文摘
严重的哮喘是气道重塑,特点是结构变化包括增加气道平滑肌质量和基质沉积,导致肺功能恶化。TGF-β是导致的多效细胞因子矩阵的合成分子增加了人类气管平滑肌(对比)细胞,参与哮喘气道重塑。TGF-β合成为一个潜在的复杂,隐藏在细胞外基质,需要激活功能。激活潜伏TGF-β病原反应步骤的生物利用度。本研究调查的影响收缩受体激动剂LPA和醋甲胆碱TGF-β激活通过对比细胞在哮喘气道重塑的发展及其作用。给出的数据表明,LPA和醋甲胆碱诱导TGF-β激活通过对比细胞通过整合素αvβ5。我们的研究结果强调的重要性β5胞质域因为多态性β5单元整合素无法激活TGF-β呈现。据我们所知,这是第一个描述的生物相关的整合素无法激活TGF-β。这些数据表明,小鼠气道平滑肌细胞表达αvβ5整合和激活TGF-β。最后,这些数据表明,抑制或基因损失,αvβ5降低allergen-induced气管平滑肌厚度的增加哮喘的两个模型。 These data highlight a mechanism of TGF-β activation in asthma and support the hypothesis that bronchoconstriction promotes airway remodeling via integrin mediated TGF-β activation.
气道高反应性,哮喘,的一个关键特性是提高气管平滑肌的收缩(ASM)层吸入刺激,导致变量气道阻塞。这种现象负责与哮喘相关的急性发作。严重哮喘的反复发作是一个特征。同样,气道重构的结构变化也通常与案件有关的严重哮喘(1随着时间的推移)和肺功能恶化(2,3)。最近表明,支气管收缩可以诱发轻度哮喘患者的气道重构的特点,包括胶原蛋白沉积和杯状细胞增生(4);然而,责任机制是未知的。
TGF-β牵连在哮喘气道重塑的发病机理(5)。TGF-β促进气道重塑,部分原因是它对ASM影响细胞增殖,上皮细胞凋亡,和强有力的profibrotic行动,包括增加胶原蛋白的合成和纤连蛋白(6- - - - - -8)。TGF-β促进细胞外基质沉积,ASM增生,粘液生产在过敏性哮喘动物模型在不影响现有的气道炎症(9)。Smad2的过度表达,TGF-β信号蛋白,使ASM层的增厚和沉积后的胶原蛋白过敏原的挑战(10)。此外,TGF-β信号的重要性在哮喘发病机制所支持的全基因组关联研究证明SMAD3基因的单核苷酸多态性之间的联系和哮喘(11)。
TGF-β分泌细胞的共价协会前肽,latency-associated肽,这使得它不活跃。激活潜伏TGF-β是其生物利用度(病原的一步12),TGF-β激活机制的基础疾病。描述了几种机制的激活体外,包括血纤维蛋白溶酶的蛋白水解激活矩阵metalloproteases类胰蛋白酶,物理活化的极端高温和氧化,激活血小板反应蛋白- 1 (13- - - - - -17)。几项研究已经描述了TGF-β活动增加哮喘(18- - - - - -20.)。激活的TGF-β哮喘可以通过几种机制来实现。上皮细胞可以激活TGF-β回应上皮损伤层。肥大细胞,存在于大量的哮喘支气管黏膜,可以激活TGF-βproteolytically通过释放蛋白酶的颗粒(15,21- - - - - -23)。体内整合蛋白似乎在TGF-β激活产生重大作用,至少在开发(24,25),最近fibroblast-specific删除αvβ8整合素已被证明会降低气道重塑通过减少TGF-β-induced CCL2, CCL20依赖树突细胞迁移(26)。然而,众所周知平滑肌细胞TGF-β激活是否能直接导致气道重塑。
整合蛋白heterodimeric细胞表面分子参与和信息交互和cell-matrix交互。描述的六24目前整合蛋白识别和结合arginine-glycine-aspartate latency-associated肽的图案TGF-β1和TGF-β3。四个已报告在体外激活TGF-β,包括αvβ6 (27),αvβ8 (28),αvβ3 (29日)和αvβ5 (30.)。Integrin-mediated TGF-β激活已经αvβ6和αvβ8整合蛋白的最佳特征。激活的TGF-βαvβ8整合素包括MMP14和蛋白水解的乳沟潜伏TGF-β分子,而αvβ3αvβ5,αvβ6整合蛋白激活TGF-β通过一种机制要求一个完整的细胞骨架和细胞收缩(27,30.- - - - - -32)。激活的TGF-βαvβ6整合蛋白空间局限于上皮细胞,而αvβ5,和一定程度上的αvβ3,存在于间充质细胞,并能激活间充质TGF-β(30.,33,34)。这就提出了一个可能性,细胞收缩在支气管收缩促进TGF-β通过细胞表面蛋白激活。
本研究的目的是调查是否收缩受体激动剂可以促进人类ASM TGF-β激活(对比)细胞,并确定是否这个过程中特异表达哮喘。我们发现lysophosphatidic酸(LPA)诱导TGF-β激活通过对比细胞通过整合素αvβ5-mediated机制,涉及细胞骨架重组。此外,醋甲胆碱还通过对比细胞诱导TGF-β激活。对比细胞与哮喘病人TGF-β回应都收缩受体激动剂激活超过细胞nonasthmatic个人。此外,整合蛋白的多态性在胞质域β5 (itgb5)基因导致无法激活TGF-ββ5亚基。使用的卵子模型气道重塑我们演示coassociationαvβ5整合蛋白和ASM phospho-Smad2染色层改造的航空公司,以及全球增长TGF-β激活。最后,使用两种不同的小鼠哮喘模型,我们表明,抑制和基因失去αvβ5整合素的结果大大减少ASM围绕航空公司尽管增强炎症。这一发现表明,αvβ5整合素在调节气道重塑具有重要作用,以及支持这一概念,可以分离在哮喘炎症和重塑。这些小说数据显示一个潜在的机制,通过收缩ASM层的患者的哮喘发作可以促进气道重塑过程中控制不好的疾病。
材料和方法
细胞培养
气管和支气管对比细胞。气管对比细胞从后期气管标本获得捐助者没有呼吸道疾病史或气道异常如前所述的证据(35)。支气管对比细胞来自支气管活检标本和由克里斯Brightling(莱斯特大学,莱斯特,英国)。哮喘受试者招募Glenfield医院(莱斯特大学)特征很仔细,面对一个适当的历史,客观证据变量气流阻塞,如前所述(气道高反应36)。受试者没有发作需要系统性皮质激素或抗生素支气管镜检查前6周。细胞在DMEM培养包含10% FCS,青霉素G (100 U /毫升),链霉素(100μg /毫升)l谷氨酰胺(4毫米)。所有的细胞都被用于通过6和生长在无血清培养基被捕前24小时的实验。CS-1细胞,不依从仓鼠黑色素瘤细胞系,礼物院长谢泼德(加州大学,旧金山)。他们培养FCS RPMI 1640 + 10%,l谷氨酰胺(4毫米)、青霉素(100 U /毫升),链霉素(100μg /毫升)和两性霉素B(2.5μg /毫升)。细胞转染后与整合素β5结构,成为塑料附着;然后他们被培养和之前一样的抗生素G418μg 500 /毫升,因为这是杀死了100%的浓度nontransfected CS-1细胞后1周的文化(数据未显示)。
coculture将貂肺上皮细胞转化试验
改变了貂肺上皮细胞(TMLCs)稳定表达的一部分纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI1)启动子荧光素酶基因被用作记者细胞检测TGF-β活动(32)。对比细胞被镀在2.5×105细胞/毫升和增长逮捕了24 h。TMLCs镀直接对比的细胞在5×105细胞/毫升。每个实验所需的细胞被刺激。16 h后,细胞细胞溶解使用荧光素酶记者分析工具包(Promega)和相对荧光素酶的发光测量单位(RLU)。
定量rt - pcr
刺激后细胞总RNA提取使用NucleoSpin RNA II工具包(Macharey Nagel)和反向转录成互补DNA(互补)使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶。互补脱氧核糖核酸受到定量rt - pcr分析评估TGF-β-inducible基因的表达PAI1使用β2-microglobulin(β2-M)作为看家基因。不同的引物集被用来增强小鼠DNA和hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(产生HPRT)作为看家基因在这些情况下。引物序列如下:
PAI1意义:5′-TCTGCAGACCTGGTTCCCAC-3′,
PAI1反义:5′-AGCCCCGTAGTTCCATCCTG-3′,
β2-M意义:5′-AATCCAAATGCGGCATCT-3′,
β2-M反义:5′-GAGTATGCCTGCCGTGTG-3′,
纤连蛋白意义:5′-CAGGATCAACTTACGGAG-3′,
纤连蛋白反义:5′-GCCAGTGACAGCATACA-3′,
胶原蛋白:5′-CCAAATCTGTCTCCCCAGAA-3′,
胶原蛋白反义:5′-TCAAAAACGAAGGGGAGATG-3′,
小鼠PAI1意义:5′-GGCCAAAGGAAAAAGCACTGT-3′,
小鼠PAI1反义:5′-GGGCCACCATTTGATCTGTCT-3′,
小鼠产生HPRT意义:5′-TGAAAGACTTGCTCGAGATGTCA-3′,
小鼠产生HPRT反义:5′-CCAGCAGGTCAGCAAAGAACT-3′。
放大了使用一个MXPro3000 (Stratagene)与SYBR总理Taq交货(豆类Bio)以下项目:初始变性在95°C 30年代紧随其后40周期5 s的95°C, 30年代60°C, 72°C 15 s。放大一个DNA证实了产品融化曲线分析。数据表示为相对表达式使用先前描述的ΔΔCt方程(37)。
免疫印迹
Smad2水平和Smad3细胞质和核分数被西方墨点法确定。蛋白质样品(30μg每车道)受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳在10%,electroblotted聚偏二氟乙烯膜。阻塞了1 h(5%脱脂乳在TBS + 0.1%渐变20),膜是孵化一夜之间在4°C单克隆anti-Smad2/3 Ab(1:50 0阻断缓冲区;细胞信号技术)。洗后,膜(PBS pH值7.4 + 0.3% Tween-20)与HRP-conjugated二次孵化Ab(1:20 00阻断缓冲区)在室温下1 h。膜与ECL孵化免疫印迹检测试剂和接触Hyperfilm-ECL可视化。
细胞titer-glow化验
细胞Titer-Glo发光细胞生存能力分析(Promega)是用来确定细胞数量coculture哮喘对比实验比较nonasthmatic和细胞。额外的细胞被井准备和治疗以同样的方式作为实验井。潜伏期后16 h, 100μl细胞Titer-Glo试剂添加到每个好,板是放在一个摇臂在室温下10分钟。发光测量和数据转换成实际的手机号码使用标准曲线已知的细胞数量。
稳定转染
DNA质粒结构对应于常见的全身的整合素β5单元和多态整合素β5亚基在向量pc.DNA3.1教授提供的e . Kawahara(日本金泽金泽大学)。转染试剂Transfast (Promega)被用来稳定转染CS-1仓鼠黑色素瘤细胞根据制造商的协议。
流式细胞术对整合素αvβ5
整合素的细胞表面表达αvβ5评估了流式细胞术如前所述(32)。细胞计数和0.5×106细胞首先封锁在山羊血清20分钟,然后沾anti-αvβ5 Ab (Ab克隆小翼羽在鼠标名称;迪恩·谢泼德教授的礼物)25μg /毫升20分钟。在PBS洗细胞后,细胞被染色的PE-labeled anti-mouse二级Ab 20分钟。负控制细胞与山羊血清被封锁,但只有沾二级PE-labeled Ab。细胞进行了分析使用BD FACSCanto流式细胞分析仪。
整合素的Coimmunoprecipitationβ5蛋白
整合素的相互作用β5与细胞骨架蛋白亚基蛋白研究使用一个通用的磁coimmunoprecipitation工具包(活动主题)根据制造商的指示。一只兔子多克隆Ab针对整合素β5和鼠标单克隆针对蛋白1和2(克隆8 d4)使用(包括从Abcam)。蛋白质(500μg)是免疫沉淀反应5μg Ab和蛋白质G磁珠。的蛋白质sds - page分离后,膜与第二Ab探测。
卵巢小鼠哮喘模型
所有动物保健和程序批准的诺丁汉大学伦理审查委员会和内政部项目和个人许可下进行权威在动物(科学程序)法案1986。雌性BALB / c 6-wk-old老鼠从查尔斯河购买(马尔盖特,英国肯特郡)和安置在生物医学服务单位,诺丁汉大学至少7 d后交付。动物们自由获取食物(Tekland全球18%的蛋白质啮齿动物的饮食;斯特牛,英国)和水。研究0天,小鼠腹腔注射致敏的10μg卵子(σ)1:1稀释与辅助明矾(σ),紧随其后的是随后的敏化12天。在19天,老鼠每天挑战口咽政府400μg /毫升的卵子在50μl盐水或50μl盐水仅6 d,其次是额外的挑战在天26日、28日,30日,33。老鼠们牺牲了34天。αvβ5抑制的研究期间,小鼠致敏和治疗所述每一个2 d从天18 4毫克/公斤anti-αvβ5(克隆小翼羽)腹腔注射,直到研究结束。使用1毫升PBS进行支气管肺泡灌洗。冷冻和formalin-fixed组织进行免疫组织化学。 For formalin-fixed tissue, the left lobe was inflated with formalin and fixed in formalin overnight and then embedded in paraffin wax. For frozen tissue, the left lobe was inflated with 1 ml OCT and then frozen in precooled isopentane and stored at −80°C. The remaining four lobes were separated and snap frozen in liquid nitrogen until needed.
来自烟曲霉属真菌小鼠哮喘模型
加州大学旧金山分校的动物研究委员会(IACUC)批准使用的小鼠实验报告。动物们被允许免费食物(Tekland啮齿动物实验室Chow)和水。β5基因敲除小鼠(itgb5−−/)如前所述生成(40)和繁殖到129 SvJae背景。的小鼠模型来自烟曲霉属真菌过敏性肺部疾病是使用的方法描述(41)。Isoflurane-anesthetized老鼠给10μg(40μl盐水)答:fumogatus(Hollister-Stier实验室)或40μl盐水鼻孔使用微量吸液管用鼠标在仰卧位举行。三治疗后每周总共9个剂量,小鼠安乐死48 h后鼻内的挑战。支气管肺泡灌洗了用三个独立的洗1毫升PBS。单独洗涤相结合,在1500转离心5分钟,以及由此导致细胞颗粒resuspended 1毫升PBS。使用血细胞计数器总炎症细胞数。Formalin-fixed组织收集免疫组织化学。左叶与福尔马林膨胀,一夜之间在福尔马林固定,石蜡和嵌入。
αSMA /αvβ5双重染色
部分冻结的小鼠肺组织(3μm厚)。在Zamboni的固定剂固定后20分钟,2毫米柠檬酸缓冲的部分被煮3分钟,然后屏蔽和抗生物素蛋白生物素阻断方案(向量实验室)PBS的15分钟。组织被封锁在5%山羊血清加0.1% BSA在PBS 30分钟和孵化αvβ5 Ab(15459年Abcam 1:200)过夜。在PBS洗涤后,幻灯片是孵化Dylight649共轭二次Ab。细胞被沾的1:10 0稀释α-smooth肌肉肌动蛋白(SMA) Ab(克隆1 a4)使用mouse-on-mouse Ab检测设备(向量实验室)根据制造商的指示。染色是使用激光扫描共焦显微镜,尼康NIS元素可视化图像分析软件。图像是通过组织获得了在一个平面上。
αSMA / P-Smad2双重染色
部分石蜡wax-embedded组织(5μm厚)。在脱蜡和补液、Ag)检索是由柠檬酸煮沸20分钟的部分缓冲区。部分被封锁在5%正常山羊血清+ 0.1% BSA。孵化了部分anti-Phospho-Smad2一夜之间(1:200)然后DyLight594共轭二级Ab。然后复染色的部分和一个anti-mouse anti-αSMA Ab使用mouse-on-mouse荧光素工具包(向量实验室)根据制造商的指示。染色是使用激光扫描共焦显微镜,尼康NIS元素可视化图像分析软件。图像是通过组织获得了在一个平面上。
αSMA免疫组织化学
αSMA免疫组织化学进行5-μm厚的部分石蜡wax-embedded组织。这些部分在二甲苯脱蜡、水化增加浓度的乙醇,然后洗在PBS。Ag)检索是由煮20分钟的部分柠檬酸缓冲。被封锁的部分抑制非特异性结合的主要Ab在5%正常山羊血清+ 0.1% BSA在PBS 30分钟。部分与初级孵化Ab一夜之间(1:1000)。部分被孵化DyLight488-conjugated二级Ab 30,和部分复染色用DAPI核染色。负控制幻灯片之前,没有沾染了主Ab与二次孵化Ab每个实验的进行。αSMA量化在规模较小的航空公司使用NIS元素执行软件(尼康)测量区域的微米αSMA染色。小老鼠气道的定义目前模棱两可;然而,先前的研究已经定义了一个小气道直径100 - 200μm (42)。本研究使用这个定义。只有横断面航空半径小于100μm被量化。
小鼠PAI1夹心ELISA
Snap-frozen肺叶解冻在冰冷的裂解缓冲(Triton-X 100年20毫米Tris-HCl, 1%, 137毫米氯化钠,2毫米EDTA, 25毫米β-glycerophosphate, 10%的甘油,Na3VO4 1毫米,1毫米phenylmethanesulfonyl氟化物,10μg / ml亮抑酶肽,1毫米德勤,和0.1 U /毫升蛋白酶抑制剂混合物)。肺是使用手持均质机均质。样本在13000转离心10分钟,和上层的收集。小鼠的浓度PAI1从OVA-sensitized肺匀浆,盐水,OVA-challenged老鼠决心使用小鼠PAI1总Ag夹心ELISA (Patricell)根据制造商的指示。
统计数据
使用GraphPad棱镜4软件执行统计分析。当数据测量组,差异的平均值汇集数据比较。机械的通路在正常细胞在评估时,实验至少重复三次,代表的例子所示,实验复制评估统计。比较两个数据集是由双尾未配对t测试。比较两个以上的数据集是由双向方差分析;p< 0.05被认为是重要的。
结果
在对比细胞收缩agonist-induced TGF-β激活
是否收缩受体激动剂激活TGF-β对比细胞,这些细胞被刺激与LPA和醋甲胆碱,TGF-β活动采用三个独立的试验测定。LPA和醋甲胆碱诱导浓度的增加活跃TGF-β以coculture试验(图1一个,1B)。没有作用的受体激动剂对记者细胞(数据未显示)。LPA也诱导时间增加PAI1 mRNA表达,这是最大8 h (图1C)。增加被废除pan-TGF-β中和Ab确认LPA诱导PAI1基因表达是TGF-β介导的。醋甲胆碱也能诱发PAI1 mRNA TGF-β依赖的方式(图1D)。最后,LPA和醋甲胆碱刺激诱导Smad2易位和smad3核(图1E,1F)。这些数据确认收缩受体激动剂LPA和醋甲胆碱激活TGF-β对比细胞。
收缩agonist-induced TGF-β激活是通过αvβ5整合素介导的
细胞识别TGF-β激活机制的对比,一个αvβ5阻止使用Ab。LPA - methacholine-induced TGF-β激活被测量PAI1 mRNA水平进行评估,并由αvβ5都废除阻止Ab (图2一个,2B)。因为细胞骨架蛋白核心contraction-induced TGF-β激活(27,30.),肌动蛋白重组的药理抑制剂(细胞松弛素D)使用。LPA-induced TGF-β激活抑制了细胞松弛素D (图2C)。确定bronchodilation抑制LPA-induced TGF-β激活,β2-adrenoreceptor(β2)受体激动剂formoterol使用。添加formoterol完全抑制LPA-induced增加PAI1基因表达(图2D)。
的多态性β5单元胞质尾废除αvβ5-mediated TGF-β激活
建立细胞骨架与β5胞质域的交互是否参与调停TGF-β激活,先前描述的影响β5多态性在LPA-induced TGF-β激活了(43)。这种多态性包括整合素内的9个基点删除β5胞质域,导致β5”缺乏氨基酸FNK亚基767 - 769。完整的DNA结构对应的常见等位基因β5 (FNKFNK)和多态β5 (FNK;从大肠Kawahara)教授礼物都是稳定转染到CS-1仓鼠黑色素瘤细胞,不表达任何内生ITGB3或ITGB5基因。转染后的细胞表面表达αvβ5被流式细胞术进行评估。两个细胞系转染与常见的多态基因表达αvβ5整合素在细胞表面(图3一个,3B),虽然表达水平更高的多态性等位基因转染后。TGF-β激活被coculture试验评估在这些细胞系。Coculture细胞表达常见等位基因与TMLC记者细胞表明,常见的等位基因是能够激活TGF-β基底(图3C),如图所示的荧光素酶活性下降TGF-β中和Ab的存在。然而,与多态基因转染细胞无法激活TGF-β基底(图3D)。
”的删除FNK767 - 769在多态β5亚基发生在一个NxxY蛋白绑定域名。评估与β5胞质蛋白相互作用域是否改变了细胞内表达多态β5亚基,coimmunoprecipitation进行研究。最初β5整合素亚单位从CS-1免疫沉淀反应细胞溶解产物表达全长或多态β5和蛋白免疫印迹(图4一个)。进一步研究这些相互作用,蛋白免疫沉淀反应和免疫印迹β5整合素亚基进行(图4B)。全长蛋白(220 kDa)绑定到常见和多态β5子单元,而蛋白棒域(190 kDa)始终绑定β5亚基的多态等位基因。
哮喘对比细胞活性比nonasthmatic TGF-β对比细胞
证明了收缩受体激动剂LPA和醋甲胆碱诱导αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活对比细胞通过细胞骨架,我们想要确定是否有任何区别对比细胞相比控制哮喘患者。当哮喘对比与LPA的浓度增加,细胞被刺激他们激活更多TGF-β相比nonasthmatic细胞(图5一个;p< 0.005)。LPA也诱导TGF-β激活时间的方式以PAI1 mRNA水平(p< 0.05),哮喘对比细胞引起夸张LPA刺激在每个时间点测试(p< 0.05),最多6 h后刺激(图5B)。此外,哮喘对比细胞激活更多TGF-β比nonasthmatic醋甲胆碱刺激细胞,以coculture试验(图5C由PAI1定量rt - pcr)和(图5D)。来决定是否增加TGF-β激活导致增加基因的表达与气道重塑我们评估表达式纤连蛋白和胶原蛋白1型(COL1A)定量rt - pcr LPA刺激的反应。哮喘对比细胞表达更高层次的纤连蛋白mRNA在回应LPA治疗比nonasthmatic细胞(图5E)。尽管趋势COL1A表达增加,患病和nondiseased之间没有明显的统计学差异对比细胞被发现(图5F)。最后,总TGF-β水平测定,发现在如果哮喘患病率对比细胞与nonasthmatic对比细胞(p< 0.005;图5G)。
αvβ5哮喘细胞整合素介导TGF-β活动增加,但这并不是由于增加细胞表面αvβ5整合素表达
确定增强TGF-β活动在哮喘对比观察到细胞介导的αvβ5整合素,我们对比刺激细胞在哮喘患者LPA的αvβ5阻塞Ab (图6一个,6B)。的αvβ5整合素阻断Ab完全废除LPA-induced TGF-β活动增加,作为评估coculture化验在哮喘和nonasthmatic对比细胞(图6一个,6B)。这一发现表明,增加LPA-induced TGF-β激活在哮喘对比观察到细胞介导通过αvβ5整合素。以确定是否增加αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活是由于较高的αvβ5哮喘对比细胞整合素在细胞表面,β5整合素亚基细胞表面表达通过流式细胞仪测定并与nonasthmatic细胞(图6C,6D)。没有差别在细胞表面的平均荧光强度β5哮喘对比之间的整合素细胞或nonasthmatic对比细胞。
ASM细胞表达αvβ5整合蛋白体内并激活TGF-β,促进卵子哮喘模型ASM肥大
调查的角色αvβ5整合素在体内,我们使用的卵子模型气道重塑。组织学saline-challenged老鼠的部分显示正常的肺架构,炎症细胞,一个完整的上皮细胞层(图7一个)。然而,组织学部分小鼠致敏和挑战卵子显示广泛的气道炎症和气道重塑的证据,如增厚ASM层(图7B)。ASM层染色阳性αSMA和αvβ5盐水OVA-treated动物,与αvβ5整合蛋白本地化的肌动蛋白纤维和信息联系,在细胞表面(图7C,7D)。当平滑肌束从OVA-treated动物可视化在横截面,很明显,ASM细胞表达αvβ5外部表面整合素肌动蛋白纤维的细胞表面(图7E)。确认ASM细胞可以激活TGF-β,组织学部分与Abs与αSMA P-Smad2双标记。证明ASM细胞αSMA表达式,显示核表达P-Smad2 (图7F箭头)。全球水平的TGF-β激活肺在OVA-treated老鼠升高,估计通过测量水平的TGF-β诱导蛋白在小鼠肺匀浆夹心ELISA (PAI1图7G)。
评估的重要性αvβ5 integrin-mediated TGF-β气道重塑,激活一个αvβ5阻塞Ab(小翼羽)对接受老鼠注射OVA-induced气道重塑和ASM层周围较小的航空公司进行评估。有最小的染色αSMA盐水治疗老鼠的小航空公司(图8一个),αvβ5阻塞Ab在saline-treated动物(没有效果图8B)。部分的老鼠接受卵子和同形像控制Ab,有显著的增厚的ASM层(图8C),这是减少动物收到αvβ5阻塞Ab (图8D)。ASM层的厚度是量化,证实小鼠接受卵子加上一个anti-αvβ5 AbαSMA显著减少染色在航空与动物相比,接受卵子和同形像控制Ab (图8E)。然而,似乎增强炎症组织学部分从小鼠OVA-induced重建治疗αvβ5整合蛋白阻塞Ab,与小鼠相比同形像对待控制(图8G,8H)。因此,炎症细胞浸润是量化BAL流体(BALF)。卵子治疗增加炎症细胞存在于BALF的总数(图8F),这似乎是增强动物对待Ab anti-αvβ5阻塞;然而,这些差异没有统计学意义。没有区别同形像之间的微分细胞计数控制和αvβ5 Ab对待动物(数据未显示)。
Itgb5−−/老鼠少开发allergen-induced ASM增厚
进一步阐明αvβ5在气道重构的发展,我们使用了一个答:来自烟过敏性哮喘的气道重构的模型itgb5−−/老鼠。这两个itgb5−−/和控制动物,盐水的挑战后,最小αSMA-positive细胞周围的航空公司(图9一个,9B)。治疗控制老鼠答:来自烟导致增厚ASM层(图9C),这是减少答:来自烟暴露itgb5−−/动物(图9D)。在ASM厚度显著减少αSMA染色是量化(图9E)。类似于卵子暴露小鼠,观察答:来自烟引起炎症细胞的总数的增加出现在控制老鼠(p< 0.005),进一步加强itgb5−−/老鼠暴露在答:来自烟(p< 0.05)。
讨论
本研究的目的是调查是否收缩受体激动剂可能导致对比TGF-β激活细胞,探索激活的机制及其与哮喘气道重塑。我们已经表明,LPA和醋甲胆碱激活TGF-β对比,我们发现了一个新颖的机制涉及细胞骨架的TGF-β激活这些细胞,蛋白,αvβ5整合素。我们已经表明,哮喘病人分离出的对比细胞激活更多TGF-β通过这个途径比细胞分离nonasthmatic个人。据我们所知,这是第一次,这种机制增加TGF-β激活的细胞中描述哮喘患者。此外,我们表明,小鼠表达αvβ5 ASM细胞整合素在体内,可以在一个卵子激活TGF-β哮喘模型气道重塑。最后,我们表明,受损αvβ5整合素函数体内,通过药物抑制和基因缺失,导致allergen-induced ASM厚度减少,但增加气道炎症。深受这些数据识别的一个关键机制,炎症在哮喘气道重塑,支持小说假设复发性支气管收缩可能导致contraction-induced TGF-β激活ASM细胞促进哮喘气道重塑的发展。
据我们所知,本研究是第一个描述αvβ5 integrin-mediated TGF-β在ASM细胞活化。激活的TGF-βαvβ5整合素发生在硬皮病成纤维细胞促进成纤维细胞转变成纤维发生的myofibroblasts (44)。此外,myofibroblasts激活TGF-β从细胞外存储传输收缩力通过αvβ5潜伏TGF-β整合素,抑制的αvβ5 function-blocking Abs (30.)。平滑肌细胞收缩细胞,LPA和醋甲胆碱增强ASM收缩通过影响rhoA和ρ激酶(45- - - - - -47)。我们的数据表明,contraction-induced TGF-β激活被阻断抑制αvβ5整合素,和LPA-induced TGF-β激活抑制剂是抑制的肌动蛋白组装(即。细胞松弛素D)和β2肾上腺素能受体激动剂formoterol。这些数据表明,收缩受体激动剂诱导αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活通过平滑肌细胞收缩。formoterol抑制TGF-β激活可能通过影响支气管扩张剂的营地通路独立影响,虽然在myofibroblasts细胞松弛素D和观测的影响(29日)表明,细胞骨架变化的核心αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活。
进一步的证据支持细胞骨架的作用αvβ5整合素介导TGF-β激活来自从实验中获得的数据使用构造编码野生型和天然多态性β5整合素亚单位(43)。这种多态性会导致内的9个基点删除NxxYβ5亚基蛋白绑定地区的胞质域和结果”3 aa (FNK的损失767 - 769从胞质尾)。这种多态性并没有先前被证明有任何功能的影响(43),但我们的数据表明,多态性导致无法激活TGF-ββ5亚基。蛋白是一种胞质蛋白的胞质域能够绑定β整合素亚单位,基本由内而外的整合蛋白激活(48)。蛋白的作用,由内而外的整合蛋白激活integrin-mediated TGF-β激活已经建议(49)。本研究中提供的数据表明,蛋白还可以与多态β5交互单元;然而,杆域相互作用是异常的。蛋白棒域的功能作用在很大程度上是不清楚;然而,这将表明,杆域调节细胞骨架蛋白可能是中央的力量促进整合素介导TGF-β激活。
据我们所知,这些数据显示首次对比哮喘病人细胞激活更多TGF-β比从平滑肌细胞nonasthmatic个人LPA和醋甲胆碱刺激的反应。有可能增强TGF-β活动仅仅是由于增强总TGF-β对比细胞分泌的哮喘病人;然而,我们不赞成这种可能性。总TGF-β水平对比细胞从nonasthmatics和哮喘患者的大量过剩与LPA水平后主动TGF-β刺激,如发现在其他细胞系统(15,32)。增强TGF-β活动中发现哮喘细胞完全被阻断αvβ5整合蛋白,这表明增强TGF-β活动观察哮喘细胞完全依赖于αvβ5整合素。但是,没有增加细胞表面表达αvβ5整合素在哮喘对比细胞被发现与nonasthmatic细胞。几项研究已经表明,哮喘对比细胞具有内在hypercontractility相比nonasthmatic对比细胞(50- - - - - -52)。未来的工作将会调查是否hypercontractility哮喘对比细胞负责增强TGF-β受体激动剂激活在收缩。
以往的经验显示在体内模型TGF-β活动增加哮喘(20.,53),但负责增加激活的细胞类型和活化的机理尚未研究。通过评估从小鼠卵子哮喘模型肺部分,我们已经表明,ASM细胞表达αvβ5并能激活体内TGF-β,表明ASM细胞在哮喘TGF-β的重要来源。TGF-β激活整合素在哮喘气道重塑的作用已经建议因为阻塞所有TGF-β绑定整合素函数使用一个RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser)肽可以防止一个卵子哮喘气道重构模型(54),fibroblast-specific删除itgb8整合素也会降低OVA-induced气道重塑(26)。而删除的纤维母细胞itgb8减少TGF-β-induced树突细胞迁移和炎症导致减少气道重塑(26),我们的数据提供了证据表明,平滑肌细胞的封锁αvβ5整合蛋白显著减少allergen-induced增加ASM无论对炎症的影响。发现ASM厚度不完全降低水平比得上saline-treated动物意味着αvβ5-mediated TGF-β激活不是唯一TGF-β激活机制促进增加ASM细胞群。尽管αvβ8 integrin-mediated TGF-β激活导致哮喘气道重塑的发展通过对炎症的影响,其影响在ASM没有调查(26)。此外,αvβ8 TGF-β激活机制的整合素不需要细胞骨架的完整性,因此不会直接受到支气管收缩的影响。
尽管很明显,控制炎症反应在哮喘气道重塑是重要的(26,55,56),还有一个气道反应乙酰甲胆碱和牙龈之间正相关纤维化(57)。最近它已经表明,气道炎症复发性支气管收缩促进气道重塑独立(4)。此外,毒蕈碱的受体拮抗剂tiotropium,抑制methacholine-induced收缩,减少allergen-induced增加在ASM质量(58)。负责bronchoconstriction-induced气道重塑的机制还未确定,但我们的数据表明,支气管收缩导致αvβ5 integrin-induced TGF-β对比细胞活化,从而驱动结构变化与气道重塑。除了减少allergen-induced ASM的增加质量,封锁或者αvβ5似乎增加气道炎症,至少在曲霉属真菌模型。的抗炎效应TGF-β有据可查(27,59,60);因此,有可能抑制免疫和炎症细胞TGF-β活动可能会加剧炎症与过敏原相关的挑战是我们研究中观察到。需要更多的研究来调查可能的角色αvβ5调节气道炎症。
这些数据表明,收缩受体激动剂会导致TGF-β激活平滑肌细胞通过一个αvβ5 integrin-mediated通路体外,这种机制是强调在哮喘对比细胞。此外,抑制αvβ5的功能整合素降低了ASM质量体内,不减少炎症。可想而知,这种机制负责bronchoconstriction-induced气道重塑观察其他组(4,57)。因此,虽然全球抑制αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活不太可能是一个有用的治疗策略在哮喘由于对炎症反应的影响,确定特异性通路的αvβ5 integrin-mediated TGF-β激活,通过仔细的体外细胞生物学,可能援助气道重塑的新疗法的发展控制不佳的患者的疾病。
披露的信息
与葛兰素史克G.J.有研究协议,研究肺纤维化和科学博士与Stromedix赞助研究协议。其他作者没有利益上的冲突。
确认
我们感谢教授大肠Kawahara提供β5构造和教授丹尼尔·里夫金供应TMLC记者细胞,凯瑟琳黄的援助答:来自烟体内模型,Amha Atakilit生产和供应的αvβ5阻塞Ab体内研究,Glenfield医院护士,莱斯特和城市医院为主题招聘诺丁汉,露丝·桑德斯的隔离和表征主要对比细胞。
脚注
这项工作是支持的威康信托基金会(项目拨款085350,项目资助083122,高级临床奖学金082265),英国哮喘(项目授予07/026),和诺丁汉呼吸生物医学研究单位。
本文中使用的缩写:
- ASM
- 气道平滑肌
- BALF
- 支气管肺泡灌洗液
- 对比
- 人类ASM
- 产生HPRT
- hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
- LPA
- lysophosphatidic酸
- PAI1
- 纤溶酶原激活物inhibitor-1
- RLU
- 相对荧光素酶单位
- SMA
- 平滑肌肌动蛋白
- TMLC
- 改变了貂肺上皮细胞。
- 收到了2010年的10月25日。
- 接受2011年9月28日。
- 版权©2011年由美国免疫学家协会有限公司