文摘gydF4y2Ba
的cGMP-binding cGMP-specific磷酸二酯酶(PDE5)降解cGMP,调节细胞内的cGMP水平在许多组织,包括阴茎海绵体平滑肌的阴茎。西地那非(伟哥),一个特定的PDE5抑制剂,促进阴茎勃起通过阻断PDE5的活动,导致阴茎海绵体cGMP积累。在目前的研究中,西地那非,就像其他PDE5抑制剂,刺激cGMP绑定PDE5的变构网站互动在这种酶的催化部位,但药物并不与cGMP变构为绑定网站竞争。西地那非和敏喘宁竞争PDE5抑制剂,和double-inhibition分析表明,这两种抑制剂加在一起相互作用的催化部位PDE5相互排斥的方式。定点诱变后的23个保守氨基酸残基在催化领域的PDE5的模式集成电路的变化gydF4y2Ba50gydF4y2Ba西地那非或英国的值- 122764类似于发现敏喘宁。然而,三国抑制剂,西地那非展品最相似的IC的变化模式gydF4y2Ba50gydF4y2Ba发现cGMP的亲和力,暗示类似与催化域的交互。这或许可以解释在一定程度上抑制能力越强的西地那非与其他相比野生型PDE5抑制剂西地那非(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba英国- 122764(> = 1海里)gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba> = 5海里)敏喘宁(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 130海里)]。这些对PDE5抑制剂的亲和力是远远高于cGMP的本身(gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 2000海里)。结果表明,酪氨酸等残留物gydF4y2Ba602年gydF4y2Ba,他的gydF4y2Ba607年gydF4y2Ba,他的gydF4y2Ba643年gydF4y2Ba,AspgydF4y2Ba754年gydF4y2Ba可能形成重要的交互PDE5的西地那非,但是因为这些氨基酸是守恒的在所有哺乳动物的pd,西地那非的选择性和力量可能是由nonconserved残留或残留PDE5催化领域。gydF4y2Ba
的分子机制管理收缩/舒张平滑肌已经相当大的研究对象(复习,看到gydF4y2BaSomlyo Somlyo, 1994gydF4y2Ba)。平滑肌的基调是由胞质(Ca的变化gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba]。内皮细胞介导血管平滑肌的松弛的作用已经明确(gydF4y2BaFurchgott 1984gydF4y2Ba;gydF4y2BaIgnarro et al ., 1987gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕默et al ., 1987gydF4y2Ba),一氧化氮/ cGMP系统是一个重要的组件在细胞(Ca的调制gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba]cGMP-dependent机制涉及激活的蛋白激酶(gydF4y2Ba弗朗西斯et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2Ba林肯et al ., 1994gydF4y2Ba)。因为cGMP生成细胞第二信使,耦合到放松,合成剂,改变细胞内cGMP水平可能会有显著的临床意义oxide-mediated氮条件,cGMP-dependent放松受损。高功效的新治疗代理西地那非(伟哥)治疗男性阳痿(gydF4y2BaBoolell et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杰里米et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2Ba巴拉德et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba壮族et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba·莫兰et al ., 1998gydF4y2Ba)是这样的一个例子。gydF4y2Ba
西地那非是一种选择性和强有力的抑制剂cGMP-binding cGMP-specific磷酸二酯酶(PDE5), cGMP的催化水解。因此,这种抑制会导致细胞cGMP的高程。牛、鼠和人类PDE5的互补代表单个基因,PDE5A,编码蛋白质与高度的保护(gydF4y2BaMcAllister-Lucas et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2BaKotera et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2BaLoughney et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯泰西et al ., 1998gydF4y2Ba)。序列比对人类PDE5的牛和老鼠身份序列揭示了95%和93%,分别最高的变化发生在极端的氨基酸。不同的剪接变体PDE5已报告(gydF4y2BaKotera et al ., 1997gydF4y2Ba;gydF4y2BaLoughney et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯泰西et al ., 1998gydF4y2Ba),但这些PDE5s的主要特性,如催化领域,cGMP-binding域,和磷酸化共识,守恒的。PDE5非常丰富的血管平滑肌细胞,似乎发挥重要作用在调节平滑肌的语气,尤其是阴茎提一个有关海绵体平滑肌语料库的语气。PDE5抑制剂被广泛的潜在的治疗应用综述(gydF4y2BaSybertz et al ., 1995gydF4y2Ba;gydF4y2BaCzarniecki et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2BaSekhar et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba1996银,gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
使用定点诱变,我们最近研究的贡献23守恒的催化域的氨基酸的催化功能和抑制PDE5经典PDE5抑制剂敏喘宁(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。西地那非和它的导数,英国- 122764,结构与敏喘宁。本研究的目的是开发一种改进的理解分子基础为底物和抑制剂绑定PDE5通过使用一组相关的结构性PDE5抑制剂和评价抑制剂作用后,改变单一氨基酸PDE5的催化部位。gydF4y2Ba
实验程序gydF4y2Ba
材料。gydF4y2Ba
(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP购买从Amersham生命科学公司(阿灵顿高地,IL)。cGMP,gydF4y2BaCrotalus atroxgydF4y2Ba蛇毒,3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),和敏喘宁从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。羟磷灰石(HTP凝胶)从Bio-Rad(大力神,CA)。英国- 122764和西地那非是由辉瑞公司研究中心(英国三明治)。gydF4y2Ba
定点诱变。gydF4y2Ba
cGB-8/14克隆编码一个长篇牛肺PDE5 (gydF4y2BaTurko et al ., 1996gydF4y2Ba)。QuikChange定点诱变工具包(Stratagene拉霍亚,CA)已经被用于制造点突变在pBacPAK9 cGB-8/14克隆表达载体(Clontech,帕洛阿尔托,CA)根据Stratagene协议。24个氨基酸突变体生成:Y602A Y602F, H602A, N604A, H607A, E632A, H643A, D644A, H647A, N652A, E672A, H674A, H675A, T713A, D714A, D754A, S756A, K760M, E775A, F776L, Q779A, G780A D781A, E783A。为了避免理论上可能的随机突变,1073 - bp包含所需的突变基因片段被切除cGB-8/14使用gydF4y2BaKpngydF4y2Ba我/gydF4y2BaBstgydF4y2Ba1107我消化和resubcloned pBacPAK9向量中的野生型cGB-8/14克隆网站使用相同的限制。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaXL1-blue细胞用于所有转换。DNA片段被freeze-squeeze纯化方法从琼脂糖片使用旋转x离心机过滤单元(配角、剑桥、马)。DNA是从大规模向量准备使用试剂盒纯化质粒马克西装备根据制造商的协议(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA)。所有的DNA片段进行诱变和subcloning反应是测序的,以确保所需的突变的存在和适当的在坐标系subcloning。gydF4y2Ba
野生型和突变PDE5s的表情。gydF4y2Ba
Sf9细胞cotransfectedgydF4y2BaBsugydF4y2Ba36我领悟了BacPAK6病毒DNA (Clontech,帕洛阿尔托,CA)和一个突变cGB-8/14克隆的pBacPAK9表达载体的脂质转染方法根据Clontech协议。在3天postinfection cotransfection上层清液收集,放大两次Sf9细胞,然后直接使用病毒股票重组病毒的表达没有额外的净化。高5细胞生长在27°C完成格蕾丝的昆虫媒介(表达载体,卡尔斯巴德,CA)与10%的边后卫和10毫克/毫升庆大霉素在t - 185的玻璃瓶被感染了病毒股票5毫升/瓶。培养基,含有大多数PDE5在96 h postinfection收获。gydF4y2Ba
野生型和突变PDE5s的净化。gydF4y2Ba
从240年到260毫升的培养基是由连续的硫酸铵分级沉淀在4°C。沉淀比例以25%对40%的饱和是resuspended 30毫升10毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.2,离心机,享年48000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。上层清液被加载到一个羟磷灰石柱与10毫米(1.5×15厘米)平衡钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.2。列是用100毫升70毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.2,然后筛选了120毫米磷酸钠缓冲区,pH值7.2,5毫升/小时的流量。池包含PDE5活性稀释六卷的冰冷的去离子水和集中大约1毫升使用Amicon过滤单元配有PM-30膜。净化步骤都是在4°C。最后的准备是存储在20%甘油−70°C。gydF4y2Ba
量化的PDE5浓度。gydF4y2Ba
总蛋白浓度测定的方法gydF4y2Ba布拉德福德(1976)gydF4y2Ba使用BSA作为标准。确定PDE5蛋白质含量,考马斯亮中SDS-polyacrylamide野生型和突变体酶的凝胶扫描使用英汉仪器公司密度计配备GS370 v.3.0 Hoeffer软件。PDE5蛋白质浓度计算分数的PDE5乐队乘以总蛋白浓度与布拉德福德的使用试验确定。PDE5蛋白质浓度转换成摩尔PDE5浓度,分子量的PDE5的价值98.5 kDa (PDE5的计算从氨基酸序列)是使用。gydF4y2Ba
PDE5的催化活性。gydF4y2Ba
PDE活性测定使用前面描述的修改分析过程(gydF4y2Ba托马斯et al ., 1990gydF4y2Ba)。孵化混合物包含40毫米3 - (gydF4y2BaNgydF4y2Ba吗啉代)propanesulfonic酸性,pH值7.5,0.5毫米EGTA, 15毫米醋酸镁,0.15毫克/毫升BSA, 0.5μM cGMP(除非另有说明),(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP(100000 - 150000年cpm /试验)和PDE5的样本,250μl的总量。在这些条件下,反应速率大约是线性超过10分钟的野生型和突变体蛋白测试,和一个孵化时间10分钟30°C被选为所有动态测量。反应停止把管在沸水浴冷却3分钟。之后,20μl 10毫克/毫升gydF4y2Bac . atroxgydF4y2Ba蛇毒是补充说,其次是一个20分钟孵化30°C。核苷产品分开列的未反应的核苷酸DEAE-Sephadex 25三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液平衡与20毫米,pH值7.5,计算在内。在所有的研究中,不到总数的15% (gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP中水解反应。确定集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba英国- 122764的值或西地那非,PDE活性在重复化验的存在范围广泛的抑制剂浓度。gydF4y2Ba
变构cGMP绑定。gydF4y2Ba
cGMP绑定进行化验的总量60μl包含20毫米磷酸钠缓冲区,pH值6.8,2毫米EDTA,β-mercaptoethanol 25毫米,0.5μM [gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP,一系列不同的抑制剂浓度。的反应是由酶的添加一个整除。30分钟后孵化在冰上,测定混合物被过滤到premoistened微孔HAWP过滤器(孔隙大小,0.45μm),然后清洗四次共有4毫升的冷20毫米磷酸钠缓冲区,pH值6.8,2毫米EDTA然后干统计。非特异性结合的数据修正了减法,这被定义为(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定在缺乏PDE5或(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定的无标号cGMP的多余100倍。类似的2 - 4%的非特异性结合与每个方法获得gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
其他方法。gydF4y2Ba
SDS-polyacrylamide 10%聚丙烯酰胺凝胶中凝胶电泳和免疫印迹分析抗体对本机PDE5从牛肺进行如前所述(gydF4y2BaMcAllister-Lucas et al ., 1995gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
理由选择抑制剂。gydF4y2Ba
因为经典PDE抑制剂通常竞争抑制剂环核苷酸基板的一个逻辑设计PDE5抑制剂的方法是使用一个杂环核,模仿鸟苷cGMP的一部分,附加取代基,可以填补空间被磷酸核糖和/或循环和繁殖的贡献或这两个两组在催化底物结合网站(gydF4y2BaSekhar et al ., 1996gydF4y2Ba)。敏喘宁是一个相对选择性的PDE5抑制剂被广泛用于加强一氧化氮的影响,nitrovasodilators或心房利钠因子在靶细胞胞内cGMP水平起着重要的作用在调节细胞功能(gydF4y2Ba哈里斯et al ., 1989gydF4y2Ba;gydF4y2Ba麦克马洪et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2BaIchinose et al ., 1995gydF4y2Ba)。从结构上看,英国- 122764和西地那非与敏喘宁和cGMP(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。3′pyrazolopyrimidone核取代基的英国- 122764或西地那非可填补核糖占用的空间,和5′苯基环上的取代基西地那非模仿作用底物环磷酸的绑定。英国除了敏喘宁- 122764和西地那非可以被认为是代表一组PDE5抑制剂sterically模仿cGMP的结构。gydF4y2Ba
的决心gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值抑制PDE5活性。gydF4y2Ba
来确定gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值为每个抑制剂,山坡上的个人双重相反情节从最初的cGMP水解生成使用不同浓度的cGMP和抑制剂被改建为一个函数相应的抑制剂的浓度(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。每条线的交点与水平轴给−gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值。的gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba价值观决定使用指定的条件是130海里敏喘宁(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba5),英国- 122764 nM(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaB),并为西地那非(图1海里。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC)。这些值重组PDE5从牛肺符合出版的值(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 2 nM为西地那非,gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 250 nM敏喘宁)对PDE5从人类阴茎海绵体平滑肌细胞(gydF4y2Ba·莫兰et al ., 1998gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Double-Inhibition分析。gydF4y2Ba
Double-inhibition进一步分析被用来描述由西地那非PDE5抑制机制,英国- 122764,和敏喘宁。这种方法测试两种抑制剂是否互斥或绑定在不同的子站在substrate-binding口袋里。环鸟苷酸水解的初始利率固定subsaturating cGMP的浓度([S]
刺激的变构cGMP绑定。gydF4y2Ba
PDE5展品变构cGMP-binding网站不同于环鸟苷酸水解。cGMP-binding试验措施绑定cGMP的变构网站,不检测绑定到催化部位(gydF4y2Ba弗朗西斯et al ., 1980gydF4y2Ba)。从最早的PDE5的研究,已经明显PDE5抑制剂如IBMX或双嘧达莫提高(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定活动2 - 4倍在试验条件下没有水解的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP观察到(gydF4y2Ba原作者和Coquil, 1978gydF4y2Ba;gydF4y2Ba弗朗西斯et al ., 1980gydF4y2Ba;gydF4y2Ba托马斯et al ., 1990gydF4y2Ba)。一些cGMP类似物等gydF4y2BaNgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-hexyl-cGMP特定的催化部位也刺激gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定活动在同等条件下(gydF4y2Ba弗朗西斯et al ., 1980gydF4y2Ba)。相信PDE抑制剂和cGMP类似物刺激gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定的变构网站绑定酶的催化部位。因为西地那非具有高亲和力的PDE5催化网站(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 1海里),据推测,模仿cGMP结构,问题出现了西地那非是否也会与cGMP-binding变构PDE5的网站。图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表明敏喘宁、英国- 122764和西地那非刺激gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP约束力的约2倍。IBMX展品相同(图2倍的效果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB),是本研究中使用的是一个积极的控制。事实上,这两个催化部位抑制剂争夺(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] cGMP绑定PDE5的变构网站表明,尽管他们结构相似性cGMP,这些抑制剂并没有显著的变构互动网站。gydF4y2Ba
诱变的原理。gydF4y2Ba
使用选定的催化域突变体的基本原理是部分基于我们以前观察的氨基酸序列PDE5残留602年和783年之间重要的底物选择性、催化功能,抑制剂效力(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)。图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba显示PDE5的氨基酸序列在守恒的催化领域,在目前的研究目标。单一保守氨基酸取代检查的官能团参与西地那非和英国- 122764绑定。大量的动力学属性(gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2BacGMP,gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba,集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba这些突变PDE5s敏喘宁)已报告之前(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
野生型和突变PDE5s表达和纯化。gydF4y2Ba
所有PDE5s表达五高的细胞。表达水平的突变体与野生型的酶(数据未显示),在1到6毫克PDE5/100毫升的文化(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。野生型和突变PDE5s部分纯化(约5 - 20%纯度)从培养基用硫酸铵沉淀和羟磷灰石层析中描述gydF4y2Ba实验程序gydF4y2Ba。图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba显示了一个免疫印迹分析部分羟磷灰石柱一步纯化后获得的突变体。SDS-polyacrylamide凝胶电泳,所有突变PDE5s迁移与基本相同的流动的野生型酶。这表明所有突变PDE5s表示为完整的蛋白质。gydF4y2Ba
集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba决定。gydF4y2Ba
集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba英国- 122764和西地那非(图的值。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)已被确定在0.5μM cGMP的底物浓度,这是在所有情况下低于gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba这些突变体(值gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。为了能够比较不同PDE5s,相对ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值(表gydF4y2Ba1gydF4y2BaIC)计算gydF4y2Ba50(突变)gydF4y2Ba值除以ICgydF4y2Ba50(野生型)gydF4y2Ba价值。相对集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值允许一个特定的效力为每个PDE5抑制剂突变体与野生型酶的效力。集成电路增加了10倍gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值产生一个自由能的变化(ΔΔG抑制剂绑定gydF4y2Ba绑定gydF4y2Ba)约为1.4千卡/摩尔(gydF4y2Ba1986年安德鲁斯gydF4y2Ba;gydF4y2Ba救生员et al ., 1995gydF4y2Ba)。因为这个值是接近下限的氢键形成的残留物,如可由他,Glu、Asp残留物(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),IC的变化gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值突变的残留少于10倍被认为是不足以提出一个重要的抑制剂绑定接触这些残留物(gydF4y2BaFersht et al ., 1985gydF4y2Ba)。唯一的突变,大大削弱英国- 122764是Y602A PDE5绑定,这导致了22倍增加ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。所有其他的变化发现突变体并不足以表明一个至关重要的角色,这些残留在英国- 122764绑定。最大的提高集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值为西地那非(25倍)也发现Y602A突变体(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。D754A,其他四个突变体(H607A H643A和E775A)表现出温和增加IC (10 - 13)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba价值。ΔΔG的预期值gydF4y2Ba绑定gydF4y2Ba最大值,也可能包括损失的结合能小扰动的整体构象酶。因此,残留的角色的替代导致温和IC的变化gydF4y2Ba50gydF4y2Ba无法明确解释。这四个残留物,或它们的任何组合,可以直接与西地那非交互。或者,他们可能是唯一保持催化部位的总布置。gydF4y2Ba
进一步调查的功能酪氨酸- 602在英国- 122764和西地那非绑定,酪氨酸- 602也被替换为苯丙氨酸。苯丙氨酸残基可以模仿一个潜在的疏水性的贡献酪氨酸等参与堆积相互作用,但它不包含提供氢键的一群。Y602F突变增加了对抑制敏感的每两个抑制剂(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。的集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值是4倍低于野生型酶(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这强烈支持这样的结论:酪氨酸gydF4y2Ba602年gydF4y2Ba催化部位的PDE5栈pyrazolopyrimidone核的英国- 122764或西地那非。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
既然PDE5已被确定为一个主要的目标治疗男性阳痿的药物(gydF4y2BaBoolell et al ., 1996gydF4y2Ba),以及其他疾病进程(gydF4y2Ba膜et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2Ba克拉克et al ., 1994gydF4y2Ba),这种蛋白质可以被用于基于结构的药物设计方法。这需要仔细定义的地形PDE5衬底的网站,这是西地那非和其他实验药物的分子的目标。动力学分析PDE5抑制结合扫描诱变收益率有价值的信息,特别是在缺乏解决三级结构。最近,定点诱变PDE5催化域的显示,尽管敏喘宁PDE5抑制竞争的本质,残留的重要底物和抑制剂绑定PDE5的催化部位是不相同的。酪氨酸gydF4y2Ba602年gydF4y2Ba和GlugydF4y2Ba775年gydF4y2Ba已被证明是至关重要的底物结合,但Asp呢gydF4y2Ba754年gydF4y2Ba和通用电气gydF4y2Ba780年gydF4y2Ba对与敏喘宁(交互至关重要gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
本研究的结果表明,敏喘宁,英国- 122764和西地那非与PDE5的催化部位以互斥方式,这些化合物不与别构cGMP-binding网站交互PDE5任何明显的程度。后者观察我们的建议是一致的,变构cGMP-binding网站和PDE5的催化部位循环nucleotide-binding网站的代表两个不同的家庭有不同的环核苷酸的结构要求绑定(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。它遵循的变构cGMP-binding PDE2 PDE6场所也不太可能与西地那非。这些变构网站的功能性意义还没有完全了解在每种情况下,但由于这些网站结构上和功能上是独一无二的,他们代表了潜在的目标高度选择性药物。gydF4y2Ba
本研究进一步设计识别一些重要的氨基酸残基对英国PDE5 - 122764和西地那非绑定。24 PDE5抑制催化域突变体由英国- 122764和西地那非的特点。只有点突变的残留保存在哺乳动物pd研究比较的影响那些已经学习关于他们的交互与cGMP和敏喘宁。因为这些残留是守恒的,很可能,西地那非的选择性和效力也至少部分由于贡献或贡献从nonconserved残渣或残留在PDE5催化领域。这些抑制剂的效力块催化Y602A大大降低的突变体。这个突变的cGMP-binding活动也减少了(gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 65μM)与野生型相比PDE5 (gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 2μM),但是gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba值(4.27秒gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba野生型和1.12秒gydF4y2Ba−1gydF4y2BaY602A突变)是相似的(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。这些结果表明,酪氨酸的变更gydF4y2Ba602年gydF4y2Ba影响主要底物和抑制剂具有约束力,而不是催化。Y602F突变体的底物动力学参数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 2μM,gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba= 4.12年代gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)非常类似于野生型酶(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba)。此外,抑制效力的西地那非或英国- 122764更大的变异。累计,数据表明,酪氨酸gydF4y2Ba602年gydF4y2BaPDE5参与催化部位的堆积与底物或抑制剂用于这项研究。西地那非的,有趣的是,E775A突变展品IC的变化,“碳足迹”的11倍gydF4y2Ba50gydF4y2Ba价值。这温和的改变可能与当前讨论因为Glu相同gydF4y2Ba775年gydF4y2Ba突变削弱cGMP绑定35-fold的催化部位(gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 70μM E775A)。重要的是,E775A突变也催化地主管gydF4y2BakgydF4y2Ba猫gydF4y2Ba= 1.53年代gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba),所以的变化gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba和集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值必须是归因于底物和抑制剂绑定。使用目前的诱变数据连同那些已经发表(gydF4y2BaTurko et al ., 1998 agydF4y2Ba),抑制剂西地那非的顺序可以安排英国- 122764 > >敏喘宁的抑制效力和程度他们模仿cGMP的交互PDE5的催化部位。后者财产可以解释部分PDE5的高亲和力的西地那非。gydF4y2Ba
每个抑制剂的展品更交互的催化部位PDE5比环鸟苷酸。据推测,除了cGMP的分子模拟,这些抑制剂利用新颖的催化部位内的相互作用,从而优化绑定与cGMP绑定。讨论这一点,有必要考虑抑制剂的化学结构。敏喘宁的化学结构类似于鸟嘌呤的cGMP的结构与额外的疏水一半C2。敏喘宁没有取代基的结构与循环phosphate-ribose cGMP(图的一部分。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。因此,两个因素可能导致的高亲和力敏喘宁绑定(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba相比之下,cGMP(= 130海里)gydF4y2BaKgydF4y2Ba米gydF4y2Ba= 2μM):一个额外的疏水作用和整体的电负性结构。化学结构的进一步分析英国- 122764 (gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba和西地那非(= 5海里)gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 1海里)表明,达到最大的关联,切除带负电荷的循环phosphate-ribose一半是不够的;这显然是必要的,占据的空间这一指控一半充满卸货取代基能够形成额外的接触或接触一个或多个氨基酸残基周围。据推测,3′取代基在英国- 122764或西地那非一样可以扮演相同的角色在cGMP核糖,和5′取代基在西地那非一样占据同一个空间磷酸循环。gydF4y2Ba
虽然带负电荷的环磷酸基的水解需要环核苷酸通过pde,观察到的亲和力cGMP可能反映了交互之间的平衡,有利于高亲和性绑定和那些歧视过分的高亲和性cGMP绑定。敏喘宁,英国- 122764和西地那非都的电负性比cGMP但将更紧密地绑定到PDE5符合带负电荷的磷酸循环群的可能性可能会限制cGMP-binding亲和力PDE5的催化部位。结果也有有趣的应用程序定义营地的分子机制和cGMP选择性催化不同pde的网站。因为循环phosphate-ribose的半个营和cGMP是相同的,这组不能占选择性环核苷酸。事实上,如果有一个强大的电荷与环磷酸基的交互,它可以减少环核苷酸选择性的能力。可变性的力量的相互作用可以解释部分的双重活动一些pde营地和cGMP相比其他pde的环核苷酸选择性更高。最后,本研究的实验和理论观察应该更清楚地定义所使用的底物识别过程的本质PDE提供有用的信息,设计新型的PDE抑制剂。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba1999年1月22日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba1999年4月15日。gydF4y2Ba
再版请求发送到:gydF4y2Ba杰基·d·科尔宾博士,分子生理学和生物物理学系,范德比尔特大学医学院的纳什维尔,TN 37232 - 0165。电子邮件:gydF4y2BaJackie.Corbin在}{mcmail.vanderbilt.edugydF4y2Ba
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助GM41269和由辉瑞中央研究。gydF4y2Ba
缩写gydF4y2Ba
- PDEgydF4y2Ba
- 3′,5′环核苷酸磷酸二酯酶gydF4y2Ba
- IBMXgydF4y2Ba
- 3-isobutyl-1-methylxanthinegydF4y2Ba
- 美国社会的药理学和实验性疗法gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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