文摘gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞招募和粘液分泌过多是哮喘气道炎症的特征,但嗜酸性粒细胞没有诱导粘蛋白的生产。因为表皮生长因子受体(EGFR)级联诱发MUC5AC在气道粘蛋白,因为在哮喘气道表皮生长因子受体上调,我们检查了嗜酸性粒细胞对MUC5AC NCI-H292细胞粘蛋白生产(人工气道上皮细胞株产生的黏蛋白)。外周血嗜酸性粒细胞是孤立的过敏患者和他们的影响gydF4y2BaMUC5AC粘蛋白基因gydF4y2Ba蛋白质合成和评估使用原位杂交和elisa。当IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5添加嗜酸性粒细胞与NCI-H292细胞培养、MUC5AC粘蛋白生产增加;嗜酸性粒细胞或细胞因子本身没有影响。嗜酸性粒细胞培养得到的上层清液嗜酸性粒细胞与IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5也增加了MUC5AC在NCI-H292细胞合成,预防的效果选择性表皮生长因子受体抑制剂(AG1478 BIBX1522)。上层清液NCI-H292嗜酸性粒细胞诱导表皮生长因子受体磷酸化激活的细胞。浮在表面的活性嗜酸性粒细胞中TGF-α蛋白质的含量增加(表皮生长因子受体配体)和诱导上调NCI-H292 TGF-α表达和释放的细胞。阻塞Ab TGF-α减少激活eosinophil-induced MUC5AC在NCI-H292细胞合成。这些结果表明,激活嗜酸性粒细胞诱导人类呼吸道上皮细胞粘蛋白合成通过表皮生长因子受体激活,他们暗示TGF-α由嗜酸性粒细胞和上皮细胞表皮生长因子受体激活,导致人类呼吸道上皮细胞粘蛋白的生产。gydF4y2Ba
著名的嗜酸性渗透到气道上皮细胞在哮喘气道炎症的特征(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和鼻息肉病(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。过多的粘液生产在急性增生性杯状细胞也报告(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)和慢性(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)哮喘和鼻息肉(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。人体组织在致命的哮喘报告显示广泛的嗜酸性粒细胞脱颗粒,特别是表面上皮粘液栓和(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),嗜酸性粒细胞计数之间的正相关关系在支气管肺泡灌洗液和痰生产一直在哮喘病人报告(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。因为Ag挑战在动物模型的过敏性哮喘气道嗜酸性导致显著的炎症反应和杯状细胞化生(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),这是表明,嗜酸性粒细胞粘液生产在过敏性疾病中发挥作用。然而,发现Th2-induced杯状细胞化生发生在没有嗜酸性粒细胞招募IL-5基因敲除小鼠导致这样的结论:嗜酸性粒细胞不会导致allergen-induced杯状细胞化生在老鼠(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。最近的研究表明,老鼠和人类之间的差异存在于嗜酸性粒细胞效应函数(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),所以粘液生产中嗜酸性粒细胞的作用在人类仍然是未知的。gydF4y2Ba
粘蛋白生产航空是诱导表皮生长因子受体(EGFR)gydF4y2Ba3gydF4y2Ba级联(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。激活表皮生长因子受体的配体(例如,EGF, TGF-α)导致MUC5AC粘蛋白基因和蛋白质合成在人类呼吸道上皮(NCI-H292)细胞在体外和表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化的选择性抑制剂预防ligand-induced粘蛋白体外合成并阻止allergen-induced杯状细胞化生在无菌鼠(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
当人类嗜酸性粒细胞被雇来的炎症,他们成为激活(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。嗜酸性粒细胞招募在癌组织中表达TGF-α(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)和人类鼻息肉(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。因为人类从外周血嗜酸性粒细胞孤立,与细胞因子在体外激活时,产生和释放TGF-α(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)在监管过程中,我们假设激活嗜酸性粒细胞刺激人类呼吸道上皮细胞粘蛋白合成通过表皮生长因子受体激活。因此,我们研究人类嗜酸性粒细胞活化的影响粘蛋白MUC5AC生产在人类呼吸道上皮细胞(NCI-H292),我们在eosinophil-induced研究表皮生长因子受体激活的作用在这些细胞粘蛋白生产。这些研究结果报道在抽象形式(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
人类被试gydF4y2Ba
外周血嗜酸性粒细胞是孤立的八个过敏与先前的历史学科血嗜酸性粒细胞(嗜酸性粒细胞计数范围,8 - 12%)。受试者年龄从28日至62年。证实了直接超敏反应积极反应皮肤试验使用prick-puncture技术,应用提取常见的过敏原(花粉、屋尘螨、草花粉,猫和狗毛,蟑螂,链格孢属)。所有的患者正在接受口服糖皮质激素。之前得到通知,书面同意参与。这项研究是由加州大学委员会批准人类研究。gydF4y2Ba
孤立的人类嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞隔离是由mac (Miltenyi研究,赤褐色,CA),与前面描述的方法进行小的修改gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。为了防止细菌污染,所有解决方案都是通过一个0.1 -μm孔隙大小过滤器。简而言之,静脉血与EDTA实际上。45分钟后沉降的6%右旋糖酐(gydF4y2Ba米gydF4y2BargydF4y2Ba140000;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),等离子体恢复,与钙稀释magnesium-free PBS,叠加在等张Percoll解决方案(密度、1.077 g / ml;在1000×Sigma-Aldrich)和离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 30分钟。上层清液和单核细胞界面很仔细,低浓度和红细胞的沉积物被溶解。孤立的粒细胞在50μl resuspended缓冲区(PBS, pH值7.2,补充0.5% BSA和2毫米EDTA) / 5×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞。同等体积的anti-CD16-conjugated磁珠(Miltenyi研究)添加到细胞颗粒。30分钟后孵化6°C,这些细胞被加载到分离柱定位强磁场的mac。细胞筛选了包含BSA与缓冲。嗜酸性粒细胞纯度计算与Diff-Quick cytospin涂片染色染色组(百特医疗、迈阿密、FL) > 98%。纯化嗜酸性粒细胞是洗两次与PBS和悬浮在RPMI 1640包含10%的边后卫,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100μg /毫升),玫瑰(25毫米)。gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞的活化和细胞因子孵化gydF4y2Ba
刚分离嗜酸性粒细胞(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/毫升)与NCI-H292细胞培养RPMI 1640年10%的边后卫在没有或IL-3的各种组合,IL-5和gm - csf (25 ng / ml;BioSource国际打击士气,CA) 24 h。据报道,这些细胞因子浓度诱导TGF-α表达式中嗜酸性粒细胞(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。在初步研究中,我们发现,嗜酸性粒细胞激活时的联合IL-3 + gm - csf或IL-5,影响粘蛋白产量明显高于单独与每个细胞因子嗜酸性粒细胞激活时(数据没有显示)。因为嗜酸性粒细胞可用于每个实验的数量是有限的,我们只用IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5实验。gydF4y2Ba
制备的嗜酸性粒细胞上层清液,新鲜纯净的嗜酸性粒细胞培养16 h在24-well板块2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/毫升仅在RPMI 1640补充10%的边后卫,IL-3 + gm - csf,或IL-3 + IL-5。16 h的文化后,嗜酸性粒细胞离心机,和上层的收集;这些嗜酸性粒细胞经常被台盼蓝染料> 95%可行的排斥。gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
NCI-H292细胞,能够表达的人类肺粘液表皮样癌细胞系黏蛋白(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),生长在RPMI 1640包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100μg /毫升、和25毫米玫瑰在37°C调湿有限公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba水套孵化器。汇合的时候,NCI-H292细胞孵化与新鲜孤立的嗜酸性粒细胞或嗜酸性粒细胞上层清液。控制,NCI-H292细胞孵化单独使用培养基(基线)或培养基和IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5。实验终止预选的时候(MUC5AC mRNA在12 h;MUC5AC蛋白质和蛋白质TGF-α24 h)。与酪氨酸激酶抑制剂抑制研究,NCI-H292细胞使用BIBX1522(选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,10μM;勃林格殷格翰集团提供的、殷格翰集团、德国)(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),tyrphostin AG1478(另一个选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,10μM;圣地亚哥Calbiochem CA) (gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),tyrphostin AG1295(血小板源生长因子受体的选择性抑制剂(PDGFR)酪氨酸激酶,10μM;Calbiochem)或tyrphostin AG9 (tyrphostins负控制,10μM;Calbiochem) 30分钟前添加一个刺激。与阻断抑制研究Ab TGF-α,上层清液是使用anti-TGF-αAb (C18,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA) 30分钟,然后加入NCI-H292细胞。的初步研究表明,预培养TGF-α(2 ng / ml)与4μg /毫升Ab完全抑制TGF-α-induced MUC5AC合成(数据没有显示)。gydF4y2Ba
MUC5AC蛋白质的免疫测定gydF4y2Ba
MUC5AC蛋白质NCI-H292细胞的细胞溶解产物和浮在表面的测量用细微的修改先前描述的方法(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。总之,上层清液(50μl)和细胞溶解产物(50μl)孵化了bicarbonate-carbonate缓冲区(50μl)在96孔板(40°C Maxisorp Nunc;费舍尔科学、圣克拉拉,CA)直到干燥。盘子洗了三次与PBS和屏蔽2% BSA,分数V (Sigma-Aldrich),在室温下1 h。板又洗了三次与PBS然后孵化50μl MUC5AC马伯(克隆45 M1, 1/500;Neo标记,弗里蒙特,CA)与PBS稀释包含渐变20 (0.05%)。1 h后PBS的盘子洗了三次,和100μl HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白共轭(1/10,000;Sigma-Aldrich)分发到每个。后1 h与PBS盘子洗了三次。颜色反应是发达与3,3′,5、5′-tetramethylbenzidine过氧化物酶解和停止2 N HgydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。吸光度是阅读在450海里。粘蛋白的总量由NCI-H292细胞产生决心(通过计算MUC5AC蛋白质在细胞溶解产物加量在24 h)细胞培养上清液,用牛颔下腺粘蛋白(I型;Sigma-Aldrich)作为标准。结果报告为毫克MUC5AC蛋白质。因为NCI-H292产生的黏液细胞的数量随细胞通道,我们表示数据的比例基线(NCI-H292细胞单独培养)在同一实验的一天。gydF4y2Ba
MUC5AC信使rna原位杂交gydF4y2Ba
MUC5AC基因表达进行原位杂交gydF4y2Ba35gydF4y2BaS-labeled riboprobes。探针的制备和原位杂交进行如前所述(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
免疫组织化学染色NCI-H292 MUC5AC蛋白质和TGF-α蛋白质的细胞gydF4y2Ba
NCI-H292细胞种植在eight-well室幻灯片和暴露在刺激24 h。在实验结束时,这些细胞被固定为4%多聚甲醛1 h,然后接受0.3% hgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在甲醇。PBS包含渐变20 0.05%和2% BSA Abs作为稀释剂。细胞孵化用鼠标马伯MUC5AC(克隆45 M1, 1/500;Neo标记)或一个马伯TGF-α(Ab2 1/250;Calbiochem)在室温下1 h。删除多余的Ab与PBS洗涤后,细胞与生物素化的孵化马anti-mouse Ab(1/250稀释;向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下1 h。结合Ab是根据标准程序可视化avidin-biotin-peroxidase复杂的方法(ABC精英设备;向量的实验室)。幻灯片和苏木精复染色。Abs MUC5AC或TGF-α省略时,没有染色观察(数据未显示)。gydF4y2Ba
免疫印迹磷酸化的表皮生长因子受体gydF4y2Ba
因为EGFR磷酸化反应刺激更容易检测到基线水平很低,NCI-H292细胞serum-starved 24 h(减少基线的EGFR磷酸化水平),然后用嗜酸性粒细胞刺激上层清液或TGF-α(0.1 ng / ml) (gydF4y2Ba24gydF4y2Ba10分钟。在抑制的研究中,上皮细胞是用BIBX1522预处理(10μM)前30分钟的刺激。刺激后,细胞被放置在冰和细胞溶解的15分钟裂解缓冲Triton x - 100年含1%,1%去氧胆酸,50 mM氟化钠,1毫米原钒酸钠,蛋白酶抑制剂(完整的迷你;罗氏公司,印第安纳波利斯)。除去不溶性材料,细胞溶解产物在10000转离心20分钟在4°C。整除的细胞溶解产物含有等量的蛋白质与EGFR Ab(孵化Ab-3 1μg /毫升;Calbiochem)和蛋白质A-agarose珠子(圣克鲁斯生物技术),结合小鼠免疫球蛋白,一夜之间在4°C。免疫沉淀反应和冷洗四次pbs 20 - 0.05%的渐变。珠子在40μl resuspended Laemmli样品缓冲(Bio-Rad大力神,CA), 5分钟加热到95°C,离心机。上层清液是7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质被转移electrophoretically聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad),在PBS孵化5%脱脂脱脂牛奶含有0.05%渐变20 1 h,然后用一个孵化anti-phosphotyrosine马伯(PY99 2μg /毫升; Santa Cruz Biotechnology). Bound Ab was visualized according to standard procedures for the avidin-biotin-alkaline phosphatase complex method (ABC kit; Vector Laboratories).
TGF-α蛋白质测定嗜酸性粒细胞上层清液和NCI-H292细胞上清液gydF4y2Ba
TGF-α蛋白在嗜酸性粒细胞上层清液和NCI-H292细胞上清液测定使用定量酶联免疫试剂盒(癌基因研究产品,波士顿,MA),遵循制造商的指示。每个样本重复测试。gydF4y2Ba
免疫组织化学染色TGF-α嗜酸性粒细胞gydF4y2Ba
刚分离嗜酸性粒细胞在RPMI 1640含血清培养16 h单独或与IL-3 + IL-5。浮在表面的收获后,细胞在4%多聚甲醛固定为30分钟。Cytospin涂片准备,进行免疫组织化学染色的马伯TGF-α(Ab2 1/250;Calbiochem)。作为一个负控制我们使用了一个无关紧要的老鼠免疫球蛋白Ab (DAKO Carpinteria, CA)。染色技术,见上面的描述NCI-H292细胞的免疫组织化学染色。幻灯片和苏木精复染色。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
ELISA结果的分析测量MUC5AC蛋白质、单向重复测量方差分析是用于原始数据(毫克的粘蛋白)来确定组间显著差异。统计显著性方差分析中确定的时候,Student-Newman-Keuls测试被用于多个比较。从TGF-α蛋白质测量获得的数据使用成对的嗜酸性粒细胞上层清液进行了分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。ELISA的测量得到的数据TGF-α蛋白质在细胞NCI-H292上层清液不是正态分布(不平等SDs)和使用非参数Wilcoxon试验进行了分析。一个gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为零假设被接受指示一个统计上的显著差异。因为NCI-H292细胞在基线变量产生大量的黏液,随细胞通道,我们表示数据的比例基线(NCI-H292细胞仅在同一实验)±SEM。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞激活调控MUC5AC基因和蛋白质表达gydF4y2Ba
当NCI-H292细胞与嗜酸性粒细胞的培养IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5,粘蛋白产量显著高于基线增加(+ 33.4±9.4%,+ 37.2±9.6%,分别;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。然而,当NCI-H292细胞与嗜酸性粒细胞单独培养,没有显著增加MUC5AC NCI-H292细胞中蛋白质发生(+ 7±3.7%;gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.1;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。同样,当NCI-H292细胞培养与IL-3 + gm - csf单独或与IL-3 + IL-5独自(没有嗜酸性粒细胞),没有明显改变MUC5AC粘蛋白生产(+ 1.3±1.83%,+ 2.5±2.7%,分别;gydF4y2BapgydF4y2Ba> 0.1;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。gydF4y2Ba
治疗NCI-H292细胞转化生长因子-α(1 ng / ml)积极控制粘蛋白生产(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),也增加了MUC5AC蛋白质产量显著高于基线(+ 36±8%;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。gydF4y2Ba
接下来,我们检查是否从嗜酸性粒细胞分泌物质引起粘蛋白合成。嗜酸性粒细胞是培养16 h,然后上层清液分离的嗜酸性粒细胞和孵化NCI-H292细胞。嗜酸性粒细胞的上层清液培养与IL-3 + gm - csf或IL-3 + IL-5 NCI-H292 MUC5AC蛋白质生产细胞显著增加,但嗜酸性粒细胞的上层清液培养独自没有显著的影响(图。1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。同样的,当NCI-H292细胞培养与上层清液的嗜酸性粒细胞激活IL-3 + IL-5,疣状MUC5AC蛋白增加,但当NCI-H292细胞单独培养的嗜酸性粒细胞的上层清液培养(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,gydF4y2Ba上面板gydF4y2Ba)。因为MUC5AC在NCI-H292细胞粘蛋白合成反应激活嗜酸性粒细胞的上层清液与嗜酸性粒细胞激活反应本身,我们得出的结论是,激活嗜酸性粒细胞的作用粘蛋白的合成与分泌的产品。因此,与嗜酸性粒细胞上层清液进行后续研究。gydF4y2Ba
原位杂交进行评估的影响嗜酸性粒细胞上层清液在NCI-H292 MUC5AC信使rna合成细胞。嗜酸性粒细胞的上层清液培养IL-3 + IL-5增加MUC5AC mRNA表达NCI-H292细胞,而嗜酸性粒细胞的上层清液培养独自没有显著的影响(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba较低的面板gydF4y2Ba)。意义上探究MUC5AC mRNA在所有条件下没有MUC5AC的表达(数据没有显示)。gydF4y2Ba
选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂防止MUC5AC合成诱导激活嗜酸性粒细胞的上层清液gydF4y2Ba
因为表皮生长因子受体酪氨酸激酶激活导致NCI-H292粘蛋白生产细胞(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),我们审查的影响选择性抑制剂的表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化激活eosinophil-induced MUC5AC生产。预处理与选择性NCI-H292细胞表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522 AG1478)阻止本构和激活eosinophil-induced MUC5AC蛋白质生产(图。3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),但选择性PDGFR酪氨酸激酶抑制剂(AG1295)和负控制tyrphostin (AG9)没有影响。同样,选择性表皮生长因子受体抑制剂BIBX1522阻止supernatant-induced老年病MUC5AC的疣状蛋白质(图。2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba上面板gydF4y2Ba)和预防老年病MUC5AC mRNA表达(图2所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba较低的面板gydF4y2Ba在NCI-H292细胞)。gydF4y2Ba
表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化激活嗜酸性粒细胞的上层清液gydF4y2Ba
此前报道,TGF-α、表皮生长因子受体配体诱导表皮生长因子受体磷酸化在NCI-H292细胞(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。嗜酸性粒细胞的上层清液培养IL-3 + IL-5也诱导表皮生长因子受体磷酸化(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),没有观察到影响上层清液的嗜酸性粒细胞单独培养。BIBX1522阻止激活eosinophil-induced EGFR磷酸化。gydF4y2Ba
在激活作用的表皮生长因子受体配体TGF-αeosinophil-induced MUC5AC蛋白质合成gydF4y2Ba
在一系列的实验中嗜酸性粒细胞的上层清液培养IL-3 + IL-5增加MUC5AC粘蛋白生产用ELISA NCI-H292细胞(+ 36.4±9.34%以上基线;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5嗜酸性粒细胞捐助者);当这些上层清液preincubated anti-TGF-α阻塞Ab, MUC5AC粘蛋白产量显著降低(+ 14.8±6.6%以上基线;gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05与嗜酸性粒细胞激活)的影响。这些结果表明粘蛋白生产TGF-α诱导激活嗜酸性粒细胞。因此,我们研究了TGF-α的潜在来源。首先,我们测量TGF-α嗜酸性粒细胞上层清液通过ELISA。嗜酸性粒细胞的上层清液培养仅包含少量的TGF-α(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),与一个稀疏染色Ab TGF-α(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba左面板gydF4y2Ba),但是上层清液的嗜酸性粒细胞激活IL-3 + IL-5包含大量增加TGF-α蛋白质(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),显示出激烈的颗粒染色TGF-α蛋白质(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba中间面板gydF4y2Ba)。接下来,我们假设TGF-α-mediated激活嗜酸性粒细胞对粘蛋白生产的影响可能是部分相关影响激活嗜酸性粒细胞TGF-α生产的气道上皮细胞。因此,我们孵化NCI-H292细胞与嗜酸性粒细胞上层清液和TGF-α进行免疫组织化学染色。NCI-H292细胞表达TGF-α蛋白质结构上(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba左面板gydF4y2Ba)。浮在表面的嗜酸性粒细胞与IL-3 + IL-5诱导培养杰出的TGF-αNCI-H292细胞染色(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba右面板gydF4y2Ba),而治疗NCI-H292上层清液的细胞嗜酸性粒细胞单独培养(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba中间面板gydF4y2Ba)或单独使用IL-3 + IL-5(没有显示)没有效果。接下来,我们通过ELISA测定可溶性TGF-αNCI-H292细胞上清液;TGF-αNCI-H292细胞上清液浓度分别为1.86±0.54 pg / ml(范围0.64 - -4.42 pg / ml)在基线和13.87±7.69 pg / ml(范围0.84 - -50.35 pg / ml)孵化24 h后上层清液的嗜酸性粒细胞培养IL-3加上IL-5 (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;gydF4y2BangydF4y2Ba= 6)。细胞因子单独或上层的嗜酸性粒细胞的培养就没有显著的影响(数据没有显示)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们研究是否嗜酸性粒细胞诱导MUC5AC在气道上皮细胞粘蛋白合成。我们的研究结果表明,激活人类引起嗜酸性粒细胞MUC5AC在NCI-H292细胞粘蛋白合成。同样,上层清液激活嗜酸性粒细胞诱导MUC5AC基因和蛋白质合成的NCI-H292细胞,表明这种影响激活嗜酸性粒细胞分泌相关产品。gydF4y2Ba
据报道,因为表皮生长因子受体激活导致粘蛋白合成(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),我们检查了表皮生长因子受体激活是否需要激活eosinophil-induced粘蛋白合成。NCI-H292细胞激活嗜酸性粒细胞上层清液诱导表皮生长因子受体磷酸化,和选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂阻止激活eosinophil-induced EGFR磷酸化和MUC5AC合成完全;选择性PDGFR抑制剂(AG1295)和负控制tyrphostins (AG9)没有影响。这些发现表明EGFR酪氨酸激酶磷酸化粘蛋白合成引起嗜酸性粒细胞激活。此外,选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抑制基线在气道上皮细胞粘蛋白生产(NCI-H292)细胞,证明基线粘蛋白生产依赖于表皮生长因子受体激活。这一发现表明,自分泌表皮生长因子受体的激活在气道上皮细胞负责基线粘蛋白的生产。gydF4y2Ba
表皮生长因子受体配体(如TGF-α)与表皮生长因子受体结合并激活磷酸化产生粘蛋白(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。因为嗜酸性粒细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)和气道上皮细胞如NCI-H292细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)据报道,产生TGF-α,我们检查的作用在eosinophil-induced TGF-α粘蛋白合成。首先,我们发现,嗜酸性粒细胞释放TGF-α激活。接下来,我们检查的影响嗜酸性粒细胞上层清液在TGF-α气道上皮细胞表达和释放。嗜酸性粒细胞激活引起的浮在表面的突出TGF-α蛋白质染色在气道上皮细胞,增加浓度的可溶性TGF-αNCI-H292细胞上清液。重要的是,一个阻塞Ab TGF-αeosinophil-induced黏液减少生产。因此,本研究首次表明,激活人类嗜酸性粒细胞引起人类呼吸道上皮细胞粘蛋白生产表皮生长因子受体激活至少部分归因于TGF-α的生产。然而,目前的研究没有评估多少TGF-α效应是由于它的释放嗜酸性粒细胞和上皮细胞。表皮生长因子受体酪氨酸激酶活性的封锁阻止eosinophil-induced粘蛋白生产完全,但治疗TGF-α马伯只减少eosinophil-induced粘蛋白生产,建议其他的表皮生长因子受体的激活机制的存在。其他的表皮生长因子受体配体(如heparin-binding EGF,上调激活嗜酸性粒细胞(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba))或ligand-independent效应(如氧自由基(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)也可以在反应中发挥的作用。gydF4y2Ba
50-aa成熟TGF-α合成为一个细胞外领域的一部分160 aa (gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)膜结合前体proTGF-α(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。新合成proTGF-α被蛋白水解酶裂解,导致释放可溶性TGF-α(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。可溶性,成熟的形式TGF-α比膜结合形式的TGF-α(更有效gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。在这项研究中我们发现,浮在表面的活性嗜酸性粒细胞诱发突出TGF-α染色在气道上皮细胞,这表明一个产品的嗜酸性粒细胞导致气道上皮TGF-α蛋白的生产。接下来,我们测量可溶性TGF-αNCI-H292上层清液的细胞,我们发现低,但增加,浓度的可溶性TGF-α孵化后上层清液的嗜酸性粒细胞激活。因为NCI-H292细胞表达表皮生长因子受体(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba表皮生长因子受体),因为绑定,TGF-α内化和退化(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),浓度的可溶性TGF-αNCI-H292细胞上清液取决于两个释放可溶性TGF-α(通过解理proTGF-α)表皮生长因子受体和TGF-α绑定。因此,测量浓度的TGF-αNCI-H292细胞上清液都是相对的,不能反映实际的可溶性TGF-α从上皮细胞释放。然而,这些发现表明,激活嗜酸性粒细胞裂解的产物膜结合proTGF-α在气道上皮细胞,导致释放可溶性TGF-α活跃。嗜酸性粒细胞可能释放弹性蛋白酶(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)和metalloproteases (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),可以扮演一个角色在proTGF-α的蛋白水解乳沟。然而,TGF-α释放机制气道上皮细胞,以应对嗜酸性粒细胞上层清液仍有待调查。gydF4y2Ba
以前的研究报道血液中嗜酸性粒细胞(之间的正相关关系(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)和航空公司(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba))和哮喘痰生产增加,表明嗜酸性粒细胞可能参与粘液分泌过多。类似地,在慢性阻塞性肺疾病,给我们et al。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)在急性加重痰嗜酸性粒细胞增多,报道和Haraguchi et al。(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)之间的正相关报道气道嗜酸性粒细胞和杯状细胞化生的存在的病人死于会攻击。负相关性也被用来反对粘液分泌过多的嗜酸性粒细胞的作用。过敏原致敏小鼠结果嗜酸性粒细胞浸润到航空公司和杯状细胞化生,最初提出一个可能的关系(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。C57BL / 6 IL-5然而,基因敲除小鼠,过敏原致敏不再引起嗜酸性粒细胞招募,但仍然引起的杯状细胞化生,作者得出结论:嗜酸性粒细胞不感应粘液生产必不可少的(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。然而,老鼠嗜酸性粒细胞(包括C57BL / 6)后不会出现布满Ag)刺激体内(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),而在哮喘气道组织嗜酸性粒细胞显示脱粒(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。体外,人类,但不是鼠标,嗜酸性粒细胞布满在刺激(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。这些结果表明,发现在老鼠身上可能不反映人类的影响。gydF4y2Ba
健康受试者几乎没有循环嗜酸性粒细胞,使得研究难以执行。因此,目前的研究进行了与嗜酸性粒细胞隔绝过敏患者血液嗜酸性粒细胞。因为许多过敏性哮喘病人,结果与嗜酸性粒细胞相关过敏性气道疾病。此外,在本研究嗜酸性粒细胞隔绝过敏主题和培养独自没有显著影响气道上皮细胞粘蛋白的生产,而嗜酸性粒细胞激活或激活嗜酸性粒细胞诱导的上层清液粘蛋白生产增加了气道上皮细胞。因此,嗜酸性粒细胞的活化似乎是影响粘蛋白生产的关键。gydF4y2Ba
目前的研究与人类疾病如何?目前的体外研究表明,激活人类嗜酸性粒细胞诱导人类呼吸道上皮细胞粘蛋白生产通过激活一个EGFR级联。有关人类体内的研究是有限的,只有暗示。Takeyama et al。(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba发现广泛的表皮生长因子受体在哮喘,但不是在健康、气道上皮细胞;Burgel et al。(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)发现了一个类似的表皮生长因子受体表达增加鼻息肉,但不是在健康的鼻上皮。这两项研究报道colocalization EGFR和粘蛋白的杯状细胞。这些研究表明,表皮生长因子受体表达之间存在关系和粘蛋白表达在这些疾病。gydF4y2Ba
除了表皮生长因子受体的存在,必须激活受体配体(例如,通过绑定)对表皮生长因子受体酪氨酸磷酸化发生,导致粘蛋白的表达。嗜酸性粒细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)和气道上皮细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)可以产生表皮生长因子受体配体,TGF-α。目前的研究表明,激活嗜酸性粒细胞分泌TGF-α,嗜酸性粒细胞的产物也会增加TGF-α表达在上皮。林等。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba在鼻炎)报道TGF-α-positive染色,但不是在健康的鼻上皮。我们建议嗜酸性粒细胞可能参与的老年病TGF-α气道上皮细胞的疾病。gydF4y2Ba
粘蛋白分泌过多涉及两个过程:生产和粘蛋白分泌粘蛋白。目前的研究表明,嗜酸性粒细胞分泌引起粘蛋白生产的产品。一项研究报道,嗜酸性粒细胞过氧化物酶和主要碱性蛋白抑制从气管上皮细胞粘蛋白释放文化(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。黏蛋白后产生的,也许其他分子在嗜酸性粒细胞和其他细胞(如中性粒细胞(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)可能需要eosinophil-associated分泌过多的疾病。gydF4y2Ba
当表皮生长因子受体抑制剂可用于临床疾病与嗜酸性粒细胞浸润有关,这里给出的证据概念的评估。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项工作是由私人基金支持。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba地址对应博士和重印请求杰伊·a·纳达尔心血管研究所、箱0130年,加州大学,旧金山,CA 94143 - 0130。电子邮件地址:gydF4y2Bajanadel在}{itsa.ucsf.edugydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba3gydF4y2Ba略语摘要:表皮生长因子受体、表皮生长因子受体;PDGFR,血小板源生长因子受体。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2001年6月5日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2001年9月10日。gydF4y2Ba
- 版权©2001年由美国免疫学家协会gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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