膜结合矩阵Metalloproteinase-8多形核细胞激活是一个强有力的,组织抑制剂Metalloproteinase-Resistant胶原酶和SerpinasegydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

矩阵metalloproteinase-8 (MMP-8;gydF4y2Ba^3gydF4y2Bacollagenase-2,电子商务gydF4y2Ba3.4.24.34gydF4y2Ba)和金属蛋白酶- 1的主要成员是MMP-13 MMP的间质胶原酶组家庭zinc-dependent,中性蛋白酶。间质胶原蛋白(类型》)是细胞外基质(ECM)的主要结构组成。他们是由三个多肽链排列在一个刚性的三重螺旋构象,使它们抵抗蛋白酶降解间质胶原酶。间质胶原酶调解的初始和病原反应步骤间质胶原降解裂开的三个胶原蛋白多肽链在一个轨迹四分之三的胶原蛋白分子的距离从其氨基端(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。四分之三,四分之一碎片自发生成的变性,变性胶原蛋白片段(明胶)容易受到进一步的乳沟明胶酶(MMP-2和MMP-9)和(在较小程度上的其他基质金属蛋白酶(包括MMP-8)和丝氨酸蛋白酶(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。虽然MMP-8劈开这三间质胶原蛋白,它与金属蛋白酶- 1的不同之处在于,它劈开I型胶原蛋白以更高的速度比III型胶原蛋白。MMP-8也降低II型胶原蛋白、软骨的胶原蛋白,以更高的速度比金属蛋白酶- 1 (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。MMP-8还可以打通nonmatrix蛋白质如serpins、缓激肽、血管紧张素I, P物质(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

体内的生物角色MMP-8目前不确定。由于其已知的催化活动,MMP-8被认为是参与伤口愈合和组织重构在炎症。此外,MMP-8已经与一些慢性炎症性疾病的发病机理的特点是过度流入和激活多形核细胞(中性粒细胞),包括囊性纤维化(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)、类风湿性关节炎(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)、牙周疾病(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)和慢性皮肤伤口(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。最近的数据从Balbin et al。(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)证明MMP-8体内雄性老鼠在保护一个意想不到的作用从皮肤肿瘤的发展化学致癌模型。这项研究显示,老鼠缺乏MMP-8 (MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠)有重要的异常炎症反应的化学致癌物。缺乏MMP-8妨碍了早期中性粒细胞招聘化学致癌物质,部分是由于MMP-8-mediated乳沟和激活的LPS-induced科学家趋化因子。然而,一旦成立于MMP-8炎症gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠,它是异常持续(通过未知的机制),为肿瘤起始创造更有利的环境。此外,骨髓移植的实验证实,中性粒细胞是MMP-8促进预防肿瘤发展的源模型。gydF4y2Ba

中性粒细胞在人类MMP-8的主要来源。然而,MMP-8下级也表达了由软骨细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)、类风湿性滑膜成纤维细胞(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),激活巨噬细胞,平滑肌细胞和内皮细胞(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。PMN-derived MMP-8与其他细胞间质胶原酶表达的不同之处在于,它不是合成新创的成熟的中性粒细胞。相反,MMP-8表达髓细胞发展阶段中中性粒细胞在骨髓前体(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),它存储作为一个潜在的酶(pro-MMP-8,gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba85 kDa)的特定颗粒内中性粒细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。Pro-MMP-8迅速释放激活中性粒细胞进行脱粒(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),然后通过激活半胱氨酸开关机制产生酶的活性形式(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba∼65 kDa (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba))。激活可以实现体外有机汞(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),丝氨酸蛋白酶(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),MMP-3 (gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)、活性氧(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。然而,目前尚不清楚如何pro-MMP-8被激活或保留其活动体内,因为组织含有高效抑制剂MMP-8,包括组织MMP抑制剂(TIMPs)。gydF4y2Ba

我们已经表明,激活中性粒细胞与惊人的pericellular类型胶原酶活动即使在TIMPs孵化。此外,MMP-8表达在细胞表面活化的中性粒细胞,和这种形式的蛋白酶有助于有效,TIMP-resistant pericellular胶原酶和serpinase活动。绑定的MMP-8中性粒细胞表面促进其稳定和保护活动在细胞外空间TIMPs的存在。令人惊讶的是,我们的研究MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠急性肺损伤的模型证明MMP-8在肺部有抗炎作用。我们的数据表明,TIMP-resistant MMP-8活动的形式表达了人类中性粒细胞表面可能在重要方面贡献其抗炎和肺间质collagen-degrading活动和其他组织体内。gydF4y2Ba

山羊anti-rabbit F (ab′)gydF4y2Ba_2gydF4y2Baalexa萤石546年和488年,山羊anti-murine F (ab′)gydF4y2Ba_2gydF4y2Baalexa萤石546和546 phalloidin-Alexa获得分子探针(尤金,或者)。人类pro-MMP-8,人类TIMP-1、人力TIMP-2、多克隆兔反MMP-8免疫球蛋白(AB8115),小鼠反MMP-9,测量II型胶原酶活动的装备从Chemicon购买国际(泰梅库拉,CA)。得到FITC-conjugated I型胶原弹性蛋白产品(Owensville、钼)。纯化髓过氧化酶(MPO)从雅典获得了研究(雅典,GA)。淬火FITC-conjugated明胶和I型胶原蛋白是从分子探针获得的。(7-methoxycoumarin-4-yl) -acetyl-Pro-Leu-Gly-Leu - (3 - (2, 4-dinitrophenyl) l2, 3-diamino-propionyl) -Ala-Arg-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(McaPLGLDpaAR)购买Calbiochem Novabiochem (CA)圣地亚哥。gydF4y2BaRS113456gydF4y2Ba和gydF4y2BaRS104210gydF4y2Ba慷慨地提供了罗氏生物科学(Palo Alto, CA)。MMP-8 ELISA试剂盒购自研发系统(明尼阿波利斯、锰)。BD Biocoat基底膜基质入侵钱伯斯获得从BD实验室的器具(贝德福德,MA)。所有其他试剂购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。gydF4y2Ba

提取人类中性粒细胞在准备5×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在PBS /毫升含有0.1% (v / v)特里同x - 100。从如果细胞提取物和浮在表面的游离和激活中性粒细胞化验总人类MMP-8使用商用免疫测定(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。这种酶联免疫试剂盒MMP-8措施支持和活跃,但不检测净化人类MMP-9或人白细胞弹性蛋白酶。gydF4y2Ba

人类中性粒细胞(> 95%的纯)从健康献血者外周血分离(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。在人类中性粒细胞被暂停10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba包含1毫米Ca /毫升在哈佛商学院gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}1毫米毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},10毫米玫瑰(pH值7.4),然后孵化为30分钟37°C有或没有platelet-activating因子(PAF)参谋长(10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}到10gydF4y2Ba^{−10gydF4y2Ba}米),TNF-α(1 - 1000 U /毫升),有限合伙人gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba0111:B4 (1 - 1000 ng / ml) fMLP (10gydF4y2Ba^{−6gydF4y2Ba}到10gydF4y2Ba^{−12gydF4y2Ba}米),或者PMA (100 ng / ml)。中性粒细胞在37°C也孵化15分钟最佳浓度的有限合伙人(100 ng / ml),空军(10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}米),TNF-α(100 U /毫升)或细胞松弛素B(5μg /毫升),然后用fMLP优化激活(10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}米30分钟)。终止试验,细胞和上层清液样本后离心分离(300×gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟)。为免疫染色实验中,中性粒细胞被固定在4°C 3分钟PBS (pH值7.4)包含3%的多聚甲醛和0.5%的戊二醛(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

LabTec室幻灯片(Nunc Naperville, IL)被涂上一层FITC-conjugated I型胶原蛋白(1毫克/毫升)为2 h 37°C。哈佛商学院、自体血清或包含20μM自体血清gydF4y2BaRS104210gydF4y2Ba(或20μM 4) - 2-aminoethyl benzylsulfonyl氟化物,或20μM亮抑酶肽添加到井(300μl /),其次是人类中性粒细胞(2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞在20μl hbs)。这些细胞被激活与空军(10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}为5分钟);然后10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}M fMLP添加和钱伯斯孵化在37°C 3 h在湿润的气氛中5%的有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。细胞附着的幻灯片被固定为3分钟4°C使用含有3% (w / v)多聚甲醛的PBS和0.5% (v / v)戊二醛。商会幻灯片被拆除,幻灯片是安装在PBS含有25% (v / v)甘油和250μg /毫升gydF4y2BapgydF4y2Ba苯二胺,然后检查亮视场和入射光显微数字化。细胞被捕获的图像使用电荷耦合器件冷却相机和MetaMorph软件(通用成像,西切斯特,PA)。gydF4y2Ba

我们使用BD Biocoat基底膜基质入侵钱伯斯(修改Boyden室试验,上、下两院8-μm微孔分离,聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜涂上一层均匀的基底膜基质矩阵,一个原型基底膜(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba))。下室挤满了媒介单独(RPMI 1640包含10毫米玫瑰和1%的人血清白蛋白,pH值7.4),包含10个或中等gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}M fMLP。人类中性粒细胞(8×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba在2毫升的介质)放在上面的两个房间里,和钱伯斯孵化3 h在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。中性粒细胞通过膜被应用迁移的细胞表面束缚MMP-8。gydF4y2Ba

中性粒细胞在4°C的环境有多克隆兔反MMP-8 (AB8115)或兔免疫球蛋白,作为一个控制(包括1μg / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞),其次是山羊anti-rabbit免疫球蛋白共轭Alexa 546。AB8115长大对肽序列MMP-8的铰链区。免疫印迹分析证实,AB8115承认MMP-8 pro-MMP-8和活跃,但没有大净化MMPs-9, -12年,1或2;人白细胞弹性蛋白酶;组织蛋白酶G;或蛋白酶3。中性粒细胞在哈佛商学院被洗两次,孵化2 h在4°C山羊anti-rabbit F (ab′)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaAlexa萤石546,然后在哈佛商学院洗两次。中性粒细胞是由入射光荧光显微镜检查。细胞表面免疫荧光是量化使用MetaMorph图像分析软件,和数据修正为非特异性染色,如前所述(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。短暂,MetaMorph软件被用来量化集成150 - 200细胞的荧光在每一组任意荧光单位。为每个条件,正确的为非特异性染色,染色细胞的平均荧光强度与多发地控制Ab是从每一个集成的荧光值减去anti-MMP-8 Ab孵育细胞。结果细胞表面表达的MMP-8激活中性粒细胞被表示为一个百分比的细胞表面表达的MMP-8如果中性粒细胞。gydF4y2Ba

细胞表面的本地化MMP-8分析证实了细胞双重应用:1)兔anti-MMP-8 (AB8115)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白共轭Alexa 488;2)小鼠反MMP-9和山羊anti-murine免疫球蛋白共轭Alexa 546。细胞分析与徕卡TCSNT共焦激光扫描显微镜(徕卡、Exton PA)配备气冷式氩和氪激光。荧光共焦显微图记录下双重荧光成像模式,同时细胞暴露于488年和568年纳米光衰减的acusto可调光学滤波器。一个带通滤波器(530±30海里)是用于选择光488 -标记MMP-8 Alexa发出,和长传球590 nm过滤器是用来检测Alexa 546 - MMP-9的标签。gydF4y2Ba

激活人类中性粒细胞也应用表面MMP-8使用Alexa 488 AB8115作为主要的Ab,然后固定,如上所述。细胞然后使用250μg /毫升permeabilized lysophosphatidyl胆碱在PBS 30分钟在4°C。细胞内的细胞被应用f -肌动蛋白使用phalloidin共轭Alexa 546和他们由入射光荧光显微镜检查,如前所述(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

外周血中性粒细胞(6×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)优化激活(准备15分钟10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}拥堵的米,然后激活与10 30分钟gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}米fMLP)。可行的细胞受到氮空化和Percoll梯度离心法分离granule-free等离子体膜分数(γ乐队),嗜苯胺蓝的颗粒派别(α乐队),和具体颗粒分数(β乐队),然后是纯洁和总蛋白质含量的质膜分数量化,如前所述(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。整除的质膜分数和特定颗粒派系被孵化0.05%可溶性Brij35 1 h在4°C,紧随其后的是离心50000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。质膜样品(25μg总蛋白),以及纯化4-aminophenylmercuric醋酸(APMA)激活MMP-8,随着特定的颗粒,并激活中性粒细胞的颗粒浮在表面的样本,受到12% sds - page。蛋白质被转移到Immuno-Blot聚乙二烯二氟化物膜(100 V 90分钟12.5毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.3)包含96毫米甘氨酸和20% (V / V)甲醇),和膜被封锁在PBS 3%脱脂牛奶含有0.1%渐变20,然后用多克隆兔反探测MMP-8 (AB8115)。绑定的Ab检测HRP-coupled山羊anti-rabbit二级Ab和Opti-4CN显色检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。生成的乐队的强度量化使用接穗形象β4.02 (Scion,弗雷德里克博士)。gydF4y2Ba

净化人类pro-MMP-8(1μM)孵化在37°C 2 - 4 h APMA 2毫米。完成激活pro-MMP-8证实了15% sds - page分析样本。激活MMP-8活跃网站滴定使用TIMP-2和McaPLGLDpaAR作为底物。gydF4y2Ba

小鼠基因缺乏MMP-8 (MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba})是由取代外显子2,3,4,磷酸甘油酸酯kinase-neomycin融合基因和同源重组(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。纯中性粒细胞(> 85%)隔绝MMP-8的骨髓gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}或野生型(WT)小鼠在相同的遗传背景(混合129 / SvEv×C57BL / 6)通过积极的选择使用immunomagnetic Ly-6-G珠(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。提取小鼠中性粒细胞的准备在PBS含有0.1% (v / v)特里同x - 100,并分析MMP-8×12% sds - page,紧随其后的是使用Ab AB8115作为主要的免疫印迹分析。在37°C小鼠中性粒细胞也激活了15分钟与空军(10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}米),其次是fMLP (10gydF4y2Ba^{−7gydF4y2Ba}30分钟),然后固定,并应用细胞表面MMP-8使用AB8115或兔免疫球蛋白作为主要的Abs,紧随其后的是山羊anti-rabbit共轭Alexa 488。细胞表面MMP-8表情小鼠中性粒细胞是使用MetaMorph量化的,如上所述。gydF4y2Ba

中性粒细胞从MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT老鼠激活和固定(如上所述),洗,resuspended三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液(0.05米三羟甲基氨基甲烷含有氯化钠0.15米和0.02米CaCl液gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,pH值7.4)。细胞基因型(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/化验)孵化一式三份,没有1,10-phenanthroline(1毫米,基质金属蛋白酶的合成抑制剂)在37°C不同时期的1.8μM McaPLGLDpaAR。总细胞表面束缚MMP的活动被量化为1,10-phenanthroline-inhibitable McaPLGLDpaAR-hydrolyzing活动在上层清液样品游离氟量计(F2500荧光分光光度计;日立、东京、日本;λgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}328海里,λgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}393海里)。量化细胞中性粒细胞表面白明胶酶和I型胶原酶的活动,从MMP-8激活中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT老鼠preincubated一式三份为30分钟37°C和1毫米PMSF(灭活细胞表面丝氨酸蛋白酶在白明胶酶活动(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)有或没有1毫米10-phenanthroline。在37°C细胞孵化3 h和50μg /毫升淬火FITC-conjugated明胶(3×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/试验)或18 h和50μg /毫升淬火FITC-conjugated I型胶原蛋白(4×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/试验),MMP-mediated白明胶酶和I型胶原酶活动被量化为1,10-phenanthroline-inhibitable乳沟的基质在上层的液体荧光测定术(λgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}490海里,λgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}520海里)。gydF4y2Ba

中性粒细胞激活了15分钟和10gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}M拥堵了15分钟,然后用10 30分钟gydF4y2Ba^{−8gydF4y2Ba}M fMLP,然后固定防止释放胞内蛋白酶(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。中性粒细胞被孵化20μg牛I型胶原蛋白有或没有2×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba中性粒细胞在37°C 20 h,然后减少颗粒浮在表面的样品进行了分析使用12% sds - page和考马斯亮蓝G250染色。gydF4y2Ba

人类中性粒细胞激活表达其他蛋白酶表面可以打通MMP-8基质除了I型胶原蛋白(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。研究人类活动的膜结合MMP-8 MMP-8基质间质胶原蛋白以外,我们研究了外源性人类MMP-8绑定到如果中性粒细胞表面。这个策略允许我们MMP-8加载到中性粒细胞表面,和量化开往研究其催化活性和效率。具备内生表达蛋白酶在低水平如果中性粒细胞表面第一次灭活(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。中性粒细胞与激活,然后在4°C孵化可溶性MMP-8(1μg / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba固定(细胞),然后使用含有3%多聚甲醛和0.5%戊二醛的PBS (pH值7.4)3分钟在4°C),以防止释放蛋白酶在随后的细胞活性测定(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。细胞表面束缚MMP-8量化了孵化以下三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液在37°C的30分钟1.8μM McaPLGLDpaAR: 1) MMP-8绑定到中性粒细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/试验);2)控制中性粒细胞(没有MMP-8绑定到其表面;2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/试验);和3)试验标准的可溶性,活跃site-titrated APMA-activated MMP-8 (3 - 400 ng /试验)。劈理的衬底被氟量计量化的浮在表面的游离液体。MMP-8绑定到表面的中性粒细胞的数量是由标准曲线的插值计算可溶性,活跃MMP-8,表示为每10 ng MMP-8活动绑定gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

水解1.5μM McaPLGLDpaAR可溶性MMP-8或外生MMP-8绑定到中性粒细胞(31 - 500点250年μl三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液)监测在6分钟25°C的增加荧光(λgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}328海里,λgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}393海里(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba))。底物浓度为1.5μM满足的条件[S]≪KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba允许k的直接测定gydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba在一阶条件。gydF4y2Ba

牛I型胶原蛋白(20μg)是孵化为4 h有或没有37°C: 1)人类MMP-8绑定到中性粒细胞(2.5×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞);2)人类MMP-8绑定到中性粒细胞(2.5×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞)与10μM preincubated RS113456(一般,hydroxamate基质金属蛋白酶抑制剂);或3)500 ng的可溶性,APMA-activated MMP-8。浮在表面的游离样本和分析减少了12% sds - page和考马斯亮蓝G250染色。一个商业工具被用来评估是否人类包围的MMP-8 II型胶原酶的活动。人类MMP-8绑定到中性粒细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)、控制中性粒细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞),测定可溶性的标准,积极site-titrated MMP-8 (25 - 800 ng)孵化3 h在42°C FITC-conjugated II型胶原蛋白(100μg)三羟甲基氨基甲烷缓冲液。浮在表面的游离样本化验为II型胶原酶活性荧光测定术(λgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}490海里,λgydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}520海里),推荐的设备制造商。II型胶原酶活性表达的膜结合MMP-8和控制中性粒细胞从任意转换荧光单位每10 ng可溶性MMP-8活动gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba中性粒细胞通过从标准曲线插值生成的可溶性,MMP-8活跃。gydF4y2Ba

MMP-8绑定到中性粒细胞(8×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞),控制中性粒细胞(8×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba中性粒细胞)或可溶性MMP-8 (125 ng)也孵化8 h在37°C 6μg纯化αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba蛋白酶抑制剂(αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液-π)。浮在表面的游离样本分析减少了15% sds - page和考马斯亮蓝G250染色。评估是否与MMP-8绑定到中性粒细胞相关的催化活性是由于释放或泄漏的蛋白酶,中性粒细胞,中性粒细胞,绑定MMP-8表面也仅在三羟甲基氨基甲烷缓冲液,孵化和MMP的活动是浮在表面的样品使用McaPLGLDpaAR游离化验。gydF4y2Ba

中性粒细胞在4°C固定3分钟使用含有3%多聚甲醛和0.5%戊二醛的PBS (pH值7.4)。细胞被洗了三次在0.05米三羟甲基氨基甲烷含液0.15 M氯化钠和0.02 M CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(pH值7.4)。评估各种试剂的影响催化活性的膜结合MMP-8,我们在4°C 2 h孵化中性粒细胞激活,可溶性MMP-8(1μg / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞细胞),洗两次,然后将细胞分成两个相等的整除。一个整除是固定的,如上所述;另一个是孵化没有固定液。两组在PBS洗了三次,然后孵化三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液在37°C的30分钟1.8μM McaPLGLDpaAR。乳沟衬底的量化在任意浮在表面的游离荧光由氟量计单位,如上所述。结果固定膜结合MMP-8被表示为一个百分比的活动与nonfixed相关,膜结合MMP-8。gydF4y2Ba

与APMA Pro-MMP-8被激活;然后一个整除的活跃MMP-8绑定到如果中性粒细胞表面,和绑定到一个整除的细胞是量化,使用McaPLGLDpaAR。整除(50 ng)剩下的可溶性MMP-8和膜结合MMP-8被孵化的重复30分钟37°C的三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液含有1.8μM McaPLGLDpaAR,和最初的反应速度被氟量计量化。额外50-ng整除的每个表单蛋白酶在孵化37°C复制三羟甲基氨基甲烷分析缓冲液没有底物2,4,6,和18 h;然后McaPLGLDpaAR添加,反应速度测量,如上所述。结果表示为一个百分比的初始反应速度为每个形式的蛋白酶。gydF4y2Ba

可溶性MMP-8 (10 nM)或MMP-8绑定到中性粒细胞(10 nM)孵化在37°C的30分钟,没有三羟甲基氨基甲烷缓冲液:1)1毫米10-phenanthroline;2)0.1 nM-1μMgydF4y2BaRS113456gydF4y2Ba;3)15.6 nM-1μM TIMP-1;4)15.6 nM-1μM TIMP-2;PMSF或5)1毫米。膜结合MMP-8也与1毫米PMSF preincubated 30分钟,然后孵化与200 nM TIMP-1 30分钟。剩余MMP-8活动在上层清液样品游离量化使用1.8μM McaPLGLDpaAR。集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值是由非线性回归分析使用SigmaStat (SPSS,芝加哥,IL)。gydF4y2Ba

男性MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT小鼠年龄在10到16周,在混合SvEv129×C57BL / 6遗传背景,与氯胺酮麻醉(35毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤),然后给出10μg有限合伙人gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba0111:30μl endotoxin-free PBS B4,或30μl独自PBS的气管内的(IT)作为对照。24小时后,小鼠安乐死的有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba麻醉,然后支气管肺泡灌洗(BAL)进行使用8×0.5毫升无菌PBS。球细胞和上层的分数被离心分离(500×gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟),然后总微分白细胞(WBC)计数进行球细胞分数。球细胞的提取比例是准备使用含有0.1%的PBS Triton x - 100。MPO活性在一式三份量化BAL细胞提取物,如前所述(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),使用纯化MPO的试验标准。gydF4y2Ba

数据表示为均值±SEM或平均数±标准差。结果使用学生的配对和未配对数据比较gydF4y2BatgydF4y2Ba测试参数数据和Mann-Whitney为非参数秩和检验数据;gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05被认为是重要的。gydF4y2Ba

刚分离人外周血中性粒细胞包含MMP-8/10∼60 nggydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞(表gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。正如预期的那样,自由中性粒细胞释放少量的MMP-8当孵化没有受体激动剂。然而,当中性粒细胞是优化与促炎症刺激激活,他们自由的释放只有15 - 20%的细胞MMP-8作为可溶性蛋白酶(表的内容gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。当细胞被激活与药理学介质(细胞松弛素B和PMA), 50 - 70%的中性粒细胞MMP-8内容自由从中性粒细胞释放可溶性蛋白酶。以前,我们发现没有释放活性形式的基质金属蛋白酶与生物调节中性粒细胞激活使用McaPLGLDpaAR,敏感,一般MMP的衬底(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。所有的MMP-8释放与生物介质是中性粒细胞激活潜伏pro-MMP-8形式因为拥堵的免疫印迹分析上层清液样本,fMLP-activated中性粒细胞发现一个乐队gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba∼85 kDa(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba)。然而,激活人类中性粒细胞迁移在荧光I型胶原蛋白与惊人的pericellular胶原酶活性(黑暗区域的荧光背景开放箭头所示),尽管自体血清包含μM TIMPs浓度(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)被用来洗澡介质(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。在缺乏细胞,没有荧光胶原基质的降解(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。I型胶原酶活性与中性粒细胞被添加一个实质上废除hydroxamate MMP抑制剂血清(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaCgydF4y2Ba),但除了PMSF或亮抑酶肽(丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)血清没有影响(数据没有显示)。在一起,这些数据表明,尽管激活中性粒细胞释放微量MMP-8只在潜伏,酶原形式,他们表达有力pericellular胶原酶活动甚至在微摩尔的TIMPs存在于血清的浓度。虽然这pericellular TIMP抗胶原酶活动,它可以显著抑制低gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2BaMMP抑制剂。gydF4y2Ba

我们测试的假设中性粒细胞pericellular胶原酶活动图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba是由MMP-8,中性粒细胞细胞表面表达。为了验证这个假设,我们应用nonpermeabilized中性粒细胞对表面束缚MMP-8。应用细胞的显微数字化显示,如果人类中性粒细胞表达少量的MMP-8细胞表面(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。激活中性粒细胞有强烈的,焦细胞表面染色MMP-8(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。细胞与控制主要应用Ab没有细胞表面染色(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。检测细胞的共焦显微镜不仅证实了细胞表面MMP-8定位,但也表明MMP-8明显与MMP-9(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba),另一个表面表达的酶激活中性粒细胞(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。此外,MMP-8和MMP-9往往都本地化的前缘极化中性粒细胞(箭头,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

评估之间的关系MMP-8局部细胞表面和细胞内事件发生中性粒细胞激活期间,我们为膜结合MMP-8应用激活中性粒细胞,然后permeabilized细胞染色的细胞内f -肌动蛋白(聚合肌动蛋白)。MMP-8是经常的中性粒细胞质膜的局部地区毗邻地区的细胞质含f -肌动蛋白(数据没有显示)。缺乏完整的表面束缚colocalization MMP-8和胞内f -肌动蛋白可能是由于不同的时间课程的肌动蛋白聚合和脱粒中性粒细胞;肌动蛋白聚合是快速、可逆的,先于中性粒细胞脱颗粒(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们也量化的影响各种受体激动剂在中性粒细胞表面表达MMP-8使用免疫荧光染色法和定量图像分析、描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。与LPS激活中性粒细胞,TNF-α拥堵,fMLP诱导浓度增加细胞表面表达MMP-8,适度的(2 - 4倍),但统计学意义(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba)。这些受体激动剂诱导添加剂(3)增加细胞表面MMP-8表情中性粒细胞与细胞培养相比单独使用兴奋剂(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。受体激动剂的影响也与时间有关的(数据未显示)。激活细胞的最佳培养时间fMLP 30分钟,导致3 - 4倍增加细胞表面MMP-8表达式(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。与fMLP更长的潜伏期时间后,细胞表面MMP-8表达下降(数据未显示),但仍温和(但显著)大于3 h后,如果中性粒细胞增加fMLP(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2BaFgydF4y2Ba□)。gydF4y2Ba

评估MMP-8是否在生理过程中中性粒细胞细胞表面表达,我们量化MMP-8表达在细胞表面的中性粒细胞进行定向迁移。中性粒细胞迁移通过基底膜基质入侵室3 h在回应一个梯度fMLP表示∼5倍比细胞经历细胞表面MMP-8随机迁移没有fMLP(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba▪)和细胞表面MMP-8 >三倍比中性粒细胞孵化3 h与相同浓度的悬架fMLP(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2BaFgydF4y2Ba□)。这些数据表明,细胞表面表达的MMP-8上调持久的方式在中性粒细胞接受体外定向迁移。gydF4y2Ba

比较细胞内和细胞外的两种形式PMN-derived MMP-8,我们进行免疫印迹分析MMP-8浮在表面的游离从刺激中性粒细胞,中性粒细胞等离子体膜和PMN-specific颗粒分离的亚细胞分离中性粒细胞(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。pro-MMP-8 PMN-specific颗粒,是一种主要的MMP-8 (gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba)。中性粒细胞的颗粒包含额外的形式的MMP-8拥有gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba110年∼∼40,∼30 kDa,先前报道(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。MMP-8,自由从刺激中性粒细胞释放可溶性蛋白酶,是只在85 kda酶原形式(gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba)。中性粒细胞等离子体膜包含三个主要的MMP-8形式不同gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba(gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba),包括拥有相同的形式gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Bapro-MMP-8 (85 kDa)和主动MMP-8 (65 kDa),和一个30-kDa形式,分别代表23日,24日,和30%的总额MMP-8出现在中性粒细胞等离子体膜,分别。三个额外的小MMP-8形式存在于中性粒细胞等离子体膜gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba110、80和46 kDa,代表8、10和膜相关MMP-8总数的5%。46 -和30-kDa形式可能是proteolytically处理,活动形式的MMP-8因为可溶性MMP-8经历蛋白水解处理,产生较低的形式gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba失去了催化活性(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

评估是否膜结合MMP-8中性粒细胞是催化地活跃,我们测试是否优化人类中性粒细胞激活诱导表面MMP-8表达表面束缚I型胶原酶活动的定位,因为只有MMP-8中性粒细胞蛋白酶降解I型胶原蛋白(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。激活中性粒细胞表面束缚表达蛋白酶活动产生的四分之三(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba)和四分之一(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba)碎片典型的间质胶原酶在12 h。20 h后,有完整的完整的I型胶原降解,以及大量降解生成的凝胶(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba)。因此,人类中性粒细胞激活表达间质胶原酶(和白明胶酶)活性在细胞表面。gydF4y2Ba

我们的目标是确定MMP-8局部中性粒细胞表面催化地活跃,并评估是否有类似的底物特异性和可溶性MMP-8催化效率。然而,它是不可能研究MMP-8开表达在人类中性粒细胞表面评估其催化活性和效率与基质间质胶原蛋白,因为:1)激活中性粒细胞表面表达其他的蛋白酶切割MMP-8以外的基质间质胶原蛋白(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba);和2)目前,没有抑制剂可用特定MMP-8。因此,我们使用两个互补的策略来评估膜结合的催化活性和效率MMP-8中性粒细胞:1)功能丧失的策略相比,我们所表达的细胞表面蛋白水解活动从MMP-8激活中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}vs WT老鼠对潜在MMP-8基质;和2)电池系统模型,我们研究了外源性人类活动MMP-8绑定到如果人类中性粒细胞表面。gydF4y2Ba

我们首先从MMP-8证实,中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠不含MMP-8,通过免疫印迹分析(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),激活中性粒细胞从WT老鼠表达MMP-8以诱导的方式在他们的细胞表面(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。然后我们两基因型的细胞水解能力相比MMP-8基质。中性粒细胞从MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠表达∼58、100和8%的表面束缚,MMP-mediated活动对McaPLGLDpaAR(一种合成MMP的将军,衬底),明胶,和I型胶原蛋白(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。这些数据表明MMP-8存在激活小鼠中性粒细胞表面催化地活跃的形式。此外,膜结合MMP-8在小鼠中性粒细胞占总细胞表面MMP∼40%活动,∼90%的细胞表面I型胶原酶活动激活小鼠中性粒细胞,中性粒细胞表面的但没有白明胶酶的活动。gydF4y2Ba

评估催化活性、效率和稳定的膜结合MMP-8在隔离和定量的方式,我们研究外生,活跃MMP-8绑定到如果中性粒细胞表面(没有可检测蛋白酶活性在细胞表面)。我们第一次量化的MMP-8绑定到中性粒细胞表面使用McaPLGLDpaAR和试验标准的可溶性,活跃site-titrated MMP-8。中性粒细胞绑定60.2(12.7)每10 ng MMP-8活动gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba中性粒细胞,而控制细胞(没有MMP-8绑定到其表面)没有检测到活动(gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)。当可溶性MMP-8和膜结合MMP-8与McaPLGLDpaAR孵化,蛋白酶产生的两种形式相似,进步的乳沟的衬底(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。这个活动并不是由于释放,泄漏,或分离细胞的蛋白酶,因为上层的液体从游离细胞仅在缓冲区中没有检测到孵化活动对McaPLGLDpaAR (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)。膜结合MMP-8中性粒细胞也劈开I型胶原蛋白最初在一个单一的轨迹,生成四分之三(∼98 kda)和四分之一长度(34-kDa)胶原蛋白片段的典型溶性间质胶原酶(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba)。劈理的I型胶原膜结合MMP-8中性粒细胞(gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba)是由可溶性MMP-8一样有效(gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba),因为这两种MMP-8形式几乎完全消失,产生完整的I型多肽链。RS113456(合成hydroxamate MMP抑制剂)完全抑制了I型胶原酶活性与膜结合MMP-8(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷5gydF4y2Ba)。这个活动是相关联的所有细胞,因为刺激中性粒细胞的上层清液样本不包含I型胶原酶活性(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba6巷gydF4y2Ba)。膜结合MMP-8也劈开II型胶原蛋白。MMP-8绑定到10的表面gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba中性粒细胞表达II型胶原酶活动相当于∼100 ng的可溶性,活跃MMP-8(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。可溶性MMP-8先前报道(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba),膜结合MMP-8也劈开αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π在一个单一的轨迹在其活性部位循环,生成两个乳沟产品gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba∼50 kDa(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba),∼4 kDa(数据没有显示)。两种形式的MMP-8产生实质性的α的乳沟gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π。控制生物基质的中性粒细胞没有粘住任何考验(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们比较了饱和动力学常数(kgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba溶性和膜结合MMP-8。每个表单的蛋白酶与McaPLGLDpaAR孵化下一阶条件,和最初的反应速度测量6分钟。kgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba值可溶性和膜结合MMP-8非常类似(14800 MgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},gydF4y2BangydF4y2Ba= 5;10100米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},gydF4y2BangydF4y2Ba分别为= 3),这表明可溶性和膜结合MMP-8切割这个底物相似的催化效率。gydF4y2Ba

在上面的实验中,我们研究了外源性膜结合MMP-8被固定在中性粒细胞表面防止酶的分离细胞表面。评估我们的固定流程是否影响催化活性的膜结合MMP-8,我们比较最初反应速度的克分子数相等的数量的外生膜结合MMP-8固定或不固定在中性粒细胞表面。固定膜结合MMP-8表示nonfixed蛋白酶的活性的86.1% (gydF4y2BangydF4y2Ba= 6实验),这表明我们的固定过程几乎没有影响催化活性的表面束缚MMP-8。gydF4y2Ba

我们测量两种酶的反应速度在37°C孵化之前和之后不同时期,使用McaPLGLDpaAR作为衬底(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。可溶性MMP-8迅速失去了活动随时间(gydF4y2BatgydF4y2Ba_1/2gydF4y2Ba在37°C = 7.5 h)形成鲜明对比,膜结合MMP-8保留后6 h,其活动接近100%和> 80%的活动经过18 h。gydF4y2Ba

在一起,这些数据表明,可溶性MMP-8和膜结合MMP-8催化活性的中性粒细胞也有类似的光谱,对McaPLGLDpaAR和相似的催化效率。然而,膜结合MMP-8比可溶性MMP-8催化地稳定。gydF4y2Ba

我们比较不同的抑制剂的有效性gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba对可溶性和膜结合MMP-8。正如预期的那样,所有的MMP抑制剂对可溶性MMP-8(图完全有效。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。低gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2BaMMP抑制剂(1、10、邻二氮杂菲(gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba194 Da)和RS113456 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba426 Da))对膜结合MMP-8也完全有效。然而,在可溶性MMP-8截然相反,TIMP-1 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba28 kDa)和TIMP-2 (gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba21 kDa)只是部分抑制膜结合MMP-8(抑制∼60%),尽管他们测试在100倍摩尔过剩酶。正如所料,丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF,gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba194 Da)是无效的对这两种MMP-8形式。预培养的膜结合MMP-8 PMSF之前添加TIMP-1没有增加的有效性TIMP-1对这种形式的MMP-8 (43.4 vs 43.1(1.7)(4.2) % %抑制膜结合MMP-8×200海里独自TIMP-1 vs 1毫米PMSF和200 nM TIMP-1,分别)。这表明缺乏有效性对膜结合TIMPs MMP-8并非由于TIMPs丝氨酸proteinase-mediated乳沟。gydF4y2Ba

我们的膜结合MMP-8量化抑制TIMP-1作为时间的函数。孵化10纳米膜结合MMP-8 10 nM TIMP-1 37°C 18 h导致只有5.5 (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)%抑制其活性。由于缺少完整的膜结合抑制MMP-8 TIMP-1,它是不可能确定二阶协会速率常数和膜结合MMP-8 TIMP-1。然而,我们比较抑制膜结合MMP-8和可溶性MMP-8 TIMPs抑制剂浓度的函数。的集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值抑制可溶性MMP-8和膜结合MMP-8 RS113456都低(分别为2和16海里;无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba),这表明RS113456 MMP-8两种形式的有效抑制剂。然而,集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值抑制膜结合MMP-8 TIMP-1和TIMP-2的更高(分别为203和534海里)比抑制可溶性MMP-8 (ICgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba分别= 22日和7海里;无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。此外,100倍摩尔TIMPs没有完全抑制膜结合MMP-8过剩。gydF4y2Ba

提供保证我们的方法修复中性粒细胞没有影响的能力TIMPs绑定到和/或抑制膜结合MMP-8,我们也测试的有效性对外源性MMP-8 TIMPs绑定到中性粒细胞,没有固定的。孵化10 nM nonfixed膜结合MMP-8与125和250海里TIMP-1或TIMP-2产生的抑制这种形式的MMP-8(10.4和22.4(1.0)(11.3)% %抑制由125和250海里TIMP-1和33.7和44.3(3.0)(1.4)% % 125和250海里TIMP-2抑制,分别)。因此,TIMPs也无效的和不固定的固定膜结合MMP-8(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。这些数据表明,相比MMP-8自由释放激活中性粒细胞,MMP-8局部的细胞表面激活中性粒细胞炎症反应期间可能会保持其体内活动,尽管TIMPs在等离子体和间质流体的存在。gydF4y2Ba

开始评估的角色PMN-derived MMP-8在肺部炎症反应,我们给MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT老鼠有限合伙人的路线,然后量化大量中性粒细胞进入肺泡空间。结果表明,24 h后,有限合伙人,MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}中性粒细胞的老鼠∼2倍大积累肺泡空间评估BAL的白细胞总数和微分(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba二世gydF4y2Ba分别)。我们也量化MPO活性(中性粒细胞的标志)BAL细胞溶解产物的两个基因型。从MMP-8 BAL细胞溶解产物gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠∼三倍总MPO活性大于BAL细胞溶解产物从WT小鼠24 h后,有限合伙人(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2BaBgydF4y2Ba),确认MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠中性粒细胞负担更大的肺泡空间比WT老鼠反应有限合伙人。这些数据表明,MMP-8扮演一个意想不到的,在LPS-mediated急性肺损伤小鼠抗炎的作用。gydF4y2Ba

所知甚少的细胞生物学PMN-derived MMP-8,或MMP-8保留其活动的机制在细胞外空间释放后中性粒细胞。在这项研究中,我们表明,人类中性粒细胞包含MMP-8和释放量相对较低,只在潜在的酶原形式,然而激活中性粒细胞与强大,TIMP-resistant, pericellular I型胶原酶活动迁移时在I型胶原蛋白。这个活动可能是介导的,至少在某种程度上,通过TIMP-resistant MMP-8活动,这是表示激活中性粒细胞表面。额外的研究MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠急性肺损伤的小鼠模型表明,在肺MMP-8扮演一个意想不到的抗炎作用。最有可能的是,细胞表面束缚MMP-8在激活中性粒细胞在重要方面有助于抗炎,间质胶原蛋白降解,和其他活动的酶在肺癌和其他组织。gydF4y2Ba

令人惊讶的是,中性粒细胞包含∼2数量级少MMP-8 (∼60 ng / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba比其他中性蛋白酶细胞)存储在他们的颗粒(中性粒细胞包含1 - 3∼μg / 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞的白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G蛋白酶3,MMP-9 (gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba))。自由与生物信号,当激活中性粒细胞释放只∼15 - 20%的细胞含量MMP-8可溶性蛋白酶,专门在潜在的酶原形式。然而,有力,TIMP-resistant,间质胶原酶活性与激活中性粒细胞迁移在I型胶原蛋白,即使细胞沐浴在TIMPs包含微摩尔的血清浓度(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。很可能MMP-8局部中性粒细胞表面大大有助于这个活动,因为:1)激活人类中性粒细胞从内部表达MMP-8和I型胶原酶活性表面;2)功能丧失的研究从MMP-8中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT老鼠证实,大部分的I型胶原酶活性与激活中性粒细胞表面是由MMP-8;和3)外源性人类包围的MMP-8中性粒细胞劈开I型胶原蛋白,但实质上TIMPs耐抑制。因此,在中性粒细胞是第二个形式的细胞外膜结合MMP-8 MMP-8可以贡献重要蛋白酶的生物活动的方法。gydF4y2Ba

促炎介质诱导添加剂浓度和时间表达的增加MMP-8人类中性粒细胞表面。很有可能,这些介质调控表面定位MMP-8诱导中性粒细胞脱颗粒,其次是快速绑定MMP-8中性粒细胞质膜的外表面。这个概念是由以下研究结果:1)的所有介质调控的中性粒细胞表面的表达也MMP-8刺激中性粒细胞释放MMP-8;2)有直接关系的效力与刺激中性粒细胞脱颗粒(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)和调控的细胞表面MMP-8表达式(仅fMLP >单独fMLP >有限合伙人和有限合伙人);和3)外源性MMP-8结合中性粒细胞的质膜的外表面。gydF4y2Ba

MMP-8表面局部激活人类中性粒细胞,至少部分催化地活跃因为激活人类中性粒细胞从内部表达MMP-8和I型胶原酶活性表面,和MMP-8是唯一的中性粒细胞蛋白酶,可以降低I型胶原蛋白(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。此外,我们的功能丧失的研究从MMP-8中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}vs WT老鼠显示膜结合MMP-8∼占总数的40%(评估使用McaPLGLDpaAR)细胞表面MMP的活动和∼90%的中性粒细胞细胞表面I型胶原酶的活动。随着时间的推移,激活人类中性粒细胞也进一步退化变性胶原蛋白片段(明胶)最初生成的。虽然据报道,可溶性MMP-8弱白明胶酶活动(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),白明胶酶活性与激活人类中性粒细胞表面不太可能由膜结合MMP-8因为我们丧失的研究从WT和MMP-8中性粒细胞gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠显示膜结合MMP-8没有白明胶酶的活动。最有可能的是,这种白明胶酶活动是由其他蛋白酶有白明胶酶活动的活动表示激活中性粒细胞表面,包括MMP-9 (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)和人白细胞弹性蛋白酶(对待)(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

进一步评估催化活性,催化效率,并对抑制膜结合MMP-8 TIMPs在隔离和定量的方式,我们研究了外源性MMP-8如果中性粒细胞的绑定到细胞表面。膜结合MMP-8也有类似的底物特异性的可溶性形式MMP-8裂开McaPLGLDpaAR,第一种和第二种间质胶原蛋白,serpin(αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π)。像可溶性MMP-8膜结合MMP-8产生四分之一和四分之三的碎片I型胶原蛋白的多肽链组成,和α劈开gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π在一个单一的轨迹在其网站反应循环,使其失去活性抑制剂(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。MMP-8表面局部中性粒细胞也有催化效率与可溶性MMP-8相似,是由类似的kgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/ KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba值对McaPLGLDpaAR MMP-8当测试的两种形式。所有相关的活动的细胞是由于MMP-8绑定到中性粒细胞表面,因为:1)控制中性粒细胞(没有MMP-8绑定到其表面)没有明显活动反对任何基板测试;和2)没有蛋白酶活动中检测出上层的液体从游离细胞MMP-8绑定。gydF4y2Ba

可溶性MMP-8和膜结合MMP-8的明显区别在于其稳定在37°C。虽然可溶性MMP-8短gydF4y2BatgydF4y2Ba_1/2gydF4y2Ba在37°C由于自溶(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),MMP-8局部中性粒细胞表面保留> 80%的活动甚至孵化后37°C 18 h。绑定的机制MMP-8的中性粒细胞质膜防止损失的活动还不清楚。然而,pro-MMP-9绑定的不溶性基质诱导酶的构象变化导致酶原激活(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),有可能绑定MMP-8中性粒细胞的细胞表面诱发构象改变,限制其自溶。gydF4y2Ba

pericellular的胶原酶表达的活动从内部激活人类中性粒细胞迁移在I型胶原蛋白由TIMPs存在于血清抗抑制,但实质上废除了低gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2BaMMP抑制剂。我们个人MMP抑制剂的研究测试人类膜结合MMP-8表明抑制剂有间接关系对这种形式的MMP-8大小和其有效性。特别是集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值抑制膜结合MMP-8 TIMP-1和2的高(200 - 500 nM),还有不完整的膜结合抑制MMP-8×100倍TIMPs摩尔过剩。这进一步支持了这种观点,即膜结合MMP-8有助于pericellular胶原酶活性与中性粒细胞激活有关。此外,数据表明,位阻最有可能的机制膜结合MMP-8生理抑制剂抑制中性粒细胞躲避。大型的球状TIMPs可能形成复合物更容易与MMP-8 sterically在中性粒细胞表面与可溶性MMP-8比。这种可能性是我们实验室正在进行的研究的焦点。gydF4y2Ba

虽然MMP-8局部中性粒细胞表面有助于pericellular胶原酶活性与中性粒细胞迁移在I型胶原蛋白,也有可能隐藏的生成微环境细胞附着到I型胶原蛋白有助于这一活动。严格遵循中性粒细胞的基质可以创建一个隔间,扩散TIMPs受损,因为αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π扩散差到车厢时生成中性粒细胞坚持纤连蛋白(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。然而,I型胶原蛋白的降解受保护的微环境可能是由膜结合MMP-8,自由而不是MMP-8中性粒细胞释放的隔间。这个概念是由我们的免疫印迹分析刺激中性粒细胞的颗粒浮层显示MMP-8从中性粒细胞释放完全处于潜在的酶原形式。此外,我们先前已经表明,可溶性MMP的活动没有检测到文化上层清液从激活中性粒细胞即使细胞孵化inhibitor-free缓冲区(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。我们的数据表明,尽管TIMPs可以有效地控制活动的MMP-8自由从刺激中性粒细胞释放出来,它们是无效的抑制剂MMP-8局部中性粒细胞表面。膜结合MMP-8中性粒细胞是因此可能大幅保持其细胞外空间的活动网站的炎症。gydF4y2Ba

MMP-8表示中性粒细胞表面,至少部分催化地活跃的形式,因为:1)人类和小鼠中性粒细胞激活大量的I型胶原酶活性与细胞表面;和2)从激活中性粒细胞免疫印迹分析等离子体膜包含MMP-8,都有相同的形式gydF4y2Ba米gydF4y2Ba_rgydF4y2Ba为活跃MMP-8 (∼65 kDa)。蛋白酶(如组织蛋白酶G, MMP-3,类胰蛋白酶(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba))和活性氧产生的包括氧化剂MPO系统(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)可以激活pro-MMP-8体外。因此,它是可能的,可溶性蛋白酶和中性粒细胞所释放氧化剂和其他细胞在炎症反应激活pro-MMP-8绑定后中性粒细胞表面体内。这是值得注意的在这方面,组织蛋白酶G和MPO表达激活中性粒细胞表面(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。因此,膜结合组织蛋白酶G和MPO可以激活膜结合pro-MMP-8 juxtacrine的方式。此外,MT6-MMP也是表面结构上呈现中性粒细胞,并从细胞表面可溶性蛋白酶当中性粒细胞激活(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。MT6-MMP已被证明体外激活pro-MMP-9和2 (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),但尚不清楚是否能激活可溶性或膜结合pro-MMP-8。的机制pro-MMP-8结合并激活中性粒细胞表面将是未来研究的重点实验室。gydF4y2Ba

我们的体外研究表明MMP-8局部激活中性粒细胞表面有助于pericellular ECM-degrading中性粒细胞激活体内的活动。中性粒细胞表达其他ECM-degrading蛋白酶在细胞表面,包括丝氨酸蛋白酶(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),MMP-9 (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)和MT6-MMP (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。在这些蛋白酶中,只有MMP-8和对待有间质胶原酶活性,能够只能降低III型胶原蛋白的速度只有∼1%的间质胶原酶(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)。因此,表达MMP-8激活中性粒细胞表面增加了强有力的间质胶原酶(serpinase)活动pericellular,蛋白水解激活中性粒细胞的医疗设备。对中性粒细胞表面束缚MMP-8可能局部降解间质胶原蛋白在炎症和伤口愈合。另一个生物作用的细胞表面束缚MMP-8在中性粒细胞可能是降低serpins中性粒细胞的当地环境,因为膜结合MMP-8可以灭活αgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba-π。值得注意的是受体激动剂也会上调MMP-8本地化中性粒细胞表面诱导细胞表面丝氨酸蛋白酶表达式(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。中性粒细胞Pericellular serpinase活动由膜结合MMP-8可能加强丝氨酸蛋白酶的活动协调表达激活中性粒细胞表面在炎症。最后,我们研究MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}vs WT老鼠表明MMP-8意外,抗炎作用在肺LPS-mediated在小鼠急性肺损伤显示肺泡中性粒细胞的负担。值得注意的是在这方面MMP-8的最近的研究gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}vs WT在化学致癌模型小鼠在皮肤上表明MMP-8让早期中性粒细胞积累在皮肤上(通过解理和激活的LPS-induced科学家趋化因子)。以后点在这个模型中,MMP-8皮肤具有抗炎活性与肿瘤起始不利于环境,但这种机制是未知的(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。我们未来的目标是调查是否PMN-derived MMP-8劈开中性粒细胞趋化因子(s),使其失去活性,让肺抗炎介质,和/或促进中性粒细胞的间隙肺泡空间。因此,研究MMP-8gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠发现了意想不到的角色MMP-8调节炎症在不同的器官。此外,TIMP-resistant MMP-8,表示激活中性粒细胞表面在炎症反应,是一种生物活性的酶,可能在重要方面做出贡献的体内抗炎和其他活动,因为它是一种催化地高效和稳定,但TIMP-resistant形式的蛋白酶。gydF4y2Ba

MMP-8局部中性粒细胞表面可能是一个重要的生物活性形式的体内蛋白酶。在炎症反应,促炎介质可迅速诱导的表达MMP-8中性粒细胞表面通过组织转移。绑定的MMP-8不仅导致pro-MMP-8激活中性粒细胞表面,而且集中,稳定,和保护酶的胶原酶和serpinase活动在中性粒细胞的pericellular环境,即使在TIMPs的存在。中性粒细胞的质膜MMP-8调节时间和空间定位和其他中性蛋白酶,中性粒细胞,从而协调他们的活动在中性粒细胞的pericellular环境。虽然膜结合MMP-8可以促进中性粒细胞的生理过程,它也有能力调解组织损伤如果过度表达,长时间,或不合适的。因此,MMP-8-mediated蛋白水解事件发生中性粒细胞表面可能是至关重要的生理和病理过程。gydF4y2Ba

我们感谢罗氏生物科学的礼物gydF4y2BaRS113456gydF4y2Ba和RS104210。Jean赖我们感谢BioImaging实验室,哈佛大学公共卫生学院(波士顿),来执行应用中性粒细胞的共焦显微镜分析。gydF4y2Ba