文摘
西地那非、他达拉非和伐地那非竞争性抑制由phosphodiesterase-5 cGMP水解(PDE5),从而促进cGMP积累和血管平滑肌的松弛。生化的效能(亲和力)这些化合物对PDE5由集成电路50,KD(等温线),KD(离解速率),KD(½EC50),分别是:西地那非(3.7±1.4,4.8±0.80,3.7±0.29,11.7±0.70海里),他达拉非(1.8±0.40,2.4±0.60,1.9±0.37,2.7±0.25 nM);伐地那非和(0.091±0.031,0.38±0.07,0.27±0.01,0.42±0.10海里)。因此,绝对的力量值为每个抑制剂类似,和相对的效能是伐地那非≫他达拉非>西地那非。绑定的3H PDE5抑制剂是具体由标记化合物的影响。3H不绑定到孤立PDE5抑制剂监管领域。密切相关的电子商务50使用这三个值3H抑制剂与其他的人竞争表明PDE5每个占据相同的网站。西地那非、伐地那非类似物的研究表明,更高效能的伐地那非是由差异的双戒指。为每个抑制剂Exchange-dissociation研究显示两个绑定组件。多余的无标号抑制剂没有明显影响3无限稀释后H抑制剂离解,暗示没有subunit-subunit协同。cGMP除了增加亲和力的3H]他达拉非或[3H]伐地那非,效果可能由cGMP绑定PDE5变构网站,这意味着要么强化自己的绑定PDE5抑制剂在完整细胞提升环鸟苷酸。没有抑制剂,cGMP积累会刺激cGMP降解,但在抑制剂存在,这个负面的反馈过程将被阻塞。
Phosphodiesterase-5 (PDE5)是1 11哺乳动物PDE家庭知道日期(弗朗西斯et al ., 2001)。PDE5 cGMP-specific PDE和丰富在多数平滑肌组织以及血小板,胃肠道上皮细胞,和小脑浦肯野细胞(弗朗西斯et al ., 2001;Shimizu-Albergine et al ., 2003)。纯化,酶是首次发现和克隆实验室(林肯et al ., 1976;弗朗西斯et al ., 1980;托马斯et al ., 1990 a;McAllister-Lucas et al ., 1993)。PDE5为,每个单体是一种嵌合蛋白,由一个管理域和催化域(卡宾和弗朗西斯,1999)。cGMP的催化域催化分解为5′gmp,和监管领域包含变构cGMP-binding网站和磷酸化站点(卡宾和弗朗西斯,1999)。两个串联∼110氨基酸的同源重复监管域称为GAF域名(一个和b在c),因为它们的存在GMP-binding环核苷酸pd,淡水藻类的一种一个denylyl环化酶和细菌转录因子FhlA (托马斯et al ., 1990 a;McAllister-Lucas et al ., 1993;Aravind桥,1997年)。孤立的GAF一个单体与高亲和力结合cGMP,但GAF cGMP绑定b还没有被证明(刘et al ., 2002)。变构绑定cGMP PDE5监管领域增加亲和力cGMP的催化部位,从而刺激环鸟苷酸水解的速度(托马斯et al ., 1990 b;卡宾和弗朗西斯,1999;冈田克也和川,2002年;卡宾et al ., 2003;Mullershausen et al ., 2003;Rybalkin et al ., 2003)。cGMP绑定的监管领域也刺激磷酸化PDE5 ser - 92(牛)cGMP-dependent蛋白激酶在体外和体内托马斯et al ., 1990 b;怀亚特et al ., 1998;Mullershausen et al ., 2001;没吃,2001;Rybalkin et al ., 2002)。据推测,cGMP绑定到监管领域产生的构象变化PDE5暴露ser - 92。由此产生的磷酸化PDE5增加监管领域cGMP的亲和力和增加催化活性(卡宾et al ., 2000)。这些效应表明,PDE5至关参与负反馈调节细胞cGMP水平。
合成了几种化合物,强有力地抑制PDE5最近,和三个现在在临床用于治疗男性勃起功能障碍。性唤起后,这些抑制剂提高积累cGMP的动脉平滑肌提供阴茎和阴茎阴茎海绵体的血窦。西地那非(伟哥;辉瑞,纽约)是第一个推销这个类的化合物用于治疗男性勃起功能障碍。它还显示了承诺相关疾病临床治疗的平滑肌组织,如肺动脉高压(Weimann et al ., 2000)。新PDE5抑制剂西地那非一样的治疗机制,比如他达拉非(西力士;Lilly-ICOS,十分佤邦),伐地那非(艾力达;拜耳公司,西汉文,CT),也已在许多国家批准使用。这些高亲和性的可用性抑制剂的研究提供了重要的新工具PDE5催化领域。这个实验室最近检查催化域的一些特点及其监管通过调查(3H]西地那非绑定到酶(卡宾et al ., 2003)。他达拉非的结构,与西地那非、伐地那非显著不同,这三个化合物有不同的抑制效力。分子接触的三个抑制剂的催化部位PDE5最近揭示了x射线晶体学(唱et al ., 2003)。除了[3H]西地那非,我们合成或收购3H]他达拉非和[3伐地那非H)。这些化合物的可用性使得全面的分析这些代理与PDE5的互动,这是报告。这些放射性标记的抑制剂也允许最全面,详细比较这些代理绑定到PDE5使用效能的几种方法。此外,一些小说特征的PDE5抑制剂和发现使用这些方法。
材料和方法
材料。(3H] cGMP, DEAE-Sephacel买来Amersham生物科学公司(皮斯卡塔韦,NJ)。3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),组蛋白类型二,Crotalus atrox蛇毒,5′gmp, cGMP从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。His-tagged,完整的重组牛PDE5隔绝感染Sf9细胞使用镍/次氮基三乙酸琼脂糖(试剂盒,瓦伦西亚,CA)如前所述(卡宾et al ., 2003)。和纯化获得了本地牛肺PDE5使用在前面的报告(描述蓝琼脂糖弗朗西斯和卡宾,1988年;托马斯et al ., 1990 a)。西地那非纯化从伟哥药片遵循先前建立的方法在本实验室(卡宾et al ., 2003)。纯化西地那非是提交给Amersham生物科学与氚放射性标记。他达拉非合成根据Daugan (2000年)。在质谱确认化合物结构之后,他达拉非是提交给Amersham生物科学与氚放射性标记。Amersham高性能液相色谱结果表明(3H]西地那非是> 98%的纯,而[3H]他达拉非制备纯> 99%。伐地那非,3H]伐地那非,demethyl-vardenafil, methyl-sildenafil由拜耳公司(德国伍珀塔尔)。所有三个3H抑制剂,储存超过一年受到交联葡聚糖G-25色谱法,吸附PDE抑制剂和提供高分辨率(卡宾et al ., 2003;弗朗西斯et al ., 2003)。所有三个3H抑制剂被解决在单峰值和coeluted纯化标记抑制剂,这表明3存储后H抑制剂是不变的。即便如此,这也不能完全排除curvilinearity观察的离解3H抑制剂图5可能会造成轻微的抑制剂的结构非均质性。
孤立的PDE5管理域。残留Met1人类PDE5的Glu539从hPDE5 cDNA放大(礼貌田边研究实验室Inc .的圣地亚哥,CA)。使用远期底漆RZMet1for (5′-GATATTGAATTCATGGAGCGGGCCGGCCCCAGCT-3′)和反向引物RZGlu539rev (5′-GATGATAGCGGCCGCCTATCTCTTGTTTCTTCCTCTGCT-3′),包含EcoRI和NotI网站(强调)和一个终止密码子(粗斜体)。结果PCR片段克隆PCR 2.1(1649个碱基对)威尼斯平底渔船(表达载体,卡尔斯巴德,CA)并通过测序验证。片段被消化和EcoRI NotI切除插入杆状病毒转移pAcHLT-A(圣地亚哥BD PharMingen CA)与相同的酶消化。由此产生的质粒与BaculoGold cotransfected杆状病毒DNA (BD PharMingen) Sf9细胞根据制造商的指示。转染细胞孵化在27°C 5天。之后,100μl收集培养基用于感染2×107刚做好的Sf9细胞对病毒扩增。重组杆状病毒是放大两次获得高效价原液通过感染新鲜种子Sf9细胞。受感染的细胞被孵化27°C蛋白前4天是收获。净化进行了使用镍/次氮基三乙酸琼脂糖如前所述(卡宾et al ., 2003)。
PDE化验。PDE活性决定使用修改后的方法(马丁斯et al ., 1982如前所述(Gopal et al ., 2001)与0.4μM [3H] cGMP作为衬底。
(3H] cGMP-Binding化验。前面描述的过程略有修改(卡宾et al ., 2000)。PDE5或PDE5(80μl)隔离监管域(4海里最终蛋白质浓度在反应混合物)加入2毫升0.2μM的混合物(3H] cGMP, 10毫米磷酸钾,pH值6.8,25毫米2-mercaptoethanol, 0.2毫克/毫升类型二组蛋白(σ)。在4°C 45分钟后,样品被过滤到premoistened微孔过滤器(孔隙大小,0.45μm),然后冲洗3毫升10毫米磷酸钾,pH值6.8和25毫米β-mercaptoethanol,干和计算。
3H抑制剂膜Filtration-Binding化验。全身牛His-tagged PDE5(80μl)加入2毫升的有约束力的反应混合物中含有0.2毫克/毫升组蛋白IIA-S,各种浓度的3H抑制剂,包括10毫米磷酸钾缓冲,pH值6.8,25毫米β-mercaptoethanol (KPM)。坚持的3H抑制剂的试管时发生3H抑制剂添加在缺乏或之前的组蛋白。组蛋白也增加了保留PDE5的微孔膜。绑定包含酶反应混合物在冰或孵化30°C水浴45分钟。微孔硝化纤维素膜(0.45μm)被放置在真空和prewetted 1毫升的冰冷的10毫米磷酸钾,pH值6.8,包含0.1% Triton x - 100。接下来,200μl 25% Triton x - 100在室温下进一步强化了反应管。的全部内容管应用于prewetted过滤器。反应管然后洗了3毫升的冷0.1%磷酸钾Triton x - 100 10毫米,pH值6.8,洗也应用于滤波器。过滤膜被移除,干,转移到6毫升闪烁瓶。非水溶剂产生火花的(5毫升)添加到管,然后放置在一个闪烁计数器。
统计分析。给出所有值的平均值±标准错误意味着(S.E.M.)由GraphPad棱镜图形软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。软件使用下列方程:S.E.M. =标准差/n1/2,标准差确定[Σ(y我- y的意思是)2/ (n½- 1))。所有S.E.M.值适合报道95%的置信区间,而量化的精度的意思。
结果
抑制PDE5催化活性。抑制PDE5抑制剂的浓度产生50%催化活性(IC50)确定为每个抑制剂(西地那非、他达拉非和伐地那非)使用0.4μM [3H] cGMP衬底(图1)。的集成电路50价值观:西地那非,3.7±1.4 nM (n= 4);他达拉非,1.8±0.4 nM (n= 7);伐地那非,0.091±0.031 nM (n= 5)。当使用本地牛PDE5也获得了类似的值(数据没有显示)。这些值同意发表IC的范围50值(西地那非,1 - 9 nM (巴拉德et al ., 1998;Turko et al ., 1999;卡宾和弗朗西斯,2002);他达拉非1 - 7海里(卡宾et al ., 2002;Gresser和格雷特,2002年);伐地那非,0.1 - -0.8 nM (萨斯博士德Tejada et al ., 2001;Gresser和格雷特,2002年;卡宾et al ., 2002)]。
化学计量的3H PDE5抑制剂具有约束力。结合化学计量学是确定每个抑制剂除以最大绑定(B马克斯,皮摩尔3H PDE5抑制剂结合每毫升)获得GraphPad棱镜图形,由PDE5酶浓度(PDE5的皮摩尔的PDE5单元每毫升)。PDE5蛋白质是由氨基酸浓度分析。化学计量学是纠正恢复75%3H PDE5抑制剂绑定使用真空过滤方法确定之前(卡宾et al ., 2003)。(3H]他达拉非绑定到PDE5化学计量数为0.68±0.10摩尔/亚基(n= 7),类似于(3H]伐地那非化学计量学0.41±0.05摩尔/亚基(n= 8)。这些值与化学计量学相比之前报道(3H]西地那非(0.61±0.13摩尔/亚基(卡宾et al ., 2003)。(3H]西地那非绑定化学计量学是重复使用相同的酶制剂用于确定(3H]他达拉非和[3H]伐地那非化学计量值计算。
特异性的3H PDE5抑制剂具有约束力。的特异性3H]西地那非绑定的催化域PDE5提出了在我们以前的报告(卡宾et al ., 2003)。的特异性3H]他达拉非和[3H]伐地那非绑定PDE5测定测试使用4海里各种标记化合物的影响3H和重组牛PDE5抑制剂(图2)。240倍的无标号西地那非,他达拉非、伐地那非废除(3H]他达拉非或[3H]伐地那非绑定。的营地或5′gmp在375000倍超额并不影响绑定的抑制剂。在375000倍超额,cGMP的绑定3H抑制剂40 - 60%。2400倍超额rolipram (PDE4-specific抑制剂)或cilostamide (PDE3-specific抑制剂)没有影响3H抑制剂具有约束力。IBMX,一般,虽然弱,PDE抑制剂在100000倍超额有很大的抑制作用。绑定的数据显示这三个特定的催化域PDE5抑制剂,所有三个抑制剂争夺相同的网站。
缺乏绑定的3一个孤立的管理域的PDE5抑制剂。而[3H] cGMP绑定到孤立的监管领域PDE5近化学计量的,没有一个3H抑制剂绑定到该域使用相同的试验条件和浓度的研究中使用的绑定到全身PDE5(数据没有显示)。添加多余∼5倍(0.96μM)的无标号西地那非、他达拉非,或伐地那非,这是在1000倍的范围KD每个抑制剂的催化领域,不低(3H] cGMP绑定到监管域(数据未显示)。相比之下,2500倍(0.5毫米)的无标号cGMP,也是大约1000倍KD这个配体的催化域,废除了3H] cGMP绑定到监管领域。在一起,这些结果表明为PDE5抑制剂特定催化域和不绑定到管理域的条件下分析。
的效能(亲和力)绑定的3H PDE5抑制剂。的浓度依赖性3H抑制剂([3H]西地那非,[3H]他达拉非,或[3H]伐地那非)绑定到PDE5所示图3。KD值,获得与GraphPad棱镜软件,通过非线性回归分析如下:西地那非,4.8±0.8 nM (n= 3);他达拉非,2.4±0.6 nM (n= 4);伐地那非,0.38±0.07 nM (n= 5)。这些值同意IC50值报告上面。
效能为西地那非、他达拉非和伐地那非也取决于竞争的研究。例如,图4显示的效果增加浓度的无标号伐地那非绑定3 nM (3他达拉非H)。欧共体50值从GraphPad棱镜计算图形软件使用s形的剂量反应曲线。因为电子商务50价值观决定使用3H抑制剂浓度近似KD值对PDE5,程和Prusoff /周方程(程和Prusoff, 1973;周,1974)可以应用于计算KD从电子商务50通过将电子商务50值由两个(表1)。可以看出,½EC50在一般的协议KD或集成电路50对于每个抑制剂,抑制剂和效力的顺序是保留。3½EC50值标记抑制剂在竞争(3H]伐地那非,[3H]西地那非,或[3H]他达拉非是相同的。这表明PDE5抑制剂争夺相同的网站。
西地那非、伐地那非类似物的效能。伐地那非对PDE5∼40倍高亲和力在西地那非取自IC50这里显示值。确定哪些区别的两种化合物的分子特性决定了这种差异在效力,两个类似物合成。第一,demethyl-vardenafil,包含了[1 - 5f][1、2]的附加甲基三嗪环伐地那非和西地那非。第二模拟、methyl-sildenafil包含pyrazolo [4 3 -d]嘧啶环的西地那非和伐地那非的附加乙基。的集成电路50每个模拟对PDE5的决心使用0.4μM [3H] cGMP作为衬底。这些实验取得了集成电路50值为0.14±0.02 nM demethyl-vardenafil和8.90±1.7 nM methyl-sildenafil (表2)。欧共体50为每个模拟确定使用0.5 nM (3伐地那非H)。电子商务50值分别为0.88±0.19 nM demethyl-vardenafil methyl-sildenafil 72±13海里。KD计算从½EC50与集成电路一般协议吗50为每个模拟(表2)。结果表明,较高的生化力量伐地那非的西地那非是由差异的双重环两种化合物。
异质性的PDE5催化域了3H抑制剂分解动力学。每个Exchange-dissociation动力学3H从PDE5抑制剂。PDE5第一次被饱和3H抑制剂(30 nM)和整除被确定30次H抑制剂具有约束力。无标号抑制剂(∼33000倍)被添加到反应混合物,和整除被过滤在不同时期跟随时间的离解(交换)的放射性标记的酶的抑制剂。在这些条件下,酶保持饱和与抑制剂在任何时候。所有三个抑制剂表现出非线性分离动力学表明的存在至少两个组件(速度图5)。在图5 b,x设在改为强调之前的时间点。假设两个组件的存在,当最慢的部分是外推y设在,两个组件的计算百分比为每个抑制剂是不同的。西地那非,报道之前,表现出两个相等的部分。的离解行为(3H]他达拉非显示60%的高亲和性(缓慢)和40%低亲和力(fast)组件。(3H]伐地那非离解表现出85%的高亲和性和15%低亲和力的组件。整体的离解率(3H]伐地那非是比其他两种抑制剂的慢得多。估计后t1/2离解,KD经过计算得出每个抑制剂的以下方程:KD= 6.93×107M·s /t1/2M =摩尔,s =秒,t1/2以秒。(Limbird 1995)。与每个所有exchange-dissociation实验进行三次3H抑制剂。由此产生的KD值两个(3H]西地那非成分分别为14.7±2.3,0.7±0.06 nM,两个(3H]他达拉非组件分别为9.3±2.67,0.6±0.00 nM,和两个3H]伐地那非组件分别为6.0±0.00,0.1±0.01海里。几何均值KD值为每个抑制剂(n= 3)以下:西地那非,3.1海里;他达拉非1.7 nM;伐地那非,0.32海里。每一个平均KD由该方法类似于IC50,KD从等温线,或KD从½获得欧共体50。集成电路之间的相似性50值和平均KD分离率的值确定各自的抑制剂建议抑制剂与动力学组件的交互有助于抑制PDE5催化活性。
除了上面的exchange-dissociation方法中,(3H]他达拉非或[3H]伐地那非离解从PDE5被无限稀释了。离解的放射性标记的抑制剂在没有确定,存在过剩的无标号抑制剂平衡绑定和80倍稀释后绑定的反应。的模式3H]他达拉非离解(图6)显示两个组件的存在与否无标号的5000倍超额他达拉非离解。无标号的缺乏影响他达拉非的离解(3H]他达拉非从PDE5表明,尽管PDE5二聚的催化域的每个各自的单体酶可能不活动相互影响在很大程度上。同样,分离的3H]伐地那非无限稀释后不是多余的存在不同的伐地那非,再次表明PDE5催化域的两个单体独立函数(图6 b)。
cGMP影响3H抑制剂具有约束力。我们最近报道,cGMP刺激(3H]西地那非绑定在4°C (PDE5催化领域卡宾et al ., 2003)。除了确定相同的cGMP效应发生(3H]伐地那非和[3H]他达拉非,如果cGMP刺激,我们还调查了3H抑制剂绑定在30°C,接近生理温度。增加4°30°C的温度没有影响或者稍微抑制西地那非和他达拉非绑定(数据没有显示)。然而,温度的提高,增加了伐地那非绑定的cGMP,下面讨论。
增加环鸟苷酸浓度的影响(3H]伐地那非绑定使用0.5 nM [3H]伐地那非在4°和30°C (图7)。在4°C, (3上升了2.5倍。H]伐地那非绑定在低水平的cGMP(1-50μM),尽管这种效应减弱cGMP浓度更高。重复实验与增加cGMP产生了∼30°C的刺激(3.5倍3H]伐地那非绑定PDE5 30°C。cGMP的效果保持不变在中等浓度和减弱略cGMP浓度非常高。
当绑定使用浓度增加(3H]伐地那非执行30°C的常数10μM cGMP,绑定到PDE5的标记化合物亲和力稍微高于在4°C(0.42±0.06海里,n= 3,而0.59±0.02海里,n= 3)。3H]伐地那非绑定PDE5没有cGMP 30°C较低KD比发现(3在4°C H]伐地那非绑定(0.74±0.10海里,n= 3,而2.19±0.62海里,n= 3)(图8,A和B)。
添加10μM cGMP浓度增加(3在4°C H]伐地那非的下降KD(0.74±0.10海里,n= 3,0.59±0.02海里,n= 3)而增加B马克斯对PDE5 (5.63±0.38, 6.58±0.10 pmol /毫升)(图8)。在30°C, cGMP造成3.6倍下降KD从2.19±0.62 nM (n= 3)0.42±0.06 nM (n= 3),而B马克斯没有明显变化(4.93±0.71和5.25±0.22 pmol /毫升)(图8 b)。
所示图9,cGMP也刺激绑定3 nM (3在4°C H]他达拉非,∼25μM cGMP的影响是最大的。刺激效应减弱cGMP更高浓度的方式类似于cGMP影响伐地那非绑定在4°C。添加10μM cGMP浓度增加(3在4°C H]他达拉非下降KD从3.7±0.39 nM(∼2倍n= 3)1.74±0.05 nM (n= 3),而B马克斯为4.97±0.14,5.95±0.19 pmol / ml,分别为(图10)。
合并后的结果表明,[3H]伐地那非,但不3H]西地那非或[3亲和力较高的H]他达拉非结合PDE5 30°C比在4°C。所有三个抑制剂的亲和力增加cGMP的存在,而最大绑定的抑制剂被cGMP仅略有增加。
讨论
(3H]西地那非绑定PDE5特定的催化部位PDE5 (卡宾et al ., 2003)。目前的报告表明,(3H]他达拉非和[3H]伐地那非催化部位也具体的绑定。结合三种3H抑制剂是抑制催化site-selective代理和无标号西地那非,他达拉非,或伐地那非,这表明绑定的抑制剂仅限于这三种抑制剂的催化域和也绑定到相同的催化部位。的化学计量学3H绑定接近1摩尔/ PDE5抑制剂亚基,这是符合抑制剂具有约束力的具体催化部位,也表明每个PDE5单体一个催化部位。
PDE5的孤立的监管领域没有绑定3H抑制剂使用相同的绑定试验用于PDE5酶虽然监管域绑定(3H] cGMP近化学计量的。此外,标记西地那非、他达拉非或伐地那非没有竞争与3H] cGMP绑定到监管领域,确认这些抑制剂不绑定到监管领域。KDEC值由绑定等温线50,或者exchange-dissociation同意IC50的抑制剂,再次支持结论PDE5-specific PDE5抑制剂只与催化交互的地点。因为cGMP-binding网站PDE5监管和催化域进化和不同的生化反应,这个结果并不令人感到意外。
这个实验室已经使用膜真空过滤测量(3H] cGMP绑定(弗朗西斯和卡宾,1988年),65年锌绑定(弗朗西斯et al ., 1994)和(3H]西地那非绑定(卡宾et al ., 2003)。这个试验是小幅修改特定的(3H]他达拉非和[3H] PDE5伐地那非绑定。所有三个3H抑制剂具有约束力的化验,产生了高恢复,取得了近1摩尔/亚基绑定。放射性标记的rolipram绑定PDE4已经报道(施耐德et al ., 1986;Torphy et al ., 1992);然而,结合化学计量学的这些研究还不到0.01摩尔/使用膜过滤单元。
集成电路50值的西地那非、他达拉非和伐地那非决定在肉搏战化验使用牛PDE5 IC一样的范围50值在文献报道使用人类PDE5 (表3)(卡宾和弗朗西斯,2002;卡宾et al ., 2002)。使用重组PDE5因此,结果是相似的,本机PDE5或PDE5从不同的哺乳动物物种。而集成电路50是经典的方法确定PDE的效力(亲和力)抑制剂,粘结强度测量,还是KD,是一个更直接的方法确定效力,它还提供了一个衡量化学计量的配体结合。这份报告确定为西地那非的效力,他达拉非,伐地那非使用四个单独的直接方法。集成电路50测量了1:2:41的效价比,KD(绑定等温线)产生1:2:13的比率,KD(½EC501:5:26)产生了一个比率,KD(exchange-dissociation)产生一个比1:2:14西地那非、他达拉非,伐地那非,分别为(表3)。这次调查是最全面的检查这些药物的绝对和相对的效能。
离解率从PDE5抑制剂与效能取决于集成电路50或等温线KD,即,slower the rate, the higher the potency. However, the faster dissociation rate of tadalafil from PDE5 compared with that of vardenafil may be unexpected in view of the longer lasting clinical effects of tadalafil. These clinical differences of tadalafil may be caused by pharmacokinetic considerations such as slower intestinal absorption or slower degradation by the liver, rather than by different biochemical properties.
比较独特的化学结构的西地那非、伐地那非,两个主要的差异是明显的:1)一个甲基哌嗪环的附加到西地那非,而同样的戒指伐地那非附加乙基,和2)氮原子存在于双圈的7-position西地那非,但它不是出现在伐地那非的戒指,虽然5-position伐地那非包含一个氮原子,在西地那非缺席。解决这些结构性差异的化合物决定力量,两个类似物合成:demethyl-vardenafil(模拟包含附加的伐地那非的甲基西地那非)和methyl-sildenafil(模拟包含附加的西地那非的乙基伐地那非)。Demethyl-vardenafil伐地那非和几乎相同的集成电路50值,而methyl-sildenafil 52次更高的集成电路50岁,这是类似于集成电路吗50西地那非。KD从电子商务获得值50实验使用类似物还表示,methyl-sildenafil效力低得多的比其他两个类似物。从这些结果,更高的伐地那非生化力量与西地那非是由差异的双重环两种化合物。的晶体结构PDE5催化域名包含西地那非、伐地那非是近日报道(唱et al ., 2003);然而,晶体结构的分辨率也不足以识别不同的相互作用这两个酶的抑制剂。伐地那非的双重环的差异,与西地那非相比,可能允许强相互作用的化合物和一个或多个氨基酸(如酪氨酸- 612,val - 782,板式换热器- 820,亮氨酸- 785和gln - 817),这可能是重要的绑定双人类PDE5抑制剂(环唱et al ., 2003)。此外,氮原子的位置在伐地那非双戒指可能传授改变原子或一组分子提供接触残留不联系了西地那非或提供一个间接接触造成双重环中的电子分布的变化。
使用的三个Exchange-dissociation实验3H抑制剂显示曲线分离动力学,表明存在两个或两个以上的催化部位组件。抑制剂之间有明显的联系强度和高亲和性的百分比(缓慢)组件的绑定。这可能意味着三1)3H抑制剂选择不同的绑定两个既存PDE5的数量有不同的亲和力;2)抑制剂有不同的促进一个人口转换到另一个的效能;或3)两者的结合机制。解离的3H抑制剂引起的无限稀释也显示异构动力学。一个可能的解释的存在两个或两个以上的组成部分3H离解,PDE5抑制剂存在于不同的构象(弗朗西斯et al ., 1998)。PDE2 (Manganiello et al ., 1990)和PDE4 (拉利伯特et al ., 2000)也证明了动态异构性,解释为代表不同的酶构象。本报告是第一个广泛证明PDE5催化部位展示多个运动状态,但是否存在所造成的不同的PDE5构象还有待证明。这不能排除PDE5准备期间进行部分修改,这可以解释观察到的异质性,虽然两个组件的存在是观察在不同的重组PDE5和本地PDE5的准备工作。无论如何,谨慎现在必须被用于解释绑定等温线KD假设存在一个单独的组件的值计算(卡宾et al ., 2003)。
协同PDE5抑制剂结合的可能发生如果绑定的抑制剂的两个亚基的催化部位影响绑定到其他单元。然而,抑制剂离解无限稀释后多余的无标号的缺失和存在抑制剂表明情况并非如此,至少条件下用于实验。
而PDE5催化活性的分子机制刺激cGMP绑定到监管领域是未知的,建议cGMP绑定到该域缓解PDE5 autoinhibitory约束,此时催化部位的填充subsaturating衬底cGMP水平是促进,增加催化活性。这种负面的反馈机制促进细胞内的cGMP的快速退化。这个负面的反馈可以勃起功能障碍患者的问题,他们无法保持高水平的cGMP的阴茎海绵体扩展所需的时间达到和维持阴茎勃起。这种潜在的缺陷显然是克服的存在nonhydrolyzable PDE5抑制剂特定催化部位。抑制剂可能会增加cGMP水平通过阻止负面的反馈过程,同时增加cGMP水平的竞争。
因为cGMP刺激绑定的3H]他达拉非和[3H]伐地那非,以及3H]西地那非,PDE5催化网站,不是inhibitor-specific cGMP刺激。因此,cGMP刺激也应该低水平的药物可以导致平滑细胞放松管理,应该尽量减少副作用和安全问题。
相对较高的浓度(1 - 25μM) cGMP要求刺激最大的绑定(3H]他达拉非和[3伐地那非H)。这个浓度是异常高表示,考虑到以前的结果KDcGMP绑定到0.2μM GAF域(托马斯et al ., 1990 b)。明显的差异可能导致的不同试验条件下用于测量绑定的亲和力3H] cGMP,3H抑制剂。另一方面,尽管它已经显示到目前为止只cGMP结合的高亲和性GAF一个网站(刘et al ., 2002),高浓度的cGMP要求刺激3H PDE5抑制剂绑定显示额外的GAF绑定到一个较低的亲和力b网站,这可能导致增加了配体催化网站亲和力。
确认
我们感谢大卫伍德博士优秀的建议在这个手稿的准备。我们感谢拜耳提供PDE5抑制剂类似物。我们感谢埃里克·霍华德的范德比尔特大学蛋白质氨基酸分析化学的核心。我们也感谢e·布朗森英格拉姆癌症中心和范德比尔特大学的糖尿病中心。
脚注
这项工作是由美国国立卫生研究院的研究资助DK40029 DK58277,国立卫生研究院培训资助5 t32 hl - 07751和拜耳制药公司。
缩写:PDE,环核苷酸磷酸二酯酶;GAF,哺乳动物cGMP-binding磷酸二酯酶,淡水藻类的一种一个denylyl环化酶,大肠杆菌FhlA;IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine;进一步强化,10毫米磷酸钾,pH值6.8,包含β-mercaptoethanol 15毫米。
- 收到了2004年1月21日。
- 接受2004年4月9日。
- 美国社会的药理学和实验性疗法