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本文总结最新进展在显微技术(荧光和肽核酸)和培养技术(固体、液体、放射和non-radiometric系统)和快速发展的方法识别的分枝杆菌文化(高效液相色谱法,薄层色谱法,RNA序列,和聚合酶链反应限制性内切酶分析)。分子识别放大系统的作用结核分枝杆菌是描述。大多数方法记录高特异性和敏感性痰涂片阳性但变量敏感性对痰涂片阴性和肺外的标本。标本质量将影响这些化验的性能和组织延迟,如标本的批处理,可以减少节省时间。在房子化验可以有效的商业系统,只要使用适当的控制。
- 肺结核
- 实验室诊断
- non-tuberculous支原体
来自Altmetric.com的统计
许多年来结核病被认为是征服了发达国家的。然而,在过去的十年里,结核病的发病率在英国一直上升。1世界卫生组织(世卫组织)已宣布结核病全球紧急,每年大约有300万人死于结核病。2,几个高调的爆发耐药结核病(mdr - TB)在英国和美国,推动研究改进的方法对结核病的诊断和其他分枝杆菌感染。尽管公共卫生重要性较低的比结核分枝杆菌,non-tuberculous分枝杆菌(特种加工)与患者在英国越来越频繁。这部分,但不完全,提高利率的结果人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。3有明显降低的发生率M鸟结核复杂的感染自引入改进的抗逆转录病毒治疗。
尽管经验性治疗方案是用于管理M肺结核和特种加工疾病,药敏测试尤为重要,确定结核病的耐药性,这是众所周知的,妥协的治疗成功。4特种加工物种的鉴定是必要的,因为这将决定应该使用实证的策略。药敏测试是大多数特种加工的有限使用。5
本文将讨论新的分枝杆菌感染的实验室诊断方法在传统方法的背景下,建议适当的临床用途。
诊断mycobacteriology实验室
mycobacteriology实验室的功能取决于人口服务,的发生率M肺结核和特种加工疾病,实验室是否有参考作用。在地方层面,在英国地区实验室的职责是检查临床标本进行分枝杆菌的存在使用显微镜和文化。然而,许多实验室缺乏资源来确定隔离或确定其药物敏感性。参考实验室存在执行这一至关重要的任务,这样做会产生疾病监测数据作为国家结核病规划的一部分。
mycobacteriology实验室的中流砥柱,仍将在可预见的未来,显微镜和文化在固体和液体介质。显微镜,尽管相对不敏感,仍是唯一一天诊断测试所有实验室的预算之内,大或小。此外,因为它评估的传染性肺结核患者,6这是一个不可缺少的测试医院和社区感染控制。传统技术”为基础的企业文化可以只要六到八周隔离一个分枝杆菌物种从临床标本,但目前没有其他测试一样敏感。这些测试方法的敏感性的程度显示了文化,没有一个能够提供其它基本数据,如各种药物易感性。7实验室必须迅速屏幕标本抗酸杆菌(AFB),和文化,尽快确定隔离。美国疾病控制中心(CDC)推荐的识别M肺结核文化和第一线药物敏感性的测定在30天内被执行。8
显微镜的进步
对分枝杆菌显微镜一般染色的标本carbol碱性品红染料,保留的细胞壁在洗涤酸醇(例如,Ziehl-Neelsen;锌)。缩短时间检查标本的显微镜通过引入荧光显微镜,用金胺酚染色。8精通地进行显微镜可以检测到空军基地在60 - 70%的文化积极的呼吸道标本。9锌的敏感性显微镜大约5×103空军基地/毫升。10集中的痰标本可以提高灵敏度,尽管一些研究发现相反的因为不是所有分枝杆菌在离心沉淀物。11此外,unconcentrated方法给出一个准确的指导的传染性patient-patients与涂片阳性痰是最具有传染性。6显微镜在材料从固体,通常液体,文化可以用来诊断为结核,虽然不可能区分M肺结核在临床标本和特种加工。8然而,一个更精确的方法(见下文)需要识别在物种水平。
同时评估能力涂片地位和区分M肺结核直接和特种加工在呼吸道标本患者治疗和医院感染控制有重要意义。潜在的进步在显微镜可能促进这是肽核酸(PNAs)的使用荧光染色的格式。PNAs是DNA分子的糖磷酸骨架被替换为一个肽等结构。绑定的DNA或RNA序列特定机构和交互比DNA DNA的相互作用。由于其疏水性,PNAs可以通过更容易在完整的细胞壁,和适当的治疗可以绑定到特定的细胞内核酸序列。标签的机构与荧光染料使可视化与合适的显微镜。PNAs的具体M肺结核复杂和特种加工已经制定和测试小组培养分枝杆菌物种与一些成功。12
培养技术的进步
传统文化在固体和液体媒体执行如Lowenstein-Jensen,基什内尔和各种麦德配方(7 h9、7 h10和7 h11)。时间可以缩短检测分枝杆菌物种的增长大大使用的自动或半自动液体培养系统可以检测增长比肉眼更早。第一次使用系统在实验室是BACTEC 460 tb的乐器。用放射性标记的肉汤14C-palmitate作为唯一碳源,生物体的新陈代谢将放射性标记14有限公司2,然后可以检测到的BACTEC乐器。新的增长依靠non-radiometric检测系统已经开发出来,如MB / BacT (Teknika欧),BACTEC 9000(正),分枝杆菌生长指示管(MGIT;正欲)。许多研究比较不同文化系统的性能。BACTEC 460系统仍然是最快和最敏感,其次是连续自动non-radiometric液体培养系统,与固体媒体系统是最慢的。重要的是要注意,虽然一个系统可能似乎更快,因为它的检测方法更敏感,生物质在培养瓶可能大大低于其他的系统。例如,高生物量的MB / BacT系统允许直接接种鉴定板和敏感性测试,和识别DNA杂交系统在几乎所有的情况下。表1总结了一些比较不同系统的评估。
在英国大多数医院实验室仅仅依靠固体手册和/或液体(例如,基什内尔)媒体对分枝杆菌的隔离19因为涉及的工作量不购买和使用一个自动化的系统成本效益的选择。然而,组织实验室一起表演可以购买这样一个系统实际,越来越多,许多实验室都选择这样做。的PHLS系统和区域Mycobacteriology可以迅速提供文化服务中心医院,他们通常不会提供初级隔离服务。
分枝杆菌的快速识别的方法
传统的方法是基于生长参数、生化特征、和细胞壁脂质分析通过薄层色谱法(TLC)。几个系统存在从培养分离株分枝杆菌物种的快速识别。Accuprobe(美国GenProbe)的识别系统包括测试M肺结核复杂的,M鸟结核复杂的,M鸟结核,M intracellulare,M kansasii,M gordonae。系统是非常具体的但为每个物种必须执行一个单独的测试。高效液相色谱法(HPLC)分析霉菌酸,20.和DNA测序的16 s rRNA核糖体RNA基因21都可以用于分枝杆菌物种的可靠的识别。然而,化验使用高成本的资本设备的大多数临床实验室除了参考电平,虽然低试剂成本高效液相色谱可以抵消高设置成本。另一个选项是聚合酶链反应(PCR)限制性内切酶测定(PRA),22已成功使用在我们的实验室和其他地方。分析基于PCR扩增的片段hsp65基因。随后PCR产品是在两个独立的限制性内切酶消化和片段来进行琼脂糖凝胶电泳分析。最近Devallois提出的算法等可以用来识别34分枝杆菌种和亚种。23在我们实验室的经验表明,该算法在使用前应该在实验室标准化。
我们正在评估一个商用设备(脂肪酶分枝杆菌;Innogenetics, Zwijndrecht,比利时)基于反向杂交原理。PCR用于放大16 s-23s核糖体隔离区域和产品杂交探针绑定到一个尼龙带;绑定colorimetrically标识。Accuprobe不同,一个测试可以确定一个物种调查范围具体如下:分枝杆菌sp。M肺结核复杂的,M kansasii第二组,组和组III-V,M xenopi,M gordonae,但是,M鸟结核,M intracellulare,M scrofulaceum,M chelonae组I-IV (SA沃特森et al。实用的基于PCR的脂肪酶分枝杆菌鉴定MB / BacT结核分枝杆菌孤立的系统。摘要第99届大会的美国微生物学会、抽象。U-29:639)。
固相的原则的扩展检测核酸。使用高密度DNA探针阵列玻璃“芯片”系统在理论上是能够同时应变识别、打字、和耐药性的检测等位基因在培养分离。24日,25被商业开发的系统,但专业分析设备的成本非常昂贵。
在临床标本检测分枝杆菌的快速方法
由于大多数致病性分枝杆菌的增长缓慢,测试已经开发了分枝杆菌直接在临床标本的检测。大多数都涉及少量的核酸扩增,其中最著名的是PCR。在1988年第一次描述,它是用来检测M肺结核一年后。26因为理论预示能力检测基因组序列的一个副本,十年后一个更务实的态度已经开发了对它的使用。尽管发达的特异性PCR可以高,文化的敏感性显著低于。灵敏度可以提高通过使用嵌套PCR在第一轮反应是re-amplified在第二个PCR,但是提高灵敏度的最好方法是使用高质量的标本。通常,显微镜能够探测到空军基地在60 - 70%的文化积极的呼吸材料。质量好的PCR的灵敏度会将90 - 100%和60 - 70%涂片积极和消极文化积极的呼吸样本,分别。积极使用PCR结果M肺结核具体引物涂片阳性样本表明,在场的空军基地M肺结核,而消极的PCR建议一个特种加工,只要控制进行消除反应抑制由样本组件的可能性。涂片阴性标本,然而,消极的PCR并不排除的存在M肺结核(见下文)。
广泛的替代核酸扩增检测(NAATs)已经被开发出来,但只有少数评估在临床实验室。那些包括基于PCR的Amplicor(罗氏)、转录调节放大(AMTD;GenProbe)、链置换扩增(BDProbeTec-SDA)和连接酶连锁反应(LCx;雅培系统)。Amplicor放大16 s rRNA的一部分基因比色检测PCR产品紧随其后。AMTD,而不是使用DNA作为目标使用rRNA,哪个更丰富的比相应的DNA,使AMTD理论上比PCR更为敏感。核糖体RNA的转录的逆转录酶形成一个复杂的转录等温扩增目标序列的RNA聚合酶是催化了。BDProbeTec-SDA,像AMTD,采用等温扩增,但我使用的大片段DNA聚合酶放大DNA DNA模板的产品。这种测试的敏感性和特异性都建立在两个单独的和比较评价。敏感性和特异性的上述测试属于同一范围的值给定PCR(上图)。 However, test performances can only be compared if the tests have been performed on the same specimens. Table 2 summarises the main comparative studies. Crossreaction of the GenProbe AMTD test has recently been reported with some isolates ofM kansasii和M鸟结核。33重要的是要记住,一个实验室报告只是提交的样品一样好,这是对NAATs是其他实验室测试。34我们的经验,可靠的结果的关键从NAAT就是提交一份高质量的标本。此外,适当的基础设施、人员培训和质量控制程序是必不可少的,以避免crosscontamination事件导致假阳性结果。
血清学测试
的结核病血清学测试并不像NAATs发达。尽管当前测试缺乏敏感性,其相对较低的成本和简单证明进一步的研究和发展。全面审查的结核病血清学测试已经由威尔金斯。35
快速检测耐药的方法
因为诊断的目的是使应用程序的适当的治疗方案,准确的药敏测试诊断过程的内在组成部分。传统的方法可以执行两周当起始物料分离培养。快速的方法可以是表型、基因型耐药突变筛查在哪里。目前,它实际的唯一药物筛选抗性突变临床利福平,因为大多数突变是局限于一小部分的β亚基的基因编码细菌RNA聚合酶。InnoLiPA Rif。结核病检测36和一个RNA-RNA不匹配试验37已经成功地应用在我们的实验室的同时识别M肺结核和利福平耐药性突变筛查积极呼吸道标本直接涂片和培养的隔离。在我们的手中InnoLiPA Rif。结核病和不匹配分析与检测的标准方法M肺结核和利福平敏测试涂阳呼吸道标本的94.7%和100%,分别。38
快速表型方法包括实验荧光素酶噬菌体化验39和噬菌体生物放大(伤健)测定。38岁的40这些提供有吸引力的优势基因型分析因为耐药性的机制是无关紧要的。此外,这项技术大大便宜的伤健化验,也不需要专业知识除此之外任何微生物实验室中找到。然而,到目前为止,尽管化验工作在培养分离,其应用程序主要标本更有限。41伤健的更详细的描述分析和耐药结核病的基因可以在Drobniewski和威尔逊的评论7和Telenti。42
适当的使用新技术的诊断过程
1996车间的美国胸腔协会的赞助下讨论了临床、实验室和公共卫生方面的直接放大测试(DATs)放大测试主要进行标本。43报告的主要conslusions在标准测试是一个重大的改进技术,尽管担忧表示,没有足够的信息存在于他们的临床和公共健康的影响。表3总结了DAT的解释结果,但在显微镜和DAT结果不一致的报告建议,进一步考虑临床细节和重复测试应该执行。最后的建议是DATs应该结合显微镜和执行文化,结果应该解释的临床资料。本地测试性能和潜在结核患病率也很重要的变量会影响DAT化验结果的决策分析。
分子放大测试是昂贵和卫生保健系统无法适应他们使用每一个标本,特别是因为小说为基础的企业文化系统仍然更敏感。病人管理并不总是受对测试结果的影响。因此,限制使用这种测试的情况下将协助临床管理包含分子测试。美国食品和药物管理局已批准AMTD和Amplicor化验涂阳病人呼吸道标本不是抗生素治疗超过7天或之前的12个月。测试没有最初批准涂片阴性标本因为假阳性的数量相对于额外的发现的病例数太高。在大多数情况下,病程相对缓慢和病人不太不舒服。然而,当一个病人情况危急时,急性脑膜炎等严重疾病,它可能是可取的追求任何形式的可能的快速诊断。劳和Libman44进行决策分析在各种检测策略的肺结核病例。他们得出的结论是,PCR涂片阳性样本和媒体瓶接种涂片阴性标本提供平均检测时间较短,同时避免使用DAT无限制/通用的筛选工具。
在英国,分枝杆菌分离株被发送到少量的参考实验室进行鉴定和药敏试验。最近审计已经确定了几个实践,导致延误诊断,即:
使用一个单一的固体培养基从初级分枝杆菌标本的隔离而不是固体和液体媒体的组合。
批处理的标本进行处理。所有主要的标本都应该检查显微镜和接种培养基在一个工作日内。
延迟输入推荐形式的临床医生或分布的结果。
转录的参考结果的信任自己的IT系统。所有引用报告应该被复制在到来后条目,与原报告立即传送到医生。新的分子技术无法弥补这些延迟。
处理其中的一些问题,PHLS实验室发送第一个涂片阳性标本从每个病人直接参考单位或者Mycobacteriology区域中心分枝杆菌快速文化在一个自动化的系统中,已经出现在苏格兰。此外,所有的积极文化新患者类似M肺结核通过显微镜和/或肉眼检查确定那天的收据。适当的敏测试立即接种。实验室接收通知的收据和文化M肺结核识别新病人48 - 72小时内免费为NHS信托收据。45尽管这是一个重大的进步,有必要对所有实验室来识别所有可能的来源的延迟M肺结核文化和推荐系统。