC) 2.97 (0.14) l;FEV1/ FVC 63.1(1.8))接受肺切除术对一个孤独的边缘癌。
两到四个随机选择的组织块(模板大小2×2.5厘米)被从叶的胸膜下薄壁组织获得手术,避免肿瘤相关的领域。样本甲醛固定在4%磷酸缓冲盐(PBS) pH值7.2,脱水后,嵌入到石蜡。面向组织标本和4μm厚串行部分均获得免疫组织化学分析。
痰收集和分析
吸入支气管扩张剂后痰收集和分析如前所述。6从下呼吸道痰栓被选为痰细胞计数。样本大小的细胞总数是标准化(ml)如前所述。6Cytospin幻灯片和干30分钟就做好了准备。幻灯片是包裹在铝箔和疣状之前储存在-20°C。平均每个病人的准备6张。
免疫细胞化学中p65痰细胞
痰与碱性磷酸酶进行免疫细胞化学(如前所述)做了一些调整。7Cytospins与periodate-lysine-paraformaldehyde固定(PLP, 10分钟),洗(15%蔗糖,20分钟,22°C),和细胞permeabilised nonidet-P40 / PBS (0.1%)。非特异性结合受阻(5%正常山羊血清,20分钟,22°C)与特定的兔子anti-p65孵化之前(美国sc - 372,圣克鲁斯生物技术;1:50稀释,1小时,22°C)和p65发现使用碱性磷酸酶(Vectastain ABC碱性磷酸酶试剂盒,向量实验室,伯林盖姆,CA,美国)和坚牢红底物根据制造商的指示。负控制幻灯片包含在每个染色为每个病人发作和稳定运行阶段。p65 +细胞被量化为胞质和/或由两个独立的观察员蒙蔽了核染色;400个细胞染色红色,指示p65免疫反应性的细胞,是指望每个幻灯片。intra-observer均值和方差inter-observer系数计算都不到10%。
Immunoperoxidase双染色CD68 / p65肺部分
deparaffinisation和补液暴露后免疫反应性的抗原表位CD68 p65,彩色的部分都沉浸在柠檬酸缓冲5毫米在微波炉的pH值6.0和孵化(NN模型S200W;在高功率松下、米兰、意大利)。内源性过氧化物酶活性被孵化的幻灯片3%过氧化氢在PBS洗在PBS紧随其后。细胞膜被添加0.1% permeabilised皂素PBS。血清非特异性标签被涂层与阻塞正常马血清(5%)在室温下20分钟。洗后在PBS部分孵化1小时在室温下用鼠标反CD68 (Dako)稀释160μg /毫升1:10 0的解决方案。
负控制幻灯片正常小鼠非特异性免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术)使用相同的蛋白质浓度主要抗体。经过反复洗涤步骤与PBS的部分被孵化anti-mouse生物素化的抗体(矢量ABC工具包,实验室)在室温下30分钟。经过进一步洗部分是孵化与ABC试剂(矢量ABC工具包,实验室)在室温下30分钟。幻灯片被孵化与chromogen-fast diaminobenzidine (DAB) 1 - 5分钟。血清非特异性标记再次被涂层与阻塞正常山羊血清(5%)在室温下20分钟。洗后在PBS部分孵化1小时在室温下与兔抗人类p65(圣克鲁斯生物技术)的稀释1:50 200μg /毫升的解决方案。
负控制幻灯片正常兔非特异性免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术)使用相同的蛋白质浓度主要抗体。经过反复洗涤步骤与PBS的部分被孵化anti-rabbit生物素化的抗体(矢量碱性磷酸酶工具包(实验室)在室温下30分钟,进一步洗涤后,部分被孵化与ABC试剂(矢量碱性磷酸酶工具包(实验室)在室温下30分钟。幻灯片是红10 - 20分钟,然后用发色体快速孵化后他们在苏木精复染色和安装在水介质。
统计分析
数据表示为意味着(SE)或中位数和四分位范围(差)。克鲁斯卡尔-沃利斯或者Mann-Whitney U组比较的测试。当表示Bonferroni调整的应用。
结果
痰液细胞总数明显增加发作期间的值(差)880 (510 - 1865)×1031914.5 /毫升(1065 - 3205)×103/毫升(p < 0.05)。主要的炎性细胞在痰中性粒细胞(83.2(差75.4 - -92.3)%)和巨噬细胞(14.7(2.6 - -21.6)%)和它们的相对比例没有显著变化在急性加重(86.7(78.1 - -96.4)%,12.4(3.1 - -17.6)%,分别p = NS)。吸入糖皮质激素治疗(n = 6)并不影响任何参数测量(数据未显示)。
大部分的痰液炎性细胞p65免疫反应性的,在急性加重和在稳定阶段(88 -93(81.1)%,87.7(71.5 - -88.7)%,分别p = NS;表2),核染色p65索引的激活,在痰中性粒细胞缺乏,在急性加重和稳定阶段(图1,表2)。相比之下,有核p65痰巨噬细胞的比例在稳定阶段(16(7-24)%),发作期间显著增加(41.4 (6 - 69)%,p < 0.05;图2,表2)。吸入糖皮质激素治疗并不影响p65核表达(数据未显示)。有核染色p65 CD68 +肺泡巨噬细胞在肺实质由双染色(图3)。
代表采用免疫染色p65 +细胞(红色)的微观领域丰富的嗜中性粒细胞痰cytospin样本稳定的慢性阻塞性肺病患者(a和C)和在恶化(B和D)在低(×400 a和B)和高(900×C和D)的放大。
代表采用免疫染色p65 +细胞(红色)的微观领域丰富的肺泡巨噬细胞在痰cytospin样本从一个稳定的慢性阻塞性肺病患者(a和C)和在恶化(B和D)在低(×400 a和B)和高(900×C和D)的放大。
代表从COPD患者肺实质的免疫组织化学染色双染色鉴定的彩色(棕色)和p65 CD68 +彩色(红色)细胞(a)低放大率(×400)和(B)高放大率(×900)。
讨论
NF-κB激活增加在痰从吸烟者肺泡巨噬细胞中度COPD急性加重,核本地化p65蛋白的增加。没有发现核p65在痰中性粒细胞从稳定的慢性阻塞性肺病患者或急性加重。虽然增加促炎介质的合成是非常依赖NF-κB激活之前已经报道过在慢性阻塞性肺病,2,3的角色NF-κB激活先前未被评估。我们推测,在慢性阻塞性肺病急性加重,触发因素如病毒和细菌感染可能会导致NF-κB激活,细胞因子和趋化因子的生产,进一步气道的炎性细胞浸润。2,3,5支气管活检标本的收集对象与慢性阻塞性肺病急性加重很难执行,很少被病人接受。的直接证据NF-κB参与支气管炎症在慢性阻塞性肺病加重病人的当前方法很难获得的。然而,使用唾液免疫细胞化学我们发现p65活化的肺泡巨噬细胞在慢性阻塞性肺病急性加重。核表达p65承认NF-κB激活的直接表达,虽然它不直接记录基因激活和蛋白质产量。4在这项研究中我们还展示了,第一次核本地化的p65 CD68 +肺泡巨噬细胞,证实的肺实质存在NF-κB激活巨噬细胞稳定的慢性阻塞性肺病患者。有趣的是,我们没有发现任何核本地化的p65痰中性粒细胞。没有核染色p65不太可能是由于失败的permeabilisation核膜的中性粒细胞正如我们所观察到的明显核染色痰中性粒细胞糖皮质激素受体的permeabilisation使用相同的条件。8我们的研究结果与最近的一份报告,在协议的核易位p65可以诱导支气管肺泡巨噬细胞和脂多糖刺激后。9有趣的是,革兰氏阴性细菌感染是慢性阻塞性肺病急性加重的被认为是一个可能的原因。10相比之下,核本地化p65从未被描述体内的嗜中性粒细胞。的核易位p65已被证明在体外刺激后外周血中性粒细胞与高剂量的促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α)和/或脂多糖。11显然,进一步的体内和体外研究是必要的阐明NF-κB通路的激活的差异在巨噬细胞和中性粒细胞在我们的研究中观察到。
在这个初步报告,我们发现的证据NF-κB激活在慢性阻塞性肺病加重病人的支气管炎症,尽管这是局限于肺泡巨噬细胞。这些发现表明,NF-κB参与痰巨噬细胞的激活,但不是中性粒细胞,在慢性阻塞性肺病急性加重。
确认
这项工作是支持由MURST格兰特(60%)、英国和意大利,葛兰素史克Associazione / la Ricerca e la看台戴尔'Asma (ARCA,帕多瓦,意大利)和阿斯利康,意大利。