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背景:以往的经验显示,吸烟者与电脑断层(CT)亚临床的证据肺气肿有中性粒细胞激活的迹象,尽管没有明显的增加,中性粒细胞的数量在支气管肺泡灌洗(BAL)流体。
方法:下列化学引诱物BAL流体的水平从61年基于社区的老年志愿者分为四组根据吸烟现状和肺气肿的存在与否是决定:白介素8(引发),上皮细胞中性粒细胞激活蛋白78 (ena - 78)和白三烯B4(LTB4),主要是中性粒细胞趋化现象的;单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和巨噬细胞炎性protein-1α(MIP-1α),主要是为单核白细胞趋化现象的。
结果:研究的五个化学引诱物,只有引发BAL流体的水平明显区分对象有或没有肺气肿吸烟者(中间值分别为34.7和12.2 pg / ml,, p < 0.01)。此外,引发和中性粒细胞elastase-α的水平1蛋白酶抑制剂在矿山复杂流体显著相关(r= 0.65,p < 0.01)。没有差别的释放引发培养肺泡巨噬细胞在24小时或引发信使RNA的表达两组肺泡巨噬细胞的吸烟者有或没有肺气肿。
结论:加速反应引发的慢性吸烟是一个因素,正是这些吸烟者易患肺气肿,虽然引发的细胞来源仍有待确定。
- 肺气肿
- interleukin-8
- 嗜中性粒细胞
- 吸烟
- 78年ena - 78,上皮细胞中性粒细胞激活蛋白
- FEV1,在1秒钟用力呼气量
- FVC、用力肺活量
- 引发,白介素8
- LTB4白三烯B4
- MCP-1,单核细胞化学引诱物蛋白1
- MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白1α
- NE-α1π,中性粒细胞elastase-α1蛋白酶抑制剂复杂
- Tlco、一氧化碳转移因子
- VC、肺活量
来自Altmetric.com的统计
- 78年ena - 78,上皮细胞中性粒细胞激活蛋白
- FEV1,在1秒钟用力呼气量
- FVC、用力肺活量
- 引发,白介素8
- LTB4白三烯B4
- MCP-1,单核细胞化学引诱物蛋白1
- MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白1α
- NE-α1π,中性粒细胞elastase-α1蛋白酶抑制剂复杂
- Tlco、一氧化碳转移因子
- VC、肺活量
肺气肿的病理生理学特点是proteinase-antiproteinase失衡,其次是渐进破坏的弹性蛋白和其他细胞外的组件。1吸烟是一个众所周知的外生引起肺气肿和被认为招募炎症细胞如中性粒细胞和巨噬细胞含有多种蛋白水解酶。然而,它仍然是不确定哪个单元主要导致肺气肿的发病机制还不明为什么只有一小部分吸烟者发展临床明显的肺气肿。
我们试图确定的因素区分受试者无症状但被诊断出患有肺气肿(亚临床肺气肿)高分辨率计算机断层扫描(HRCT)从年龄匹配控制类似的吸烟史没有任何肺气肿的迹象。我们发现中性粒细胞elastase-α水平1复杂(NE-α蛋白酶抑制剂1π)显著增加在支气管肺泡灌洗(BAL)流体的亚临床患者肺气肿,2和这个复杂的程度与elastin-derived肽呈正相关(EDP)落下帷幕。3我们还表明,中性粒细胞的数量的脱粒蛋白质如人类嗜中性粒细胞lipocalin (HNL),中性粒细胞胶原酶(MMP-8)和白明胶酶B (MMP-9)也明显高于球流体从这些科目。4虽然这些结果支持的参与中性粒细胞在肺气肿的早期发展,没有明显的增加,中性粒细胞的数量的流体与肺气肿的主题与吸烟相比控制没有肺气肿。令人惊奇的离解增加中性粒细胞积聚的标记和/或激活的中性粒细胞的数量平衡液的这些主题促使我们研究趋化信号在肺泡空间的作用。
我们第一次测量的水平三的中性粒细胞化学引诱物BAL fluid-interleukin 8(引发)5上皮细胞中性粒细胞激活蛋白78 (ena - 78),6和白三烯B4(LTB4)7——相比之下,单核细胞的水平化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和巨噬细胞炎性蛋白- 1α(MIP-1α),这两个主要是单核白细胞趋化现象的。5自引发发现区分当前吸烟者有或没有肺气肿,然后我们测试的假设肺泡巨噬细胞(AMs)是引发的来源之一,导致肺气肿的早期发展。
方法
研究人群
六十一基于社区的无症状的受试者招募从我们戒烟诊所、肺动脉以外诊所、社区和市政中心:16前吸烟者停止吸烟至少6个月(15人/一个女人,意味着(SE) 61(3)岁)和45吸烟者(40人/五位女性,意味着(SE) 53(2)岁)。获得知情同意后,他们第一次筛选肺气肿的HRCT扫描(川尚CT 9000单位,川尚;或西门子Somatom PLVS 40,西门子;或东芝TCT X-Vigor、东芝)。系列卧式片1 - 2毫米宽度得到从顶点每隔10毫米低于隔膜。HRCT扫描设定在一个窗口水平-700到-800 Hounsfield单位(胡)和宽度1000 - 1500年胡锦涛被三个评估肺内科医生,他们无视任何个人信息,对肺气肿的存在在所有系列水平切片。受试者认为肺气肿无论大小或严重性基于该协议的所有三个医生。所有的患者在常规药物治疗也有哮喘。没有感冒的症状,也没有采取任何药物治疗前2个月的研究。确认吸烟现状客观,42岁受试者进行呼出公司水平使用公司分析器(微Smokerlyser, Bedfont,肯特,英国),和19个受试者的血清可替宁含量也检查了。2HRCT扫描后,受试者接受肺功能测试和血液采样。消除non-eligible科目后,其余受试者分成四组根据吸烟现状和气性变化的存在。
伦理委员会批准的这项研究是北海道大学的医学院。
支气管肺泡灌洗(BAL)
吸烟者被要求避免吸烟至少12小时球过程消除吸烟的急性效应。如前所述执行顺序落下帷幕。2总之,四个独立50毫升整除的无菌0.9%生理盐水被灌输到右侧中部叶的肺通过楔形柔性fibreoptic支气管镜(奥林巴斯BF-B3R、东京、日本),然后轻轻地吸。返回的流体从第一个50毫升整除不习惯是因为流体从第一个整除含有细胞和物质主要来自大型航空公司而不是外围地区。其余灌洗液相结合和使用作为本研究的肺泡灌洗液丰富的一部分。
落下帷幕的处理液
恢复平衡液和细胞分析进行了为每个单独的如前所述。2细胞自由落下帷幕液集中Centriprep集中器(Amicon贝弗利,妈,美国)的分子量切断3 kD分析引发,MCP-1, MIP-1α。
文化的肺泡巨噬细胞
AMs被粘附到保利-孤立l赖氨酸涂塑料井(美国纽约康宁)为1小时37°C rpmi - 1640年媒介(美国纽约Gibco,大岛)包含100 U /毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升95%的空气和5%的公司在潮湿的气氛中2。non-adherent细胞后的两个磷酸缓冲盐(PBS)洗,其余细胞培养在含有抗生素rpmi - 1640额外的24小时如前所述。8
分析引发
引发的水平集中BAL液和培养基的AMs量化使用Quantikine引发酶联免疫分析法(ELISA)工具包(研发系统、MN、美国)根据协议提供的工具包。标准曲线得到提供的重组人类引发的系列稀释线性回归(最小检出限6 pg / ml)。引发的浓度在每个样本插值得到的吸光度的标准曲线,然后重复样本的平均值作为代表值。曲线的相关系数> 0.90提供的引发的标准。引发BAL液体的水平表示每毫升unconcentrated BAL流体通过调整每个BAL流体样本集中的程度。AMs的引发培养基的浓度调整为1×106巨噬细胞。
对ena - 78和LTB酶免疫分析法4
分析ena - 78 unconcentrated BAL流体进行与人类ena - 78免疫(研发系统)的检出限15 pg / ml。LTB分析4在使用LTB unconcentrated BAL流体进行了4酶免疫测定(EIA)工具包(英国Amersham生命科学)的检出限6 pg / ml;交叉反应性和LTC4有限公司4,LTE45-hydroxyeicosatetraenoic酸(5-HETE)、12-HETE 15-HETE不到0.04%。
NE-α1π量化
测量NE-α1π在unconcentrated BAL流体如前所报道。2
量化MCP-1 MIP-1α
定量分析MCP-1和MIP-1α集中BAL流体进行使用EIA试剂盒MCP-1 (Hycult生物技术、荷兰)和MIP-1α(研发系统)检测6 pg / ml的局限性和8 pg / ml,分别;没有交叉反应性与其他细胞因子由制造商进行测试。
定量rt - pcr引发
从AMs总RNA制备硫氰酸胍盐酚氯仿法使用RNA提取设备等基因(日本东京日本基因)。单链互补DNA(互补)PCR模板合成使用马勒尼小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(美国中心技术、麦迪逊、WI)。短暂,20μl反应混合物包含10个单位MMLV逆转录酶,酶缓冲区,250 ng总RNA, 20单位核糖核酸酶抑制剂(Toyobo,大阪,日本),10 pmol随机引物(豆类,京都,日本),和1毫米deoxynucleoside三磷酸(豆类)。反应混合物在37°C孵化为60分钟和冷冻冰。
5′基于核酸外切酶fluorogenic PCR进行使用ABI棱镜7700序列检测器(PE应用生物系统公司,福斯特城、钙、美国)。9寡核苷酸引发引物和探针量化系统是为了满足特定条件利用引物表达软件(PE应用生物系统公司)出版互补DNA序列(互补)人类引发的10如下:
意义:5′GCAGAGCACACAAGCTTCTAGGA3′
反义:5′CCAGCTTGGAAGTCATGTTTACAC3′
调查:5′CAGGAAGAAACCACCGGAAGGAACCA3′
的预计规模放大引发DNA的产品是90年英国石油公司和特异性扩增PCR产品的溴化乙锭染色证实了琼脂糖凝胶。探针标记了6-carboxy-fluorescein 5′末端和6-carboxy-tetramethyl罗丹明的3′末端(PE应用生物系统公司)。引物和glyceraldehyde-3-phosphatase-dehydrogenase标记探针(GAPDH)互补脱氧核糖核酸作为内生控制买来PE应用生物系统公司(TaqMan GAPDH控制试剂)。5μl整除的RT产品是放在每个管和PCR是在重复使用PCR试剂盒(TaqMan PCR核心试剂与AmpliTaq黄金装备,PE应用生物系统公司)根据制造商的建议(40周期;每个周期由一个15秒变性步骤在95°C和2分钟退火和延伸步骤在58°C)。引发和GAPDH分别进行了放大。使用这种方法,低浓度的准确检测目标信使rna干扰从内部控制荧光是可能的。9每个样本的阈值周期由默认的算法实时定量PCR系统软件(序列检测系统、PE应用生物系统公司)。反向转录cDNA AMs的从一个话题转连续稀释,用于标准曲线的生成,以确保定量rt - pcr的再现性。引发mRNA的相对数量的样品进行插值阈值周期从标准曲线,然后由GAPDH mRNA正常化。这个正常化值被用来比较样本。
统计分析
人口数据和炎性细胞在BAL液体正态分布和表达的意思(SE)值,统计分析是通过单因素方差分析(方差分析)和费舍尔的多个测试比较。作为化学引诱物数据不是正态分布,他们表示为中间值和绝对的范围。分析了非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验和Mann-Whitney U测试。斯皮尔曼等级相关的计算评估数据之间的相关性。在所有测试值< 0.05被认为是具有统计学意义。
结果
研究对象的特点
61年的受试者被分为四组根据他们的吸烟状况和肺气肿的存在与否。在HRCT扫描发现肺气肿发生在不到25%的肺的总面积在大多数受试者归类为肺气肿。临床特点及肺功能数据如表1所示。吸烟者明显比以前年轻吸烟者没有肺气肿。吸烟指数在前吸烟者没有肺气肿显著低于在其他科目三组。肺功能的数据显示,% VC, % FEV1,% Tlco在吸烟者和吸烟者前显著降低与肺气肿比前吸烟者没有肺气肿。在目前的吸烟者,% FEV1,FEV1/ FVC % Tlco略与肺气肿科目但显著低于那些没有肺气肿。
炎症细胞在BAL液体
肺部炎症细胞的轮廓BAL流体如表2所示。BAL流体的回收率低前吸烟者比现任和前任吸烟者没有肺气肿肺气肿。当吸烟者的两组,两组的前吸烟者,吸烟者有一个更高的细胞总数和AMs的数量高于前吸烟者的综合数据。然而,没有明显差异总数量的细胞,巨噬细胞、中性粒细胞吸烟者两组之间的分类存在与否的肺气肿。
引发BAL流体
引发15-21-fold集中BAL流体检测的所有54个科目测试。引发BAL流体的水平明显增加了吸烟者和肺气肿(中位数34.7 pg / ml;范围5.4 - -141.3)相比,吸烟者没有肺气肿(中位数12.2 pg / ml;范围2.0 - -62.7;p < 0.01)。后者的引发水平也显著低于前吸烟者没有肺气肿(中位数25.7 pg / ml;范围9.4 - -72.7;p < 0.05;图1)。引发的水平是显著相关的NE-α1PI BAL流体(n = 54,r= 0.65,p < 0.01;图2),虽然不是绝对数量(不存在相关性r= 0.18,NS)或(百分比r= 0.01,NS)的中性粒细胞BAL液体。
引发BAL流体的水平。吸烟者的水平显著增加肺气肿和前吸烟者没有肺气肿与吸烟者相比没有肺气肿。中间值显示为水平线。
引发和NE-α之间的关系1πBAL流体。每个点代表个人的数据样本。进行了相关性和斯皮尔曼等级相关测试。
ena - 78和LTB4在平衡液
ena - 78检测到53 unconcentrated BAL流体的学科测试,与四组之间无显著差异(图3),LTB4unconcentrated BAL液中检测到50的53个科目测试。低于检出限的值被认为是3 pg / ml unconcentrated BAL的液体后统计分析。前吸烟者的水平显著增加肺气肿(中位数12.4 pg / ml;范围6.0 - -29.1),但与肺气肿吸烟者(中位数9.1 pg / ml;范围3.0 - -31.7)与两个non-emphysematous组(前吸烟者:中位数7.1 pg / ml;范围3.0 - -9.3,吸烟者:中位数9.9 pg / ml;范围3.0 - -17.3;p < 0.05;图4)。与引发相比,没有明显差异ena - 78和LTB的水平4两组之间的吸烟者分类肺气肿的存在与否。
落下帷幕的ena - 78水平的液体。四组之间没有显著差异。中间值显示为水平线。
LTB水平4在落下帷幕。前吸烟者的水平显著增加肺气肿的价格相比前任和现任吸烟者没有肺气肿。中间值显示为水平线。
MCP-1和MIP-1αBAL液体
MCP-1检测所有33的集中BAL流体学科测试,和MIP-1α35集中BAL液中发现了41个科目。低于检出限的值被认为是4 pg / ml集中BAL的液体后统计分析。这些化学引诱物的水平四组之间没有显著差异(图5)。
MCP-1水平(A)和(B) MIP-1αBAL流体。四组之间没有显著差异。中间值显示为水平线。
引发从肺泡巨噬细胞释放
AMs的培养媒体24小时被稀释30倍引发的测量。吸烟者引发水平明显低于前吸烟者作为一个整体(中位数17.9 ng / ml(范围0.3 - -46.6)v58.4 ng / ml(范围12.6 - -80.8),p < 0.01)。没有水平的显著差异引发当前吸烟者的两组之间(图6)。
(A)水平引发肺泡巨噬细胞的培养中24小时。培养中从当前吸烟者的水平是低于前吸烟者作为一个整体(○=前吸烟者没有肺气肿(n = 2))。没有水平的差异引发当前吸烟者的两组之间。中间值显示为水平线。(B)引发mRNA水平肺泡巨噬细胞。数据被GAPDH mRNA的正常化。两组之间没有显著差异的吸烟者。中间值显示为水平线。
引发mRNA在肺泡巨噬细胞
引发mRNA水平AMs量化使用5′核酸酶fluorogenic rt - pcr。引发的大小mRNA表达纠正GAPDH成绩单没有根据差异的存在在当前吸烟者(图6 b)肺气肿。
讨论
在这项研究中我们首先证明引发BAL液可以与亚临床区分吸烟者肺气肿和年龄匹配的吸烟者没有肺气肿。此外,引发BAL流体的水平与NE-α密切相关1π。这样增加引发BAL流体的水平在这一组不相关的中性粒细胞数量的显著提升BAL流体与吸烟相比控制。的ena - 78水平BAL流体并不影响通过吸烟状态或肺气肿的存在。相比之下,LTB水平4在BAL流体与肺气肿前吸烟者明显高于在两组受试者没有肺气肿,不管吸烟状态。这些数据表明,虽然引发,ena - 78和LTB4都认为是主要为中性粒细胞趋化现象的,他们的行为在肺部有很大的不同。另一方面,MCP-1和MIP-1αBAL流体的水平,这两种行为主要集中在单核细胞/巨噬细胞,四组之间没有不同的分类由吸烟现状和肺气肿的存在与否。AMs的假设是引发的来源之一导致肺气肿的早期发展被发现不太可能因为自发释放引发在AMs的培养基和24小时引发mRNA的表达在AMs吸烟者的两组相似,没有肺气肿。
引发强有力的化学引诱物,需要招募和激活中性粒细胞。5保持其生物活性的重要pH值和抵抗轻微的变化比其他已知的化学引诱物蛋白水解降解。11因此,它可以延长的活动招募中性粒细胞炎症的网站。我们已经表明,吸烟者与亚临床肺气肿没有落下帷幕的中性粒细胞数量增加流体与吸烟者相比具有类似的吸烟史没有任何迹象的肺气肿基于HRCT扫描。然而,我们已经提供了证据肺中性粒细胞脱颗粒的这些对象,因为他们增加了中性粒细胞颗粒蛋白水平BAL NE-α等液体1π,HNL、MMP-8 MMP-9。尽管MMP-9的来源并不认为是中性粒细胞,我们先前的研究显示,一些分数MMP-9 BAL中发现流体与亚临床学科与HNL肺气肿形成一个复杂的,表明嗜中性粒细胞MMP-9的起源。4
几个以前的研究已经表明患者临床上明显的慢性阻塞性肺病(COPD),中性粒细胞炎症的航空公司,增加了水平引发诱导痰或落下帷幕。12日,13
另一方面,有争议是否引发肺部健康的吸烟者的水平增加13与否。14我们的研究人群不同于那些在此前的研究,因为我们分离对象与亚临床肺气肿明显健康的吸烟者的HRCT扫描。这些特征表明,受试者在肺气肿的早期阶段。我们因此推测,吸烟者水平增加引发先前的研究可能是那些发展中国家或后来发展为肺气肿。
ena - 78是首次发现的条件培养基刺激人类II型上皮细胞系A549,引发,属于C-X-C趋化因子总科。5在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)细胞因子都是同样的水平增加了BAL流体和中性粒细胞的数量有很好的相关性。15LTB4是花生四烯酸的脂氧合酶产品之一。7在慢性阻塞性肺病引发的水平和LTB4也增加痰和与中性粒细胞弹性蛋白酶活性有正相关性。16ena - 78和LTB像引发4是中性粒细胞的强有力的化学引诱物以及活化剂。一般来说,所有这三个化学引诱物被发现在炎症条件下高浓度,中性粒细胞被认为是深度参与。然而,他们不同的模式表达外源性刺激体外,尽管他们生产和释放的单核细胞和巨噬细胞。17日,18在这项研究中,我们已经表明,这些化学引诱物可能扮演不同的角色,至少在肺气肿的早期发展阶段。
分离的可能的解释之间的中性粒细胞的数量和NE-α水平1π或引发BAL液体可能被落下帷幕,中性粒细胞收获不一定反映肺中性粒细胞的总数。中性粒细胞不仅在空中空间还呆在间质或肺微血管。此外,一些中性粒细胞可以牢牢地附着到航空公司,不洗肺。另一种解释是,引发更积极的中性粒细胞释放,这占NE-α的相关性1π。最后,引发不存在导致显著的嗜中性粒细胞招募足够的数量,但激活中性粒细胞与亚临床学科肺气肿。假设循环激活中性粒细胞与COPD的发病机制是首次提出,伯内特和其他人。19
值得注意的是,没有明显差异的水平MCP-1或MIP-1αBAL流体四组的学科,虽然AMs的数量是增加吸烟者的两组类似程度的前吸烟者组。早些时候的一项研究表明,BAL流体的吸烟者能力吸引血液单核细胞显著增高,chemokinetic活动的数量与AMs BAL液体。然而,这项研究的作者没有确定任何特定的化学引诱物。20.我们因此推测,还有其他化学引诱物比MCP-1或MIP-1α可能占的AMs BAL的增加流体从当前吸烟者。另一方面,少数为MCP-1最近的研究表明一个重要的角色21和/或MIP-1α22巨噬细胞的积累在COPD患者的肺。然而,目前的研究并不支持这个想法,这些化学引诱物可能因素,区分与肺气肿吸烟者和那些没有肺气肿,至少在疾病的早期阶段。
肺气肿的受试者中没有炎症化学引诱物BAL流体的水平之间的关系和肺气肿的程度在CT扫描或他们的肺功能。然而,应该注意的是,临床上明显的肺气肿患者不包括在我们的研究中,几乎所有的受试者分为有肺气肿衰减较低的地区包括小于总面积的25%,如果有的话,在CT扫描。因此,很难讨论疾病严重程度之间的关系和炎症化学引诱物测量的水平。一个可能的解释为变量水平的引发和其他蛋白质在肺气肿的主题是异质性的气性个人肺的早期阶段的变化。中部叶的液体灌洗肺不一定反映现象的肺气肿。
引发的水平提高与亚临床肺气肿BAL流体从吸烟者,我们预期,引发的释放AMs会加速这些主题,特发性肺纤维化患者一样。23我们无法属性的增加引发水平BAL AMs流体;既不释放引发从培养AMs 24小时也引发mRNA的表达AMs的增加在这些学科与吸烟相比控制。然而,我们应该小心解释这些负面结果。因为巨噬细胞体外研究文化,任何刺激代理可以应对巨噬细胞在病人现在不在,可能也占了一个负面的结果。此外,引发从AMs的释放抑制与前相比,吸烟者吸烟时受试者,不管肺气肿的存在。类似的抑制慢性吸烟AMs化学引诱物的生产已被证明在体外和体内LTB4,TNF-α等等。24日,25
众所周知,引发生产和发布的各种细胞在肺部,包括中性粒细胞、T淋巴细胞,成纤维细胞和上皮细胞。5气道上皮细胞被认为是一个特别这化学引诱物的重要来源。26最近的一项研究证明了免疫组织化学和原位杂交,引发细支气管和肺泡上皮细胞更强烈的积极与慢性阻塞性肺病吸烟者比吸烟者没有慢性阻塞性肺病。21此外,据报道,吸烟提高引发释放支气管上皮细胞。27结合现有的数据,人们很容易推测,主体间的变化引发对香烟烟雾的支气管或肺泡上皮细胞是肺气肿的早期发展的决定因素。
最后,有可能是炎症的模式在COPD患者的肺可能有所不同根据表现型和/或疾病的临床阶段。众多研究存在,强调角色的巨噬细胞,肥大细胞、CD8 +淋巴细胞和嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病的开发和发展。28日,29日我们之前的研究也提出了一个不同的中性粒细胞弹性蛋白酶的贡献和组织蛋白酶L亚临床肺气肿的发展在不同年龄段的人群。30.因此我们觉得中性粒细胞激活的特定角色的重要性,引发我们的一系列研究发现可能是真的只有在肺气肿的早期阶段。
总之,我们已经表明,引发的水平,但不是ena - 78或LTB4与亚临床BAL流体从当前吸烟者肺气肿是显著增加与年龄匹配的吸烟者相比没有肺气肿。结合我们以前的研究发现增加中性粒细胞颗粒蛋白的数量在BAL流体与亚临床学科肺气肿,这些数据表明,引发可能的一个关键因素,区分从那些不吸烟者发展肺气肿,至少在疾病的早期阶段。因为AMs是不可能引发的来源为亚临床肺气肿在这项研究中,进一步的研究应该集中在气道上皮的主体间变异函数作为一个可能的候选人对吸烟引起的肺癌的破坏。
确认
作者感谢Yoshikazu Kawakami博士(甲南医院、札幌、日本)博士对他的建设性意见和Natsuko Kitashiro (Nanae医院、Nanae、日本)她的建议关于rt - pcr技术。
引用
脚注
没有研究的一部分,由烟草行业资源。