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吸烟
原文
促炎烟蒸汽冷凝水对人体肺泡巨噬细胞的影响
  1. 亚伦•斯科特1,
  2. 塞巴斯蒂安T Lugg1,
  3. Kerrie奥尔德里奇1,
  4. Keir E刘易斯2,
  5. 艾伦·鲍登3,
  6. 拉胡尔Y Mahida1,
  7. 弗朗西斯苏珊娜Grudzinska1,
  8. 代表Dosanjh1,
  9. Dhruv帕尔克1,
  10. 罗伯特Foronjy4,
  11. 伊丽莎白Sapey1,
  12. 先生Naidu1,
  13. David R Thickett1
  1. 1伯明翰急症护理研究小组炎症和老化研究所(花絮),伯明翰大学,伯明翰、英国
  2. 2医学院的,斯旺西大学,斯旺西、英国
  3. 3分析设备,化学学院,伯明翰大学,伯明翰、英国
  4. 4肺和危重病医学,医学部门,纽约州立大学州南部医学中心,布鲁克林,纽约美国
  1. 对应到David R Thickett,炎症和老化研究所的伯明翰大学伯明翰去往B15二十、英国;d.thickett在{}bham.ac.uk

文摘

客观的vap可能增加烟液的细胞毒性效应(ECL)。我们比较的影响unvaped ECL烟蒸气冷凝(ECVC)肺泡巨噬细胞(AM)功能。

方法AMs ECVC和治疗尼古丁自由ECVC (nfECVC)。可行性,凋亡、坏死细胞因子、趋化因子、蛋白酶释放活性氧(ROS)释放和细菌吞噬作用进行了评估。

结果巨噬细胞培养与发射极耦合逻辑或ECVC导致剂量依赖性降低细胞生存能力。ECVC比ECL细胞毒性较低的浓度,导致增加细胞凋亡和坏死。nfECVC导致更少的细胞毒性和细胞凋亡。AMs的曝光剂量0.5% ECVC / nfECVC ROS增加生产大约50倍,显著地抑制吞噬作用。锅和类一个同种型磷酸肌醇3激酶抑制剂部分抑制ECVC / nfECVC巨噬细胞生存能力的影响和细胞凋亡。肿瘤坏死因子α的分泌白介素6日,CXCL-8,单核细胞化学引诱物蛋白1和基质金属蛋白酶9 ECVC后显著增加的挑战。治疗与抗氧化剂N-acetyl-cysteine (NAC)的细胞毒性效应改善ECVC / nfECVC从基线水平没有明显不同,恢复吞噬功能。

结论ECVC比non-vaped更有毒AMs发射极耦合逻辑。过多的活性氧的生产,包括烟蒸汽可能引起的炎症细胞因子和趋化因子诱导肺内炎症在AMs部分依赖尼古丁。抑制吞噬还建议用户可能遭受细菌清除受损。虽然还需要进一步研究,以完全理解的影响包括烟暴露在人类体内,我们告诫人们普遍认为电子烟是安全的。

  • 呼吸道感染
  • 氧化应激
  • 巨噬细胞生物学

这是一个开放的分布式条188滚球软件依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和许可他们的衍生产品在不同的协议,提供了最初的工作是正确地引用,给出合适的信用,任何更改表示,非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

http://dx.doi.org/10.1136/thoraxjnl - 2018 - 211663

来自Altmetric.com的统计

    关键信息

    关键问题是什么?

    • 做电子烟对肺泡巨噬细胞生存能力和功能有负面影响吗?

    底线是什么?

    • Vapourised烟液的细胞毒性,促炎症,抑制肺泡巨噬细胞的吞噬作用。

    为什么要读吗?

    • 这项工作表明尼古丁依赖和独立的效果,也检查这些影响可能会被废除。

    介绍

    电子香烟,也被称为电子尼古丁交付系统(结束),介绍了自2010年以来在十年前和烟的吸入蒸汽或vap的上升指数在吸烟者和戒烟。1有明显的出版物在结束/电子烟,尽管不同的意见主要作用仍有争议。他们可能是一个有用的工具减少传统吸烟但对许多他们只是替代尼古丁交付方法。因此他们可能引发一个新的公共卫生问题。2公众的感觉是,他们不是比传统吸烟危害健康,然而,电子烟的长期影响仍有待阐明。2

    电子烟在过去十年里取得了显著进展,增加的复杂性和能力。他们现在被认为是第四代,包括修改设备能够调节能量输入用于产生蒸汽。使用更多的能量输入,sub-ohm电子烟雾化器抗性和自定义混合物液体(ECL),用户接触的影响正变得越来越不确定的和潜在的健康危害。3 4

    vap之前,它是由蔬菜甘油等湿润(VG)和丙二醇(PG)有或没有尼古丁。几个潜在的细胞毒性金属和硅酸盐粒子存在于烟蒸汽等于或超过传统香烟烟雾中的水平。5个6当前的文献主要集中在影响non-vapourised发射极耦合逻辑或ECL冷凝。然而,这样的研究并不完全反映了对烟用户潜在的影响,重要的是,vap的过程本身原因ECL的化学成分的变化。7 - 11最近,一些研究试图更生理的方法使用水提物系统类似于用于创建传统香烟烟雾提取物(CSE),12虽然这也会造成相当大的稀释。体内研究也进行了使用整个动物气溶胶暴露系统,没有vap,也主要集中在对肺部的影响。13日14这些研究表明暴露于unvaped液体分泌的炎症标记物增加,诱导气道慢性接触hyper-reactivity和肺组织引起的退化。13日14这些研究表明由于电子烟液接触的潜在负面影响,然而,证明成分变化引起的vap过程在这些模型没有考虑。

    在这项研究中,我们开发了一个新的系统来生成烟蒸汽冷凝(ECVC)是一个更生理接触的方法。我们提出化学成分的变化引起的vap会增加细胞毒性,而且尼古丁的存在将加剧任何细胞毒性和促炎效应。肺泡巨噬细胞(AMs)是一个独特的肺细胞群,消除机载刺激物和传染性病原体,同时协调解决肺部炎症的起始。15

    干扰是函数中可以增加感染的风险,提高对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的易感性。我们也评估的影响ECVC有或没有尼古丁对人体AMs来确定这是一个关键组成部分,确定抗氧化剂废除的任何影响。

    方法

    详细的方法在网上提供补充。

    补充文件1

    ECVC准备

    ECVC准备使用一个新方法采用六气管吸入陷阱(Unomedical、丹麦)连接在系列和冷却在干冰/甲醇浴(见在线补充图E1a)。我们计算最优吹3每30年代期间基于公布的数据。月16日这允许每个膨胀之间的蒸汽凝结和防止设备过热;1.4毫升的ECL /尼古丁自由发射极耦合逻辑(nfECL)从每个设备vap。收购完成后,吸入陷阱被正常室温和旋转的1500克10分钟收集冷凝。

    补充文件2

    由于电子烟设备

    我们选择第二代,流行于英国,产生冷凝水(康有限公司、深圳、中国;在网上看到的补充图E1b)。设备都配备了一个标准650毫安时电池新鲜1.8欧姆线圈头(雾化器)为每一个准备。

    由于电子烟液体

    宴请有或没有医药级尼古丁从美国获得E-liquids商店(Wauwatosa密尔沃基县研究公园WI,美国),这符合美国食品和药物管理局(FDA)批准的良好生产标准和已经使用以往的动物接触的研究。13为了避免混杂因素,只有无味的液体。尼古丁包含ECL是36毫克/毫升,nfECL只是PG的混合物:VG。

    肺泡和THP-1巨噬细胞

    AMs八从不吸烟者,五个男人和三个女人,正常的肺量测定法和没有哮喘或慢性阻塞性肺病的历史重复获得的生理盐水灌洗未受感染的肺切除标本(见在线补充完整的提取方法)。

    THP-1人类单核细胞的白血病细胞(欧洲收集细胞培养)分化成巨噬细胞通过刺激0.2毫米佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) 24小时。坚持在RPMI细胞休息3天前使用。22

    尼古丁含量的气体chromatography-flame电离检测器评估

    气体chromatography-flame电离检测器(GC-FID)评估是由伯明翰大学的化学系确定尼古丁浓度。L-Nicotine标准(# 10337220费舍尔科学、英国)被用来量化的参考标准。

    细胞的方法

    可行性评估使用CellTiter 96水一个解决方案(罗氏公司、英国)。凋亡的评估是通过流式细胞术使用膜联蛋白V化验(BD生物科学、英国)结合至关重要的染料propidium碘(PI)(英国Sigma-Aldrich)。CXCL-8,白介素6 (IL)单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1、肿瘤坏死因子(TNF) -α和基质金属蛋白酶9 (MMP)水平在上层清液游离量化使用商用ELISA试剂盒(英国Biotechne)。活性氧(ROS)测量使用DCFDA化验(Abcam ab113851)根据制造商的指示。使用pHrodo红色吞噬作用进行了分析大肠杆菌或金黄色葡萄球菌BioParticles(英国英杰公司)根据制造商的指示。

    统计分析

    统计分析使用GraphPad PRISM 6.0软件包(美国加州圣地亚哥)。结果表示为中值差,除非另有指定。所有代表至少八个独立的实验结果在重复执行。多种治疗方法之间的差异比较克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较测试后修正。一个假定值≤0.05被认为代表了一个统计上的显著差异。

    结果

    Inter-batch可变性unvaped发射极耦合逻辑

    在这项研究中使用的所有冷凝物生成的两批发射极耦合逻辑。GC-FID数据(表1)建议实际ECL的尼古丁含量31.0毫克/毫升和30.7毫克/毫升批分别为1和2。没有发现尼古丁尼古丁自由液体。

    把这个表:
    表1

    Inter-batch方差。(A) Inter-batch差异宴请来自美国e-liquids商店被GC-FID评估来确定尼古丁含量。(B) Inter-batch差异评估了凝析油的准备测量的物理特性,包括体积恢复、尼古丁复苏,光密度和细胞毒性可能与每个冷凝后24小时的挑战。准备1 - 3从发射极耦合逻辑生产批1,准备4 - 6生产从发射极耦合逻辑批2

    把这个表:

    验证我们的模型系统的冷凝vap发射极耦合逻辑

    详细的验证我们的模型的冷凝vap发射极耦合逻辑可以在网上补充(在线补充图E2)。该模型系统被证明是可靠的和可再生的复苏的体积(60.8%),尼古丁含量(87%),以及微粒(OD在370海里,表1 b)。在生物活性之间没有显著差异新鲜制备(在线补充图E2),然而随着时间的推移失去生物活性在−80°C(在线存储补充图E3,P < 0.0001)。

    ECVC明显更多的细胞毒性比发射极耦合逻辑

    AMs被暴露于ECL ECVC 24小时,并制作了一个dos——减少依赖生存能力(图1)。Unvaped ECL / nfECL影响生存能力之间存在着显著的差异与未经处理的控制(UTC) 2.5% (v / v)的挑战(后图1 a, B):ECL: 78.8%可行(IQR 72.3% - -87.6%, P < 0.001), nfECL: 84.6%可行(IQR 83.9% - -87.9%, P < 0.001)。与之相反ECVC / nfECVC产生更大的生存能力下降0.8% (v / v)的挑战(图1 c, D):ECVC: 18.2%可行(IQR 15.7% - -19.5%, P < 0.001), nfECVC 62.8%可行(IQR 49.9% - -68.1%与UTC相比P < 0.0001)。AMs保持更好的生存能力(nfECL / nfECVC)尼古丁自由挑战,比含尼古丁(图1 a / C和B / D),这表明尽管vap显著增加ECL细胞毒性的潜力,大部分的细胞毒性效应是尼古丁的依赖。

    Effect of e-cigarette vapour condensate (ECVC) and -cigarette liquid (ECL) on alveolar macrophage viability. Viability was assessed by 4 hour incubation with cell titre aqueous assay following 24 hour exposure to a range of doses with (A) ECL, (B) nicotine-free ECL (nfECL), (C) ECVC, (D) nicotine-free ECVC (nfECVC). Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    影响缴获蒸汽冷凝液体(ECVC)和香烟(ECL)肺泡巨噬细胞的生存能力。可行性的评估是通过与细胞4小时孵化滴定度水化验后24小时接触一系列的剂量与发射极耦合逻辑(一),(B)尼古丁自由发射极耦合逻辑(nfECL), (C) ECVC, (D)尼古丁自由ECVC (nfECVC)。图形作为中位数与差八个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

    ECVC诱发细胞凋亡和坏死和被夸大了的尼古丁

    AMs受到0.8% ECVC / nfECVC 24小时并与UTC。24小时后的大多数细胞仍然是可行的;值:92.5%(差91.5%—-96.9%,(膜联蛋白- /π),细胞凋亡水平较低(膜联蛋白+细胞):6.17%(差2.63%—-7.77%),和坏死(膜联蛋白- / Pi +): 1.9%(差1.7%—-4.4%)(图2)。

    Effect of e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free ECVC (nfECVC) on alveolar macrophage (AM) apoptosis and necrosis. Induction of apoptosis and necrosis in AM following a 24 hour exposure to 0.8% ECVC/nfECVC. Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. UTC, untreated control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    影响缴获蒸汽冷凝(ECVC) /尼古丁自由ECVC (nfECVC)肺泡巨噬细胞(AM)细胞凋亡和坏死。诱导后的细胞凋亡和坏死是ECVC / nfECVC 24小时暴露于0.8%。图形作为中位数与差八个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。UTC,未经处理的控制。

    24小时后,总可行的细胞明显减少,当处理ECVC(40.87%活着,差39.29% - -45.61%,P < 0.0001)或nfECVC(77.94%活着,差73.09% - -78.69%,P < 0.01)而UTC。

    ECVC暴露显著增加细胞凋亡(37.7%,差22.7%—-54.9%,P < 0.0001)和坏死(16.3%,差12.1%—-31.2%,P < 0.001)与控制。接触nfECVC也增加了细胞凋亡显著(17.36,差13.28% - -19.4%,P < 0.05),但不是坏死(9.27%,差8.3% -11.3%)

    ECVC治疗诱导细胞凋亡明显多于nfECVC(17.4%,差13.3%—-19.4%,P < 0.0001),导致更大的全损可行的细胞治疗24小时后(P < 0.0001)。这些数据证实ECVC和支持一个尼古丁依赖的细胞毒性效应和nicotine-independent效果。

    ECVC对巨噬细胞功能的影响

    剂量的影响ECVC暴露评估使用措施巨噬细胞功能的重要的先天免疫反应,即活性氧生产、细胞因子、趋化因子和蛋白酶释放,以及细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)吞噬作用。

    ROS是ECVC治疗引起的

    AMs ROS生产评估后接触sub-cytotoxic剂量(0.5%)的ECVC / nfECVC 4小时。未经处理的巨噬细胞显示低基线水平的ROS生产(图3)(-1133年1085年,差863.7相对荧光单位(RFUs))。冷凝的挑战导致ROS增加50倍生产ECVC(53 858,差48 375 - 56 425 RFU, P < 0.0001)和nfECVC(48 746,差44 238 - 56 063 RFU,与UTC相比P < 0.0001)。

    Functional effects of e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free ECVC (nfECVC) exposure to alveloar macrophages (AMs) on reactive oxygen species (ROS). AMs were exposed to 0.5% ECVC/nfECVC for 4 hours. Following this, production of ROS was assessed by DCFDA assay. Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    功能的影响包括烟蒸汽冷凝液(ECVC) /尼古丁自由ECVC (nfECVC)接触alveloar巨噬细胞(AMs)活性氧(ROS)。AMs暴露于0.5% ECVC / nfECVC 4小时。这之后,活性氧的生产被DCFDA试验评估。图形作为中位数与差八个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

    促炎细胞因子,趋化因子和蛋白酶诱导ECVC 24小时暴露于0.5%

    影响促炎细胞因子、趋化因子和metalloprotease生产所示图4。0.5% ECVC显著诱导生产所有分析物:il - 6 (P < 000.1), TNF-α(P < 0.001), CXCL8 (P < 0.0001), MCP-1 (P < 0.01)和矩阵metalloprotease 9 (MMP-9)与UTC相比(P < 0.0001)。nfECVC的响应变量,il - 6增加较低(P < 0.001), CXCL-8 (P < 0.0001)和MMP-9相比UTC (P < 0.0001)。非重大的变化对TNF-α和MCP-1也见过。

    Functional effects of e-cigarette vapour conensate (ECVC)/nicotine-free ECVC (nfECVC) exposure to alveolar macrophages (AMs). Production of inflammatory cytokines (A, B), chemokines (C, D) and (E) matrix metalloproteinase (MMP-9). AMs following 24 hour exposure to ECVC (0.5%) as assessed by ELISA. Data are presented as pg/106 live cells at the end of the experiment to account for cell loss. n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    功能的影响包括烟蒸汽conensate (ECVC) /尼古丁自由ECVC (nfECVC)暴露在肺泡巨噬细胞(AMs)。炎性细胞因子的生产(A, B)趋化因子(C, D)和(E)基质金属蛋白酶(MMP-9)。AMs后24小时接触ECVC评估ELISA (0.5%)。数据提出了pg / 106年底活细胞实验占细胞损失。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

    ECVC显著抑制由我和THP-1巨噬细胞吞噬作用

    孵化的AMs和ECVC nfECVC pHrodo减少大肠杆菌BioParticle吞噬作用分别为30% (P < 0.0001)和50.2% (P < 0.0001,图5一个)。

    Functional effects of e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free ECVC (nfECVC) exposure to (A) alveolar macrophage (AM) and (B) THP-1 macrophage phagocytosis. Cells were exposed to 0.5% ECVC/nfECVC for 6 hours, following which uptake of pHrodo bioparticles was assessed. Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. UTC, untreated control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    功能的影响包括烟蒸汽冷凝液(ECVC) /尼古丁自由ECVC (nfECVC)接触(A)肺泡巨噬细胞(AM)和(B) THP-1巨噬细胞吞噬作用。细胞暴露于0.5% ECVC / nfECVC 6小时,之后的吸收pHrodo bioparticles评估。图形作为中位数与差八个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。UTC,未经处理的控制。

    孵化的THP-1巨噬细胞和ECVC nfECVC pHrodo减少大肠杆菌BioParticle吞噬作用分别为41.7% (P < 0.0001)和48.5% (P < 0.0001,图5 b)。

    孵化的THP-1巨噬细胞和ECVC nfECVC pHrodo减少金黄色葡萄球菌BioParticles吞噬作用分别为60.9% (P < 0.0001)和62.9% (P < 0.0001,在线补充图E4)。

    n -乙酰半胱氨酸治疗ECVC挑战后的效果

    ROS生产应对吸烟(或烟雾提取物)在内的中介的不利影响,23因此我们研究了n -乙酰半胱氨酸(NAC)的可能的效用治疗减少在THP-1 ECVC巨噬细胞的有害影响。我和THP-1巨噬细胞被用于这些实验由于大量的实验条件和所需数量的细胞。

    NAC可以改善衍生THP-1 ECVC巨噬细胞的细胞毒性效应

    类似于我们的观察在AMs, ECVC和nfECVC细胞毒性THP-1-derived巨噬细胞(24.4%,差21.8%—-27.4%,P < 0.0001;62.8%,差54.4%—-68.4%,(分别P < 0.0001。1毫米NAC治疗与冷凝挑战同时给阻止了对生存的影响ECVC和nfECVC与UTC (图6)。

    Effect of antioxidant treatment on macrophages. (A) Viability following 24 hour exposure to e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free vapour condensate (nfECVC) in the presence or absence of N-acetyl cysteine (NAC). Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. (B) Apoptosis following 24 hour exposure to ECVC/nfECVC, in the presence or absence of NAC. Graphs presented as median with IQR of six  independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. UTC, untreated control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    抗氧化治疗对巨噬细胞的影响。(A)可行性后24小时暴露在烟蒸汽冷凝液(ECVC) /尼古丁自由蒸汽冷凝(nfECVC) n -乙酰半胱氨酸(NAC)的存在与否。图形作为中位数与差八个独立的实验。(B)细胞凋亡后24小时接触ECVC / nfECVC,南汽的存在与否。图表呈现与差值六个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。UTC,未经处理的控制。

    NAC可以改善pro-apoptotic ECVC对THP-1-derived巨噬细胞的影响

    ECVC挑战THP-1巨噬细胞凋亡增加到36.1% (IQR 35.8% - -39.8%, P < 0.0001,图5 b)。接触nfECVC增加细胞凋亡程度较轻(18.8%,差13.8%—-20.2%,P < 0.0001,图6 b)。NAC治疗显著降低细胞凋亡与冷凝同时挑战ECVC(5.9%,差4.6%—-7.4%,P < 0.0001)和nfECVC(4.5%,差2.4%—-4.6%,P < 0.0001)挑战细胞(图5 b)。

    NAC可以恢复ECVC-treated巨噬细胞的吞噬功能

    孵化的AMs和ECVC nfECVC pHrodo减少大肠杆菌BioParticle吞噬作用(图6)。NAC(1毫米)同时ECVC / nfECVC恢复吞噬功能(P < 0.001),虽然不是预处理水平(图7)。

    Functional effects of e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free vapour condensate (nfECVC) phagocytosis. (A) Alveolar macrophages (AMs) exposed to 0.5% ECVC/nfECVC for 6 hours in the presence or absence of 1 mM NAC treatment, following which uptake of pHrodo bioparticles was assessed. (B) THP-1 macrophages were exposed to 0.5% ECVC/nfECVC for 6 hours, in the presence or absence of 5 mM NAC treatment, following which uptake of pHrodo bioparticles was assessed. Graphs presented as median with IQR of eight independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. UTC, untreated control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    功能的影响包括烟蒸汽冷凝液(ECVC) /尼古丁自由蒸汽冷凝(nfECVC)吞噬作用。(A)肺泡巨噬细胞(AMs)暴露于0.5% ECVC / nfECVC 6小时1毫米的存在与否NAC治疗,后吸收的pHrodo bioparticles评估。(B) THP-1巨噬细胞暴露于0.5% ECVC / nfECVC 6小时,在5毫米的存在与否NAC治疗,后吸收的pHrodo bioparticles评估。图形作为中位数与差八个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。UTC,未经处理的控制。

    使用THP-1巨噬细胞,增加剂量的NAC治疗评估来决定是否可以获得更大的保护作用。ECVC治疗的吞噬作用大肠杆菌pHrodo BioParticles 41.9% (图6 b,P < 0.0001)和nfECVC 48.4% (图7 b,P < 0.0001)。同步NAC治疗(5毫米)吞噬功能恢复水平与控制(图6 b,P < 0.0001)。高剂量的NAC对细胞功能恢复影响更大。

    吞噬作用的金黄色葡萄球菌pHrodo bioparticles也显著恢复,同时NAC治疗。(在线补充图E4)

    THP-1 ECVC影响巨噬细胞生存和凋亡是减毒phosphopinositol 3激酶的抑制剂

    ROS-induced肺部炎症慢性阻塞性肺病的报道与phosphopinositol 3激酶(PI3K)激活。24探讨PI3K的角色ECVC-induced反应我们使用了pan -抑制剂LY294002 (5 nM)以及一个同种型选择性抑制剂(PIK75 10海里)。

    通用PI3K抑制(在线补充图E5a)和PI3Kα同种型抑制剂(pik - 75,图8)减毒ECVC的影响(Ly294002;37.4%,PIK75;增加35%的可行性与ECVC相比,P < 0.0001)。这种保护作用也明显当细胞被质疑nfECVC (Ly294002 25%, PIK75可行性与nfECVC相比增长29.2%,P < 0.0001)。PI3K抑制也显示(在线部分恢复吞噬能力补充图E6),与sub-cytotoxic水平的挑战后ECVC (Ly294002;21.3%,PIK75;仅23.2%恢复而ECVC, P < 0.005)和nfECVC (Ly294002;25.8%,PIK75;仅20.9% nfECVC, P < 0.005)。

    Effect of e-cigarette vapour condensate (ECVC)/nicotine-free ECVC (nfECVC) and phosphopinositol 3 kinase (PI3K) inhibitor PIK-75 on alveolar macrophage viability. Viability was assessed by 4 hour incubation with cell titre aqueous assay following 24 hour exposure to class one specific PI3K inhibitor PIK-75 and challenged with ECVC or nfECVC (0.8%). Graphs presented as median with IQR of six independent experiments. The central horizontal line on each box plot represents the median, the upper and lower horizontal lines represent the first (Q1) and third (Q3) quartiles, respectively, and the vertical lines represent the range of values within the limits Q1–1.5 (Q3–Q1) and Q3–1.5 (Q3–Q1). n=8, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. UTC, untreated control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    影响缴获蒸汽冷凝(ECVC) /尼古丁自由ECVC (nfECVC)和phosphopinositol 3激酶(PI3K)抑制剂实物券- 75对肺泡巨噬细胞生存能力。可行性的评估是通过与细胞4小时孵化滴定度水化验后24小时接触类的一个特定的PI3K抑制剂用ECVC或nfECVC偿还pik - 75和挑战(0.8%)。图表呈现与差值六个独立的实验。中央水平线在每箱线图表示中位数,上下水平线代表第一(Q1)和第三(Q3)四分位数,分别和垂直线代表的范围值范围内Q1 - 1.5 (Q3-Q1)和第三季度- 1.5 (Q3-Q1)。n = 8 * * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。UTC,未经处理的控制。

    讨论

    我们已经验证了一个简单、廉价和有效的系统冷凝vap ECL蒸汽,使体外工作。这是第一个研究报告人类应对ECVC和展示了细胞毒性存在剂量依赖的相关性,诱导细胞凋亡与尼古丁的依赖和独立反应的vap过程强调了。sub-cytotoxic剂量,ECVC提高活性氧的生产,炎性细胞因子,趋化因子和金属蛋白酶,尽管与nfECVC响应不明显。细菌通过巨噬细胞吞噬作用是抑制强烈ECVC和抗氧化剂NAC效应减弱,表明活性氧和活性醛参与ECVC / nfECVC的影响。这些影响似乎部分PI3K的依赖。

    我们已经证实vap夸大了ECL细胞毒性的影响,诱导细胞凋亡和坏死。这些影响被AMs ECVC和nfECVC处理时,表明尼古丁依赖和独立的机制。

    几项研究已经检查烟蒸汽组成的变化,2 3 7 - 11和已经确定了很多不同的可能是有毒的化学物质,包括自由基、微粒、甲醛、亚硝胺、挥发性有机化合物和多环芳烃。3 8重要的是,这些毒物的几个水平已报告增加vapourisation后,由于热量和/或在电子烟电池产生的电压。2 3 7 - 11许多变量影响蒸汽产生的成分:尼古丁含量,PG和VG湿润剂的比率,在默默的过程中使用的能量输入,和温度实现都是重要的因素。

    烟蒸汽被报道含有7×1011自由基。10尼古丁自由和含有尼古丁冷凝诱导显著增加活性氧释放我们的AMs,这或许可以解释细胞凋亡的诱导尼古丁自由液体。有大大增强活性氧产量AMs处理含有尼古丁比尼古丁自由冷凝冷凝,再一次表明尼古丁依赖和独立的机制在起作用。与我们的结果一致,尼古丁已被证明在上皮细胞ROS增加生产25和巨噬细胞。26由Reidel病人最近的一项研究等研究了诱导痰液的蛋白质含量在烟用户和吸烟者。27支持我们的发现,蛋白质组学分析表明氧化应激相关蛋白的重要upregulation吸烟者和汽,如MMP-9,已知与炎症性肺部疾病如慢性阻塞性肺病。ECVC的影响有或没有被南汽和PI3K抑制改善。

    AMs剂量接触ECVC诱导更多的细胞因子,趋化因子,比nfECVC MMP-9生产。其他人也同样报告显著诱导il - 6和CXCL-8 H292细胞接触后发射极耦合逻辑但不遵循nfECL挑战。28尼古丁在ECL的重要性体现在对细胞因子释放的影响较小,最近还证实在小鼠体内使用unvaped液体气溶胶模型。5

    检测和巨噬细胞吞噬病原体的关键功能和在许多情况下策划的第一步是呼吸道感染的免疫反应。任何影响缴获蒸汽AMs的吞噬能力因此潜在意义的先天免疫反应体内。在sub-cytotoxic ECVC和nfECVC抑制吞噬作用的水平大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,暗示vap可能显著影响细菌清除率。支持我们的数据通过小鼠模型中小鼠暴露在烟蒸汽显示明显受损的肺部细菌间隙而air-exposed老鼠在鼻内感染链球菌引起的肺炎。这个有缺陷的细菌清除率是由于从烟蒸气暴露小鼠吞噬作用减少了AMs。29日人类志愿者最近的一项研究30.发现由于电子烟蒸汽显著增加platelet-activating因子受体(PAFR)表达式,艾滋病肺炎链球菌粘附气道细胞。体外PAFR显著调节诱导的氧化应激等传统的香烟。Miyashita等证明增加PAFR导致肺炎链球菌粘附增加。30.更广泛的风险研究还发现支气管炎的症状是由于电子烟中增加了将近两个用户。31日这些研究在人类志愿者支持我们的建议由于电子烟的使用可能会导致增加或更严重的呼吸道感染,但是进一步的以社区为基础的研究需要充分评估影响肺部健康缴获的用户。

    有趣的是,在这些实验中产生的抑制作用大于nfECVC ECVC吞噬作用。激活烟碱乙酰胆碱受体(乙酰)已被证明移植tissue-resident巨噬细胞的吞噬作用。32因此尼古丁可能抵消一些ECVC和nfECVC抑制性影响,正在通过nicotine-independent机制。

    细胞毒性化合物vap过程中生成的,3 8如无功醛species-formaldehyde、乙酰基醛和acrolein-are诱导细胞凋亡,脂质过氧化作用。33反应性醛进一步引起4-hydroxynonenal的积累(4-HNE)可以通过Fas-mediated和P53-dependent通路诱导细胞凋亡。HNE形成也可以由inflammation-induced活性氧引起的。34 35有鉴于此,我们进行了实验使用THP-1-derived巨噬细胞与细胞毒性剂量(0.8%)的挑战ECVC / nfECVC存在和没有南汽,良好的抗氧化和anti-aldehyde为特征。NAC显著减毒细胞毒性活动和pro-apoptotic冷凝有或没有尼古丁的影响。与AMs如图所示,在THP-1巨噬细胞,ECVC引起显著更大的丧失生存能力和细胞凋亡明显多于nfECVC,再次表明尼古丁依赖和独立的作用机制。

    传统吸烟是慢性阻塞性肺病的原因涉及至少20%的吸烟者,它的特点是增加中性粒细胞肺内炎症和氧化应激。24 36 37在上皮细胞氧化应激的影响是通过PI3Kαmicro-RNA34a通过激活介导的。24Micro-RNA34a牵连加速细胞衰老,诱导增殖,凋亡表现型。这些影响被使用aborogated PI3K抑制剂恢复基线表型。24尼古丁受体7是高度表达对肺泡巨噬细胞及其激活也已被证明能够激活PI3K。38 39因此我们检查的影响锅PI3K抑制剂Ly294002、一班异构体选择性抑制剂- 75 THP-1-derived巨噬细胞。有显著的保护作用后PI3K和Ly294002抑制。这种效应主要是守恒的,当一班同种型抑制剂实物支付债券- 75使用。实物支付债券- 75有选择性地抑制p110α单元200倍比p110β单元更强有力地,表明大部分活动是通过类主持的一个同种型。然而,仍有待进一步研究充分说明行动的机制(s) ECVC / nfECVC AMs。

    这项研究有一定的局限性。首先,我们使用一个体外研究主要AMs的暴露水平可能不是生理但更反映吸入剂。此外,含有尼古丁ECL我们选择可以诱发慢性阻塞性肺病的变化反映在老鼠中,结果表明有生理上的合理性。第二,很难确定一个最佳剂量的尼古丁暴露。在本研究中我们使用0.8% ECVC(包含208µg /毫升尼古丁)和0.5% ECVC尼古丁(包含130µg /毫升)。它是不可能确定一个标准尼古丁的剂量为吸烟实验每个将滴定尼古丁的摄入量来匹配他们的要求。香烟平均10 - 14毫克的尼古丁,40虽然大多数这个尼古丁不吸收,摄取大约是1 - 1.5毫克。41膨化地形研究缴获的用户16日20显示大约1.2毫克的尼古丁摄入20分钟vap会话,用户也滴定尼古丁摄入维持特定的等离子体浓度。缺乏信息上皮衬里流体吸烟者的尼古丁含量。我接触体内也会根据不同技术所使用的用户修改他们的尼古丁的摄入量,如摄入的深度和频率以及保持呼吸/过期。16 20 42

    第三,我们的模型代表一个急性暴露,而不是一个慢性接触系统更适合体内动物实验。第四,目前一个巨大的差距在文献中关于电子烟。许多团体支持的良性本质发射极耦合逻辑而其他人显示ECL体外和体内的细胞毒性效应。这种差异可能反映了缺乏标准化的体外细胞模型和解释。因此,直到建立黄金标准,持续争议是可能的。然而,我们的模型试图复制的实际暴露用户的AMs vap。我们相信这是一个重要的步骤在体外建立一个系统的调查在航空电子烟的影响。最后,我们没有评估口味细胞效应的影响,43部分因为这又增加了一层不确定因素和潜在的混杂因素。然而,数据提供一个背景,研究这些其他潜在因素,有或没有尼古丁。

    总之,我们试图复制暴露的潜在影响急性体外系统中的用户使用我们vaping-condensate技术。我们将展示一种显著增加细胞毒性引起的vap过程本身。重要的是,巨噬细胞的接触ECVC诱导许多相同的细胞和功能的变化是函数在吸烟者和慢性阻塞性肺病患者。尽管还需要进一步研究,以完全理解烟暴露在人类体内的影响,我们建议继续告诫人们普遍认为电子烟是安全的。

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    补充材料

    • 新闻稿

      在这个数据补充文件:

    脚注

    • 贡献者作者的贡献:概念和设计:DRT, STL, DD,凯尔,BN,射频。细胞制备、实验室工作和数据分析:,RM, STL, KA。GCFID - AB。额外的实验室工作:最为。病人招募:BN, DRT, DP, RM。起草文稿:,DRT。所有作者都阅读和批准了手稿。

    • 资金DRT (G1100196/1), ES(先生/ L008335/1),(先生/ L002736/1)和RM(先生/ N021185/1)被医学研究委员会资助。,英国肺脏基金会支持的STL和DD (PPRG16-12)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人的同意不是必需的。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

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