ORMDL3转基因小鼠气道重塑和增加哮喘的气道反应性特征

本文的特色在这个问题上,p.3453

Orosomucoid-like (ORMDL) 3是一个17号染色体基因局部温度系数,最初与哮喘有关的全基因组关联研究(1),随后确认在多个额外的全基因组关联研究(2- - - - - -4)和非全基因组关联研究遗传关联研究不同种族背景的人群中(5- - - - - -10)。ORMDL3与严重的哮喘(4,9)、儿童哮喘发作(1,7,8),儿童接触环境烟草烟雾,和哮喘的风险(2,10),以及rhinoviral气喘儿童哮喘发作的疾病和遗传风险(11),强调理解其功能的重要性。ORMDL3属于三ORMDL基因家族成员(ORMDL1、2、3),该编码跨膜蛋白位于内质网(ER) (12)。ORMDL1染色体(2)(12染色体)和ORMDL2 (12) (1217号染色体)在不同的染色体ORMDL3(温度系数)(12),没有与哮喘有关。人类和小鼠表达相同的三个ORMDL家庭成员,ORMDL3表现出96%这两个物种之间的身份(12)。ORMDL3是两个预测153 - aa蛋白质跨膜域(12)。我们最近在野生型小鼠(WT)表明,ORMDL3过敏原和Th2细胞因子(il - 4或IL-13)诱导基因局部ER和高表达在气道上皮细胞(13)。过敏原挑战诱导127倍增加ORMDL3 mRNA在WT小鼠支气管上皮,与较小的15倍增加ORMDL2 ORMDL1没有变化(13)。我们也表明转染ORMDL3人类支气管上皮细胞体外诱导表达CC趋化因子(也称为MIP-3αCCL20) (13),科学家趋化因子(引发;CXCL10,也称为IFN-γ-induced蛋白10 [IP-10];CXCL11,也称为IFN-inducible T细胞α(ITAC)) (13),metalloproteases(基质金属蛋白酶9 (MMP);disintegrin和金属蛋白酶domain-containing蛋白质8 [ADAM8]) (13),选择性地激活激活转录因子6 (ATF6) (13),三种ER展开的蛋白质反应(UPR)通路转录因子(14)和后续监管的石棺/内质网钙^{2 +}腺苷三磷酸酶(SERCA2b),涉及在哮喘气道重塑(15)。因此,这些研究与支气管上皮在WT小鼠和正常的人类支气管上皮细胞显示了重要作用的途径,初步归纳ORMDL3与后续ATF6-dependent通路的激活(即。SERCA2b)和/或ATF6-independent通路(MMP-9, ADAM8、CCL20 CXCL10, CXCL11)可能导致哮喘的发病机制。

虽然我们以前的研究表明Ormdl3是一种过敏原,Th2 cytokine-inducible取决于Stat6基因表达(13WT老鼠之前),这些研究没有确定哪些下游通路被ORMDL3体内调节。解决这个问题我们已经生成ORMDL3转基因小鼠(Tg),在这项研究中我们证明了Tg老鼠overexpressing人类ORMDL3 (hORMDL3)自发发展水平显著增加气道重塑(平滑肌、纤维化、粘液)之前气道炎症的发展。此外,过敏原的挑战ORMDL3 Tg老鼠导致增强OVA-specific IgE反应相比OVA-challenged WT老鼠和增加主要碱性蛋白(MBP)积极支气管旁嗜酸性粒细胞和肺部的il - 4水平。这些研究在ORMDL3 Tg老鼠也提供了证据表明,ER-localized ORMDL3中发挥着重要作用的选择性激活体内的三个UPR的途径之一。,ATF6), and that expression of ORMDL3 in vivo regulates airway remodeling (smooth muscle, fibrosis, mucus) potentially through ATF6 target genes such as SERCA2b and/or through ATF6-independent genes (TGF-β1, ADAM8), which we detected at increased levels in the lungs of ORMDL3 Tg mice. ORMDL3 may therefore activate several pathways important to the pathogenesis of airway remodeling and asthma in vivo.

Zp3 -Cre(小鼠胚胎Cre表达式)对C57BL / 6背景从杰克逊实验室获得的。

老鼠实验协议都是批准的加州大学圣地亚哥机构动物保健和使用委员会。

hORMDL3 Tg构造pCAGEN Lox红色荧光蛋白(RFP) -H2B停止Lox hORMDL3被克隆生成462 - bp hORMDL3开放阅读框从pCMV6-AC-ORMDL3 (Origene) Agel / Notl构造之前开发的,由A.J.荷兰和D.W.克利夫兰(路德维希癌症研究所加州大学圣地亚哥,CA)。

? / Pvul-linearized pCAGEN Lox RFP-H2B停止Lox hORMDL3 (图1一个,1 b)是microinjected pronuclei受精的小鼠胚胎,植入pseudopregnant鼠标(所有C57BL / 6背景)通过建立协议由加州大学圣地亚哥鼠标Tg的核心。后代被PCR筛选转基因的存在。随后老鼠的基因进行用PCR引物如下:f1 - 3530、5′gca ACG TGC TGG TTA TTG TG-3′;f2 - 4009、5′ccc有条件现金援助棉酚有条件现金援助棉酚ACA TA-3′;r - 4644、5′tac AGC ACG ATG GGT GTG 3′(图1 c)。这些RFP-Stop^FLhORMDL3-Tg小鼠C57BL / 6(背景)与zp3——交叉Cre小鼠C57BL / 6(背景)生成hORMDL3^zp3-Cre老鼠(C57BL / 6背景)。

hORMDL3^zp3-Cre老鼠和同窝出生仔畜控制安乐死在不同年龄段(4 8和26周)量化的气道炎症水平,气道重塑,以及表达的细胞因子,趋化因子,基因改造。除了检查整个肺部,纯化的数量选择肺细胞类型(支气管上皮细胞、支气管肺泡灌洗(BAL)巨噬细胞)也进行了研究。的IgE水平和其他Igs在外周血中量化。

肺处理对蛋白质和RNA提取,以及免疫组织学(石蜡包埋肺部分)如前所述在这个实验室(13,16)。蛋白质和RNA提取、肺最初在液氮和存储snap-frozen−80°C。石蜡包埋的部分,肺部都等同于膨胀的气管内的注入同样体积的4%多聚甲醛溶液(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)保护肺的架构。免疫组织化学检测MBP肺部分处理(anti-mouse MBP Ab是由詹姆斯·李,梅奥诊所,斯科茨代尔,AZ),中性粒细胞弹性蛋白酶(anti-mouse Ab中性粒细胞弹性蛋白酶;圣克鲁斯生物技术)、F4/80 (anti-mouse F4/80 Ab;圣克鲁斯生物技术)和CD4 (anti-mouse CD4 Ab;GeneTex)。单个细胞染色阳性的数量不同的细胞在支气管旁空间使用光学显微镜计数。结果表示为每细支气管和支气管旁细胞染色阳性的数量150 - 200μm内部直径。至少10细支气管在每个幻灯片数。

在选定的实验中,纯化BAL巨噬细胞的数量(纯度> 98%)获得通过附着力将10厘米BAL细胞培养皿放置在完成媒体4 h在37°C如前所述在这个实验室(13)。汇集BAL巨噬细胞从每组四只老鼠被用于提取RNA和蛋白质。

支气管上皮细胞的隔离是执行如前所述在这个实验室(13,17)。简单,使用无菌塑料喂食管上皮刷了所罗门(科学)插入正确的主要和左主支气管与温柔立即刷牙和放置在RNA STAT-60 (Tel-Test) RNA的提取。支气管上皮细胞的纯度> 95%,钙粘蛋白表达在流式细胞仪和组织学检测评估的纤毛上皮细胞(13,17)。每组四只老鼠被用于每个数据点。

BAL收集的液体灌洗肺1毫升PBS通过气管导管(如前所述)(16)。BAL流体是离心机,上层清液冻结在随后的细胞因子分析−80°C。

周边血液由心脏穿刺获得小鼠成管状无抗凝剂添加定量的血清搞笑的水平。

如前所述在这个执行定量rt - pcr实验室(13)。总之,提取总RNA, RNA STAT-60 (Tel-Test)和反向转录与低聚糖(dT)和上标第二设备(技术)。与TaqMan PCR定量PCR进行混合和ORMDL1大师,ORMDL2, ORMDL3(人类和小鼠),SERCA2b, TGF-β1,ADAM8、MMP-9, ITAC, IP-10引物从应用生物系统公司(所有)。相对大量的成绩单是规范化的看家基因(GAPDH) mRNA和比较不同基因之间的ΔΔCt方法如前所述在这个实验室(13)。

气道平滑肌层的厚度是衡量α-smooth肌肉肌动蛋白免疫组织化学(如前所述)(16)。肺癌部分是应用一个anti-α-smooth肌肉肌动蛋白主要Ab (Sigma-Aldrich)检测支气管旁平滑肌。物种——isotype-matched Abs作为控制主Ab。支气管旁的面积α-smooth肌肉肌动蛋白染色石蜡包埋下提出了肺和量化光学显微镜(徕卡摘要,徕卡Microsystems)连接到一个图像分析系统(Image-Pro +,媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)如前所述(16)。结果的面积表示为支气管旁α-smooth肌肉肌动蛋白染色/千分尺细支气管基底膜的长度150 - 200μm内部直径。

石蜡包埋的肺支气管旁的面积三色的染色是概述了光学显微镜和量化(徕卡摘要,徕卡Microsystems)连接到一个图像分析系统(Image-Pro +媒体控制论)如前所述(16)。结果表示为三色的染色的面积/千分尺细支气管基底膜的长度150 - 200μm内部直径。

肺胶原蛋白的量测量如前所述在这个实验室(16),胶原蛋白测定工具,使用染色剂,选择性地结合哺乳动物胶原蛋白的n [Gly-X-Y]三肽序列(Biocolor Newtonabbey,英国)。在所有的实验中,胶原蛋白的标准是用来校准分析。

量化的水平气道粘液表达式,周期性的数量acid-Schiff (PAS)⁺并不是⁻在个人细支气管上皮细胞数如前所述在这个实验室(16)。至少10细支气管在每个幻灯片数。结果表示为PAS的百分比⁺细胞每细支气管,不是数量的计算⁺每支气管上皮细胞总数除以每个细支气管的上皮细胞。

肺组织在500年被均质μl裂解缓冲和100毫克不锈钢珠(再)5分钟使用子弹搅拌机均质器(下推进)。溶菌产物离心机在13000转10分钟在4°C。上层清液用于ELISA和西方的印迹。

BAL流体和肺的水平选择Th2细胞因子(il - 4、IL-5 IL-13)和趋化因子(eotaxin-1)是由ELISA根据制造商的指示(研发系统)。的肺il - 4水平,IL-5、IL-13 eotaxin-1表示为细胞因子/趋化因子在皮克的数量每毫克肺蛋白质。肺bicinchoninic酸蛋白质含量测定的方法(热科学)。

肺蛋白质在sds - page凝胶分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜被封锁在5% (w / v)牛奶1×Tris-buffered盐水渐变20 1 h,然后孵化与主Ab一夜之间在4°C。本研究中使用的主要Abs鼠单克隆anti-SERCA2b (Abcam)和兔单克隆anti-GAPDH (Genetex)。

肺部分hORMDL3^zp3-Cre和WT老鼠应用anti-TGF-β1,anti-ADAM8, SERCA2b,或anti-MMP-9 Abs。表达水平TGF-β1,ADAM8、SERCA2b或MMP-9支气管上皮细胞(概述和可视化附带一个光学显微镜图像分析系统)是由图像分析量化描述(18)。Image-Pro + 3的图片保存和分析软件(媒体控制论)。支气管上皮细胞免疫染色强度的平均值是规范化支气管上皮的面积。

血清总IgE量化的IgE酶联免疫试剂盒(BD生物科学)。血清免疫球蛋白(IgG1和IgG2a), IgM, IgA量化使用鼠标搞笑同形像酶联免疫试剂盒(BD Pharmingen)和结果报告为OD在450 nm /制造商的指示。血清OVA-specific IgE量化了鼠标OVA-specific IgE工具包(BioLegend)和结果报告为毫微克每毫升。ELISA板都是读Bio-Rad模型680标。

纯化的巨噬细胞(> 95%的纯)是从hORMDL3生成的^zp3-Cre和WT老鼠骨髓细胞培养在媒体(Gibco)补充完整的DMEM干细胞生长因子(L细胞媒体,美式文化集合)10 d描述(19)。激活ATF6检测与免疫荧光显微镜检测核本地化ATF6使用ATF6 Ab (Imgenex)如前所述13,20.)。激活inositol-requiring酶1 (Ire1)由PCR检测,因为它消除了UPR unspliced形式的基因内区XBP1生成XBP1 mRNA的拼接形式(13,20.)。激活蛋白激酶受RNA-like内质的reticulum-associated激酶(活跃)评估水平的提高phospho-eIF2α通过免疫印迹使用Ab具体eIF2α的磷酸化形式(13,20.)。thapsigargin所有UPR的实验,一个已知的活化剂的UPR孵化了细胞1 h之前收集细胞核糖核酸或蛋白质分析。因为没有足够多的支气管上皮细胞对UPR免疫印迹的研究是可行的,UPR进行研究巨噬细胞,细胞类型,类似于上皮细胞表达高水平的ORMDL3 (13)。

hORMDL3^zp3-Cre和同窝出生仔畜控制老鼠12岁工作是敏化和挑战与卵子(沃辛顿,莱克伍德,新泽西)如前所述(13)。总之,小鼠致敏ip有100μg卵子和2毫克氢氧化铝(Imject明矾;热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)总额200μl PBS 0和10天之后,鼻内政府200年20μl PBSμg卵子天21日23岁,25岁。Non-OVA-challenged ORMDL3 Tg和同窝出生仔畜组小鼠致敏和挑战PBS。24小时后过去的挑战,BAL液体,肺和血液收集如上所述。

醋甲胆碱气道反应是评估在气管插管和通风小鼠年龄在12周(n= 8老鼠/组)(flexiVent通风机;Scireq)与氯胺酮麻醉(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)ip(如前所述)(16)。动态气道阻力和倒电容测定使用Scireq软件在小鼠暴露于喷雾PBS和醋甲胆碱(0、3、24和48毫克/毫升)。以下使用呼吸机设置:潮汐卷(10毫升/公斤),频率(150 /分钟)和呼气末正压通气(3而言不啻₂O)。增加倒电容值信号的刚度增加肺部,倒电容是合规的倒数(Scireq)。

所有结果都意味着±SEM。一个统计软件包(GraphPad棱镜;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于分析。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

执行hORMDL3 Tg研究老鼠,我们生成的条件(RFP-Stop hORMDL3 Tg液氧老鼠^FLhORMDL3-Tg老鼠)pCAGEN lox RFP-H2B停止lox hORMDL3转基因构造(图1一个,1 b),越过这些透明带3 (zp3) Cre老鼠,导致后代与人类ORMDL3在所有细胞(hORMDL3的表情^zp3-Cre老鼠)(21)。转基因构建我们开发loxP-flanked RFP和转录终止密码子的转录起始位点定位在hORMDL3转基因可以阻止转录hORMDL3 (图1一个)。因此,在这个RFP-Stop所有细胞^FLhORMDL3-Tg鼠标才会表达hORMDL3交叉Cre-expressing鼠标,将转录终止密码子和RFP (图1 b)。我们使用PCR (图1 c)确认成功表达hORMDL3 hORMDL3转基因^zp3-Cre老鼠。的存在nonexpressed液氧RFP-Stop转基因构建^FLhORMDL3-Tg小鼠组织/细胞被红色荧光穿越前评估zp3 Cre老鼠。穿越RFP-Stop^FLhORMDL3-Tg老鼠zp3 Cre老鼠导致RFP表达细胞的损失,旨在提供一个快速的初始屏幕成功表达hORMDL3 (图1一个,1 b)。然而,由于水平RFP的检测到免疫荧光显微镜在RFP-Stop千差万别^FLhORMDL3-Tg老鼠,我们利用hORMDL3 PCR,而不是失去红色fluoresecence检测hORMDL3表达式。hORMDL3^zp3-Cre老鼠overexpressing hORMDL3持续在所有细胞是可行的且没有明显的发育或形态缺陷(图1 d),他们的肺大小和重量和类似WT老鼠(图1 e,1 f)。

水平的人类ORMDL3转基因hORMDL3中高度表达^zp3-Cre小鼠肺(图1克)、支气管上皮细胞(图1 h),BAL巨噬细胞(图1我通过定量rt - pcr)作为评估。相比之下,没有表达的人类ORMDL3 WT同窝出生仔畜中检测出转基因小鼠(后来称为WT) (图1胃肠道)。鼠标和鼠标ORMDL1水平、鼠标ORMDL2 ORMDL3 hORMDL3^zp3-Cre老鼠不改变鼠标肺(图1 j)、支气管上皮细胞(图1 k),BAL巨噬细胞(图1 l通过定量rt - pcr)作为评估。

hORMDL3^zp3-Cre小鼠哮喘气道重构特征的证据在4周的年龄、生活持续到26周(图2)。在hORMDL3气道重构的特征明显^zp3-Cre老鼠包括支气管旁的面积增加平滑肌作为anti-α-smooth评估通过疣状肌肉肌动蛋白Ab (图2 a - c),支气管旁增加纤维化评估支气管旁的面积三色的染色法检测肺胶原蛋白(图2 d-f)和增加肺总胶原蛋白(图2 g)。此外,有一个显著增加粘液表达式被PAS染色(图2 h l)。尽管支气管旁平滑肌的水平(图2 c)和支气管旁纤维化评估三色的染色(图2 f)保持稳定从星期4 - 26周,增加水平的粘液继续从第4周增加到26周(图2 j)。

我们先前已经表明,体外转染ORMDL3只激活的三个途径之一UPR(即。,激活ATF6途径而不是Ire1或活跃通路)(13)。确定体内hORMDL3激活了UPR我们从WT和hORMDL3培养骨骨髓来源的巨噬细胞^zp3-Cre老鼠有足够数量的细胞进行免疫印迹。hORMDL3^zp3-Cre小鼠巨噬细胞,但不是WT巨噬细胞,自发激活ATF6通路所评估的易位ATF6从分散的ER细胞核使用免疫荧光显微镜(图3,3 b)。相比之下,WT和hORMDL3^zp3-Cre小鼠巨噬细胞没有激活Ire1 (图3 c)或活跃(图3 d)的途径。孵化WT hORMDL3^zp3-Cre与thapsigargin小鼠巨噬细胞,一个已知的活化剂的UPR ATF6诱导激活(图3,3 b),Ire1 (图3 c)和活跃(图3 d)在WT和hORMDL3通路^zp3-Cre老鼠巨噬细胞。因此,从hORMDL3骨骨髓来源的巨噬细胞^zp3-Cre老鼠,类似与ORMDL3体外细胞转染(13),表现出选择性激活ATF6 UPR的途径。

因为SERCA2b参与哮喘气道重塑(15),我们检验水平的SERCA2b hORMDL3调制^zp3-Cre老鼠。我们的研究表明hORMDL3^zp3-Cre老鼠增加了肺SERCA2b水平评估的定量rt - pcr (图4)和免疫印迹(图4 b)。此外,hORMDL3^zp3-Cre小鼠支气管上皮的表达水平增加TGF-β1 (图4摄氏度)和ADAM8 (图4 d),增加小MMP-9 (图4 e通过定量rt - pcr)作为评估。TGF-β1水平(图4 f),ADAM8 (图4 g)和SERCA2b (图4 h),但不是MMP-9(数据未显示),增加在hORMDL3支气管上皮细胞^zp3-Cre小鼠的免疫组织化学和图像分析定量的评估。

因为我们曾表明转染ORMDL3体外诱导高水平的科学家的表达趋化因子(引发;也称为IP-10 CXCL10;CXCL11,也称为ITAC) (13)和低水平的CC趋化因子(也称为MIP-3αCCL20) (13),我们测量这些趋化因子水平定量PCR hORMDL3^zp3-Cre老鼠。hORMDL3^zp3-Cre小鼠肺科学家趋化因子mRNA水平有了显著提高,包括CXCL10在支气管上皮细胞(图4我),以及增加CXCL11 mRNA水平BAL巨噬细胞(图4 j),而肺KC mRNA水平,引发的小鼠等效,并没有增加(数据未显示)。水平的选择CC趋化因子mRNA (CCL20及eotaxin-1)也不不同的肺,支气管上皮细胞,或在hORMDL3 BAL巨噬细胞^zp3-Cre相比WT老鼠(数据未显示)。

hORMDL3^zp3-Cre4周的老鼠表现出显著的气道重塑年龄(图2),一个时间点,目前没有证据表明任何支气管旁CD4的增加⁺细胞(图5),F4/80⁺巨噬细胞(图5 b),MBP⁺嗜酸性粒细胞(图5度),或中性粒细胞弹性蛋白酶⁺中性粒细胞(图5 dWT老鼠相比)。在8周的年龄有一个小F4/80增加⁺支气管旁巨噬细胞(图5 bhORMDL3)在肺部^zp3-CreCD4老鼠,没有变化⁺细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞(图5,5度,5 d)。在26周的年龄有支气管旁CD4的显著增加⁺细胞(图5),F4/80⁺巨噬细胞(图5 b)、嗜酸性粒细胞(图5度)和中性粒细胞(图5 d)hORMDL3^zp3-Cre相比WT老鼠。

Th2细胞因子水平IL-5和IL-13没有增加hORMDL3的矿山或肺^zp3-Cre老鼠在4周的年龄(图5情况hORMDL3),一个时间点^zp3-Cre老鼠表现出显著的气道重塑。BAL IL-13水平(图5 e)和肺IL-13 (图5 f)在hORMDL3显著增加^zp3-Cre老鼠在8和26周的年龄评估ELISA。BAL IL-5水平(图5克)在hORMDL3显著增加^zp3-Cre老鼠在8和26周的年龄,而水平的肺IL-5只有增加8周(图5 h)。相比之下,没有hORMDL3的肺il - 4水平的增加^zp3-Cre老鼠在4、8或26周的年龄(数据未显示)。

的IgE水平在hORMDL3显著增加^zp3-CreWT老鼠在4周的年龄相比,这IgE 8点持续增加和26周(图6)。IgE的增加是有选择性的,没有增加免疫球蛋白(IgG1或IgG2) (图6 b,6摄氏度),IgM (图6 d),或者IgA (图6 e)hORMDL3^zp3-Cre老鼠。

急性卵巢挑战诱导支气管旁增加更大的嗜酸性粒细胞(图7 a e)和OVA-specific IgE (图7 f)hORMDL3^zp3-Cre老鼠相比WT老鼠。这是与肺hORMDL3 il - 4含量增加有关^zp3-Cre老鼠相比WT老鼠(图7 g)。而急性卵巢挑战诱导肺IL-5水平上升(图7我),IL-13 (图7 h)和eotaxin-1 (图7 j)hORMDL3^zp3-Cre老鼠(卵子和没有卵子),这些水平并不不同于中发现OVA-challenged WT老鼠。

hORMDL3^zp3-Cre小鼠自发增加气道反应乙酰甲胆碱相比,在12周的年龄(WT老鼠图8)。此外,hORMDL3^zp3-Cre增加小鼠肺倒电容相比WT老鼠(图8 b)。

虽然多个遗传协会研究表明ORMDL3高度与哮喘(1- - - - - -10),的机制ORMDL3体内可能导致哮喘的发病机制目前仍未可知。在这项研究中使用小鼠模型的人类ORMDL3基因过表达,我们展示了小说发现人类ORMDL3转入基因在体内的表达显著增加气道重构,包括增加气道平滑肌、牙龈纤维化和粘液。这些hORMDL3气道重塑变化^zp3-Cre小鼠的自发发展增加气道反应有关。此外,重塑变化增加肺倒电容(肺合规的倒数),这表明增加刚度的改制的肺。增加气道重塑的机制似乎并未依赖增加气道炎症,显著的气道重塑是hORMDL3明显在4周的年龄^zp3-Cre老鼠,时间点不增加支气管旁嗜酸性粒细胞,中性粒细胞、巨噬细胞、CD4细胞。水平的提高与气道重塑相关的基因的表达检测在肺癌(SERCA2b)和气道上皮(hORMDL3 TGF-β1,ADAM8、MMP-9)^zp3-Cre老鼠,这表明这些通路可能导致气道重塑中发现这些老鼠。这些基因的重要性hORMDL3中高度表达^zp3-Cre小鼠哮喘气道重塑和建议的研究证明这些通路的表达在人类哮喘患者的气道(15,22- - - - - -27),诱导这些介质在哮喘患者吸入过敏原(TGF-β1 MMP-9) (28- - - - - -30.),抑制小鼠哮喘结果缺乏这些基因(ADAM8、Smad3 MMP-9) (31日- - - - - -35),或者在老鼠身上处理中和Abs (TGF-β1)(36)。

我们以前进行体外研究和证明转染ORMDL3诱导激活ER UPR的三个途径之一即ATF6通路(13)。使用hORMDL3^zp3-Cre老鼠小说我们观察的ATF6通路UPR选择性地激活人类ORMDL3转基因体内。ATF6 ATF6α和ATF6β密切相关的(包括哺乳动物)(37)是一个已知的转录因子调控基因参与ER蛋白质折叠(14SERCA2b),以及表达,这已经在哮喘气道重塑中涉及(15)。在这项研究中我们证明hORMDL3^zp3-Cre老鼠展览ATF6激活和肺SERCA2b水平增加,这表明ATF6和SERCA2b通路的下游ORMDL3体内如前所证明体外(13)。之前的体外研究中,我们已经表明转染ORMDL3诱导激活SERCA2b ATF6和表达,而击倒ATF6α抑制SERCA2b表达式(13)。激活ATF6是最大,进一步归纳与thapsigargin UPR在治疗的细胞,一个良好的ER应激诱导物,不增加ATF6的核本地化。总的来说,这些研究hORMDL3^zp3-Cre老鼠体内的证据提供ATF6α-dependent通路(SERCA2b)和ATF6α-independent通路(TGF-β1 ADAM8、MMP-9)通过这个ER-localized ORMDL3可能与气道重塑和哮喘。然而,只有未来的研究ATF6通路的选择性抑制能够确定ATF6通路所扮演的角色在任何我们注意到在hORMDL3重塑变化^zp3-Cre老鼠。

hORMDL3^zp3-Cre老鼠也有与年龄相关的气道炎症水平,增加以及肺细胞因子和趋化因子的增加。气道炎症水平的增加在hORMDL3并不明显^zp3-Cre小鼠年龄4周,才开始在8周明显(支气管旁增加巨噬细胞)。在26周hORMDL3^zp3-Cre小鼠支气管旁CD4水平有了显著提高⁺细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞,表明hORMDL3气道炎症反应^zp3-Cre老鼠从8 - 26周期间增加的年龄。因为在hORMDL3炎性反应^zp3-Cre小鼠CD4 Th2-mediated炎症(增加的证据⁺细胞和嗜酸性粒细胞),以及增加中性粒细胞和巨噬细胞,我们调查是否肺部表达与Th2-mediated炎症相关的细胞因子和趋化因子(il - 4、IL-5 IL-13, eotaxin-1)或趋化因子已知受ORMDL3体外(CXCL10 CXCL11,引发,CCL20) (13)。肺Th2细胞因子水平在hORMDL3 (IL-5和IL-13)增加^zp3-Cre老鼠在8和26周的年龄。相比之下,没有增加肺il - 4或eotaxin-1在任何时间点。Allergen-challenged hORMDL3^zp3-Cre水平有了显著提高小鼠支气管旁肺嗜酸性粒细胞和il - 4相比allergen-challenged WT老鼠。il - 4可以导致肺嗜酸性增加炎症小鼠il - 4的研究Tg明显(38)。我们的研究hORMDL3^zp3-Cre老鼠证实趋化因子(CXCL10 CXCL11),我们观察到的高度表示对ORMDL3-transfected体外细胞(13hORMDL3中高度表达^zp3-Cre小鼠支气管上皮细胞(CXCL10)和肺泡巨噬细胞(CXCL11)。虽然哮喘主要与CC趋化因子的表达有关,科学家趋化因子也与哮喘和哮喘研究人类(39- - - - - -42),以及在研究动物模型(43,44)(即。,CXCL10 knockout mice have significant reduction in Th2-type allergic airway inflammation and airway responsiveness) (43)。

hORMDL3^zp3-Cre老鼠也有增加的IgE水平没有增加免疫球蛋白,IgM或IgA。在hORMDL3 OVA-specific IgE水平显著增加更多^zp3-Cre老鼠的挑战与卵子相比WT老鼠与卵子的挑战。因为il - 4和IL-13 B细胞转向IgE生产(45),我们检查是否细胞因子增加与增加总IgE OVA-specific IgE或增加。在hORMDL3 OVA-specific IgE的增加^zp3-Cre小鼠急性后卵子的挑战是与il - 4水平上升有关。相比之下,增加总IgE hORMDL3中发现^zp3-Cre老鼠之前IL-13的增加。初步研究没有证明了脾脏B细胞数量的差异表达IgE hORMDL3^zp3-Cre相比WT老鼠(数据未显示)。还需要进一步的研究来确定是否增加总IgE和有浓度过敏原特异性IgE hORMDL3生产我们注意到^zp3-Cre老鼠是由于细胞因子(il - 4, IL-13)或T细胞和B细胞由ORMDL3监管的途径。在哮喘的流行病学研究,17号染色体与对方篮里IgE在一些(5,8),但并不是所有的研究(3,7)。研究ORMDL3在波多黎各的哮喘患者具有重要关联单核苷酸多态性(SNP) rs12603332和日志₁₀IgE水平(5),而亚组分析显示重要的snp rs4378650之间的关联和rs12603332过敏性哮喘患者(IgE > 100国际单位/毫升)。这些snp和哮喘之间的关系变得更强的患者IgE水平> 100国际单位/毫升(5)。

总之,这些研究在hORMDL3^zp3-Cre老鼠提供证据表明ORMDL3扮演重要的角色在ATF6 UPR通路的激活体内,并且表达ORMDL3体内调节气道重塑(平滑肌、纤维化、粘液)可能通过SERCA2b等ATF6目标基因和/或通过ATF6-independent基因(TGF-β1 ADAM8、MMP-9)检测在气道上皮细胞,以及通过未知的和/或被知晓途径。在这方面受ORMDL3鞘脂类是已知的,和鞘脂类通路与哮喘有关但不是气道重塑在小鼠模型(46- - - - - -48)。ORMDL3也调节ER-mediated钙信号(49)和淋巴细胞在体外激活(50)。因为ORMDL3表达在多种细胞类型重要的哮喘的发病机制(即。T细胞、上皮细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)(13,51),在这项研究中,我们介绍了如何在多种细胞类型ORMDL3表达的增加有助于哮喘的发病机制。未来的研究ORMDL3选择性超表达在特定的细胞类型将提供洞察ORMDL3的作用在这些单个细胞类型哮喘的发病机制。有趣的是,水平的提高气道重塑之前增加气道炎症(CD4的水平⁺细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)在肺部hORMDL3^zp3-Cre老鼠,这表明气道重构可以从这些通路的激活ORMDL3。气道重构可以发现不仅在成人哮喘,而且在儿童哮喘(52),表达ORMDL3增加儿童哮喘病患者可能导致气道重塑的早期发展。总的来说,这些研究提供初步证据的体内机制连接一个ER-localized蛋白质如ORMDL3气道重塑的发病机理,气道代答,和哮喘。

作者没有利益上的冲突。