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摘要
背景:我们最近报道了器官特异性自身免疫疾病与特发性慢性咳嗽之间的密切联系，并提出咳嗽可能是由活化淋巴细胞异常归家肺继发的气道炎症引起的。本研究采用免疫病理研究来检验特发性慢性咳嗽与淋巴细胞性气道炎症相关的假说。
方法:对19例特发性慢性咳嗽患者、14例解释性慢性咳嗽患者和11例正常人进行支气管镜检查、支气管活检、支气管肺泡灌洗(BAL)、外周血及BAL流式细胞仪检测。
结果:19例特发性咳嗽患者中有8例出现器官特异性自身免疫疾病或自身抗体阳性，14例解释性咳嗽患者中有1例出现，11例正常受试者中有1例出现。特发性咳嗽患者的BAL液中位差异淋巴细胞计数(10.0%)显著高于正常受试者(6.3%，95%置信区间为1.5 ~ 11.9,p = 0.01)或解释性咳嗽患者(5.2%，95% CI为2.0 ~ 10.4,p = 0.001)。两组间支气管活检T淋巴细胞计数无差异。正常人外周血CD3+单个核细胞表达CD4的平均比例(SE)明显高于特发性咳嗽患者(69 (3)%v58(3)%，平均差值11%，差值2到20的95% CI, p<0.02)，但不高于有解释性慢性咳嗽的患者(63(2)%)。两组间BAL T淋巴细胞表型无差异。
结论:部分特发性慢性咳嗽患者可发生BAL淋巴细胞增多。特发性慢性咳嗽与器官特异性自身免疫性疾病的相关性增加了这可能是由自身免疫性炎症原发部位的淋巴细胞归巢或肺部自身免疫性过程的结果引起的可能性。
- 慢性咳嗽
- 自身免疫性疾病
- 支气管肺泡灌洗
统计数据来自Altmetric.com
慢性咳嗽是全科和呼吸科的常见症状。1在许多情况下，持续咳嗽的原因可以相对简单地确定，大多数是由于一种或多种哮喘、嗜酸性支气管炎、胃食管反流和鼻后滴涕引起的鼻炎。1，2然而，在多达20%的患者中，即使经过广泛的调查和治疗试验，咳嗽仍然无法解释。3.这些病人在身体和心理上都有相当大的发病率。4
在最近的一项病例对照研究中，我们发现特发性慢性咳嗽患者主要为女性(77%)，她们患器官特异性自身免疫疾病(特别是甲状腺功能减退)的可能性是其他患者的8倍。5特发性慢性咳嗽与器官特异性自身免疫性疾病之间的一种可能的联系机制是激活的淋巴细胞从自身免疫性炎症的原发部位归家到肺部。先前的小型研究发现支气管活检标本中单个核细胞数量增加6，7特发性慢性咳嗽患者支气管肺泡灌洗液(BAL)淋巴细胞超过50%，这些发现与这一机制一致。8我们进行了一项研究，通过评估BAL液和支气管活检标本中的炎症细胞数量和表型，来检验淋巴细胞支气管肺泡炎症存在的假设，并确定特发性慢性咳嗽患者的特征。
方法
主题
19例特发性慢性咳嗽患者，14例解释性慢性咳嗽患者，11例正常对照者，来自格伦菲尔德医院门诊部和响应当地广告的健康志愿者。慢性咳嗽患者是从2000年1月至2001年12月期间在专门咳嗽诊所就诊的患者中招募的。该诊所接受来自初级和二级保健的转诊，主要局限于莱斯特郡97万人口。根据标准化算法进行调查，调查和治疗方案和接受诊断的标准如前所述。2，9
我们将特发性慢性咳嗽定义为持续咳嗽>3周，并伴有正常的临床检查(包括耳/鼻/喉)、正常的胸片和高分辨率CT扫描、正常的肺功能测试、阴性的乙酰胆碱吸入试验(刺激浓度PC)20.FEV1>8 mg/ml)，呼气流量峰值变异性正常，痰差嗜酸性粒细胞计数正常(<2%)，24小时食管pH监测显示无病理性胃食管反流或咳嗽与胃食管反流之间的时间相关性证据。患者接受了广泛的阴性治疗试验，包括吸入和全身皮质类固醇试验和推荐的抗反流治疗试验。9有可解释的慢性咳嗽的受试者是那些咳嗽有可确定的原因，并在特定治疗后咳嗽有所改善的人。正常受试者无症状，无可变气流阻塞或气道高反应性的证据。6名正常受试者和9名与另一项研究同时招募的慢性咳嗽患者被用于两项研究。10所有受试者均为非吸烟者，既往吸烟史不超过10包年。在研究开始前的至少6周内，没有人接受过皮质类固醇或其他针对咳嗽的特殊治疗。
该研究获得了所有患者的书面同意，并获得了莱斯特郡研究伦理委员会的批准。
方案和临床测量
受试者参加了三次，间隔1-2周。第一次就诊时，咳嗽可视模拟评分(0 - 100mm)、血清总IgE、蒂莫西草放射过敏吸附剂试验、Dermatophagoides pteronyssinus测量患者的血清血管紧张素转换酶(ACE)水平、猫毛和狗皮屑、全自身抗体筛查(包括胰岛细胞、肾上腺、顶叶、肌内膜和甲状腺过氧化物酶自身抗体)。我们还测量了呼出的一氧化氮、肺活量测定参数和乙酰胆碱气道反应性。11，12使用前面描述的方法获得诱导痰进行炎症细胞差异计数。13在呼吸量测定和挑战试验前，所有受试者均未接受支气管扩张剂治疗至少12小时。受试者完成了一份关于自身免疫性疾病(甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、糖尿病、恶性贫血、艾迪生氏病、脱发、白癜风、腹腔疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、过早绝经和自身免疫性肝炎)的问卷调查。在第二次访问时，用辣椒素咳嗽挑战试验评估咳嗽敏感性14使用标准剂量计方法将吸气流量限制在0.5升/秒。
在第三次来访时，受试者使用Olympus纤维支气管镜(Olympus公司，东京，日本)进行支气管镜检查，符合最新的英国胸科学会指南。15受试者在支气管镜检查前20分钟预先使用2.5 mg沙丁胺醇雾化治疗，并根据需要给予适当的镇静(咪达唑仑0 - 5mg iv)。在整个过程中使用木多卡因(1-4%)进行局部麻醉，并通过鼻导管持续输氧。将180 ml预温生理盐水BAL以60 ml等分液注入右中肺叶。支气管粘膜活检标本取自右侧中、下隆叶。由两位有经验的盲法观察者从BAL液细胞旋转中获得差异细胞计数。从20ml静脉血样本中提取外周血单个核细胞(PBMC)和从BAL液中回收的细胞，用流式细胞术进行分析。粘膜活检标本立即转移到冰冷的含有蛋白酶抑制剂碘乙酰胺(20 mM)和PMSF (2 mM)的丙酮中固定，在−20℃下保存24小时，然后加工成水溶性树脂乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA;polyciences, Northampton, UK)用于嵌入。16
流式细胞术
PBMC分数通过Ficoll离心得到。将PBMC和BAL液细胞在0.5-1 × 10浓度的FACS缓冲液中重悬，进行表面受体表达6/ml使用前面描述的协议。10细胞用抗CD3 (T细胞)、CD4 (T辅助细胞)、CD8 (T细胞毒性细胞)的直接偶联单克隆抗体、活化标记CD25、CD103和CD49a以及趋化因子受体CCR3、CCR5、CCR6和C-X-CR3进行染色。对淋巴细胞进行CD3表达门控，然后按CD4或CD8表达进一步细分，并在FACScan (Becton Dickinson (BD)， Oxford, UK)上用三种彩色流式细胞仪进行分析。
免疫组织化学
取2个μm切片，在0.2%氨水溶液中漂浮1分钟，室温干燥1 ~ 4小时。以下小鼠IgG1单克隆抗体:CD3 (Dako Ltd, High Wycombe, UK)， CD4 (Becton Dickinson, Oxford, UK)， CD8 (Dako Ltd.)， AA1至肥大细胞胰蛋白酶(Dako Ltd)， MBP至嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白(Bradsure Biologicals, Loughborough, UK)， EG2至嗜酸性粒细胞离子蛋白的裂解形式(ECP) (Pharmacia, Milton Keynes, UK)， NE至中性粒细胞弹性蛋白酶(Dako Ltd)， CD45泛白细胞标记(Dako Ltd)， CD14至巨噬细胞(Dako Ltd)， CD56至自然杀伤(NK)细胞(Dako Ltd)， 3H4至白细胞介素4 (IL-4;AMS生物技术，阿宾顿，英国)，IL-5(来自葛兰素史克，哈洛，英国)，干扰素γ (IFN-)γ；研发系统，阿宾顿，英国)。应用于GMA包埋组织的免疫染色技术已在前面介绍过。16
用计算机分析系统(Scion Image, Maryland, USA)对上皮下黏膜进行形态学识别和面积计算。粘膜下最小计数面积为0.1 mm2．编码切片在黏膜下层列举有核免疫染色细胞，细胞数量以个数/mm表示2由经验丰富的盲眼观察者观察。
统计分析
受试者特征采用描述性统计描述，用均值(SE)表示。醋甲胆碱的电脑20.辣椒素的浓度引起两次和五次咳嗽(C2和C5， μmol/l)用对数剂量-响应曲线线性插值计算，用几何平均值(log SE)表示。主要转归变量- bal液淋巴细胞差异细胞计数-以中位数(范围)表示。其他分化细胞计数和上皮下细胞计数用中位数(范围)表示，流式细胞术数据用平均值(SE)表示。三组间及组间比较采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验、ANOVA和unpaired进行t检验分别用于非参数和参数数据。χ2测试用于自身免疫疾病患病率的组间比较。p值<0.05被认为有统计学意义。
结果
研究对象的特征如表1所示。咳嗽患者随机招募了236名患者在咳嗽的主要原因是谁咳嗽变异型哮喘(n = 39岁,17%),gastro-oesophageal回流(n = 35岁,15%),鼻炎(n = 29, 12%)、嗜酸性支气管炎(n = 17日7%)、特发性(n = 54, 23%),病毒(n = 17日7%),支气管扩张(n = 14人,6%),慢性支气管炎(n = 10, 4%)、扁桃体肥大(n = 8 3%),肺纤维化(n = 7, 3%)、血管紧张素转化酶抑制剂咳嗽(n = 4, 2%)、结节病(n = 1, 0.5%),支气管肿瘤(n = 1,0.5%)。研究纳入的有解释性慢性咳嗽的患者的咳嗽原因为:咳嗽变异性哮喘(n = 4)、嗜酸性支气管炎(n = 5)、胃食管反流(n = 2)、鼻炎(n = 2)和慢性支气管炎(n = 1)。所有受试者血清ACE水平正常。54例特发性慢性咳嗽患者中有16例(30%)患有器官特异性自身免疫性疾病。本研究纳入的19例特发性慢性咳嗽患者中，有6例(32%)有临床明显的器官特异性自身免疫性疾病(3例甲状腺功能减退，1例恶性贫血/白癜风，1例腹腔疾病，1例白癜风)，另有2例器官特异性自身抗体(壁细胞和胰岛细胞)阳性，但无临床疾病证据。1例正常对照和1例解释性咳嗽患者自身抗体(分别为胰岛细胞和胰岛细胞/肾上腺)阳性;他们都没有自身免疫疾病的临床证据。特发性慢性咳嗽患者的器官特异性自身免疫性疾病或自身抗体阳性的患病率明显高于正常受试者或解释性慢性咳嗽患者(p = 0.01)。 Both cough groups had heightened capsaicin cough reflex sensitivity (table 1).
痰液和BAL液差异炎症细胞计数见表2。三组间BAL液差和总淋巴细胞计数差异有统计学意义(p = 0.002和p = 0.003;表2和图1)。特发性咳嗽患者中位BAL液差淋巴细胞计数(10.0%)明显高于正常人(6.3%);95%可信区间(CI)为1.5 ~ 11.9,p = 0.01)和有解释性咳嗽的患者(5.2%;差异2.0至10.4的95% CI, p = 0.001;解释性咳嗽组的BAL液中位嗜酸性粒细胞计数明显高于正常受试者和特发性咳嗽组(表2)。各组间其他差异细胞计数无差异。
BAL液淋巴细胞差异细胞计数(%)。水平线表示中位数。实三角形表示有器官特异性自身免疫性疾病史或存在器官特异性自身抗体的受试者。开放的三角形代表那些没有自身免疫疾病或自身抗体的人。*p = 0.002 (Kruskal-Wallis检验)。
9例正常受试者，10例特发性咳嗽患者，13例解释性咳嗽患者，黏膜下层有足够形态，适合计数细胞。三组活检标本中T细胞(CD3、CD4、CD8)上皮下细胞计数差异无统计学意义(表3)。三组间CD56+、IFNγ+上皮下细胞计数差异有统计学意义(分别为p = 0.03、p = 0.047，表3)。EG2+、MBP+、3H4+(IL-4)细胞/mm2解释性咳嗽患者的上皮下细胞计数明显高于正常受试者和特发性咳嗽患者，但两组间其他细胞计数无显著差异(表3)。两盲观察者之间细胞计数的类内相关系数为:BAL淋巴细胞计数0.90，细胞外染色的支气管活检上皮下细胞计数0.97和细胞内染色的0.86。
CD3+ PBMC表达CD4的平均比例(SE)在正常组明显高于特发性咳嗽组(69 (3)%)v58(3)%，平均差异11%，差异2到20的95% CI, p<0.02)，与有解释性咳嗽的受试者(69(3)%相比接近显著性v63(2)%，平均差异7%，差异−1到15的95% CI, p = 0.08)。正常受试者的PBMC CD4/CD8比值明显高于特发性咳嗽患者(2.5(0.4))。v1.6(0.2)，平均差异0.9,95% CI 0.1 ~ 1.8, p<0.05)，但不包括有解释性咳嗽(1.8 (0.2)，p = 0.09)。CD3+ BAL细胞表达CD4(平均值(SE):正常58(5)%，特发性咳嗽59(3)%，解释性咳嗽55(4)%)和CD4/CD8比值(正常1.8(0.5)%，特发性咳嗽1.6(0.2)%，解释性咳嗽1.5(0.2)%)组间差异无统计学意义。各组间表达活化或趋化因子受体的CD3+CD4+或CD3+CD8+ (CD3+CD4−)PBMC和BAL液细胞比例无差异。
讨论
这是第一个详细探讨特发性慢性咳嗽患者下气道免疫病理的研究。我们发现特发性慢性咳嗽患者有明显的BAL液淋巴细胞增多。这不太可能是咳嗽本身的一个特征，因为在有类似严重程度的慢性咳嗽的患者中没有发现。本研究结果与特发性慢性咳嗽中存在淋巴细胞支气管肺泡炎症的观点一致。如前所述，特发性慢性咳嗽患者以女性为主，咳嗽反射敏感性增高，器官特异性自身免疫性疾病和器官特异性自身抗体发病率高。5，17患病率高于一般人群调查的预期(3-8%)，显著高于正常对照组或有解释性慢性咳嗽的患者。18，19
McGarvey等8报道了6例特发性慢性咳嗽患者与健康对照组相比，BAL液淋巴细胞增多的相对增加幅度相似，尽管在本研究中差异无统计学意义。相反，Boulet等6与对照组相比，4例非鼻炎或胃食管反流引起的慢性咳嗽患者的BAL液淋巴细胞计数无差异。这些研究和我们的研究之间的差异可能与诊断的力量或精确度有关。BAL液淋巴细胞增多在我们的研究中并不是一个一致的特征，对不一致的结果的另一个可能的解释是特发性慢性咳嗽是具有不同病理生理条件的异质性集合，BAL液淋巴细胞增多局限于一个亚组。
在BAL液中可见淋巴细胞计数增加，但在诱导痰或支气管活检标本中未见增加，提示炎症可能局限于远端气道和肺泡腔室。然而，诱导痰中淋巴细胞计数没有增加并不一定能作为大气道感染的证据，因为这些样本中的淋巴细胞比例较低，可能不能很好地反映淋巴细胞性气道炎症。11我们在支气管活检标本中的发现与其他研究相反，其他研究报告了特发性慢性咳嗽患者中单个核细胞数量的增加。6，7我们发现特发性慢性咳嗽中IFNγ+和NK细胞数量减少，外周血CD4 T细胞表型有轻微变化。这些发现的意义尚不清楚;它们可能是偶然出现的，因为它们不是先天假设。然而，NK细胞是单个核细胞的一个子集，在预防自身免疫性疾病中发挥免疫调节作用，通过分泌ifn - γ调节它们的一些作用，20.在那些有罹患器官特异性自身免疫性疾病风险的个体中，他们被证明存在功能和数量上的缺陷，21所以这些发现可能与我们的假设有关。对支气管活检数据的解释有一个重要的警告。由于技术上的困难，可能与我们试图对有严重咳嗽的患者进行BAL和支气管活检有关，只有略多于一半的特发性慢性咳嗽受试者可以进行足够的粘膜下层分析，因此我们不能排除由于缺乏动力或偏见而遗漏特征的可能性。另一个需要考虑的问题是，我们已经研究了大量的次要结果测量，因此由于多次比较，可能会出现差异。由于这是第一个详细调查特发性慢性咳嗽受试者下气道免疫病理的研究，而对其发病机制知之甚少，我们认为广泛的描述方法是合理的。然而，我们的发现应该被视为假设产生而不是决定性的，重要的是进行进一步的验证性研究。未来的研究应该理想地结合更大的活检标本和经支气管活检标本，以便更好地定位和表征下气道炎症反应。
支气管肺泡淋巴细胞增多也见于结节病，22外源性过敏性肺泡炎，23类风湿性关节炎的肺部受累24和干燥综合征。25所有特发性慢性咳嗽患者均无临床特征、影像学表现或实验室检查结果提示上述诊断。BAL液体淋巴细胞增多症也与类风湿关节炎中的闭塞性细支气管炎、干燥症、肺移植和炎症性肠病有关。26日,27有趣的是，推测在我们的患者中也发生了类似的(尽管分级较低)过程，特别是因为我们最近报道了一组以老年妇女为主的人群中，器官特异性自身免疫疾病和不明原因的固定气流阻塞之间的联系，其中许多人在就诊时有长期干咳史。28
肺和许多涉及器官特异性自身免疫性疾病的器官具有共同的胚胎起源，作为前肠的衍生物，咳嗽和BAL液体淋巴细胞增多的一个可能机制是激活的T细胞从自身免疫性炎症的原发部位归巢到肺腔室。类似的机制被认为是炎性肠病中出现的淋巴细胞性气道炎症的原因，29值得注意的是，与对照组相比，治疗过的甲状腺功能减退和炎症性肠病患者呼吸道症状的患病率增加，而且报告的症状情况非常相似。30.活化淋巴细胞的异常归家发生在肺部，可导致孤立的咳嗽，而没有生理和放射学变化，这一概念得到了最近的一例病例报告的支持，该病例与BAL液体淋巴细胞增多症有关，但在腹腔疾病治疗后消失，否则无法解释的慢性咳嗽。31本研究中发现的BAL液体淋巴细胞增多并不局限于明显的器官特异性自身免疫性疾病患者，这可能表明这种联系与其他部位淋巴细胞炎症的存在没有直接关系。另一种有趣的机制是，咳嗽可能是由于迄今尚未确认的自身免疫性支气管炎、毛细支气管炎或微妙的间质过程，与其他疾病的联系只是反映了已确认的不同器官特异性自身免疫性疾病之间的联系。
一个问题是:为什么皮质类固醇治疗对我们的患者没有帮助?这可能是因为自身免疫性甲状腺功能减退、恶性贫血、胰岛素依赖型糖尿病和其他器官特异性自身免疫性疾病与系统性自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎)不同，它们对皮质类固醇的反应不佳。18此外，皮质类固醇治疗在一些与BAL液体淋巴细胞增多症相关的肺部并发症中令人失望，如类风湿性关节炎和肺移植。26
总之，我们在一些特发性慢性咳嗽患者中发现了BAL液体淋巴细胞增多。这些患者主要是中年妇女，器官特异性自身免疫疾病的发病率很高，这增加了自身免疫炎症、肺部淋巴细胞炎症和咳嗽之间的联系的可能性。BAL淋巴细胞增多的机制及其与咳嗽的关系有待进一步研究。
致谢
作者感谢研究参与者D Parker和T Huynh在实验室中的帮助，以及S McKenna夫人和B Hargadon夫人在一些患者的临床特征方面的帮助。
参考文献
脚注
由英国肺基金会和莱斯特大学医院NHS信托基金资助。
SSB是英国肺基金会的临床研究员。
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