文摘
低聚糖对甲型流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(IAV)凝集素的目标识别的先天免疫系统,包括溶性表面活性剂protein-D气道巨噬细胞和巨噬细胞甘露糖受体。聚糖与H1亚型IAV的头明显不同的数量和位置。反向遗传学的方法是用于定义特定的重要性N糖基化网站H1在决定对先天免疫防御和小鼠的毒性。的HA /公关/ 8/34 (PR8, H1N1流感和/巴西/ 11/78 (H1N1)巴西表示0和4个糖基化网站的负责人哈,分别。定点诱变用于添加(PR8)或删除(巴西)糖基化网站,IAV表达野生型和突变体HA生成PR8骨干。添加或删除特定聚糖调制灵敏度老鼠肺部液体,但并不是一个主要因素确定气道感染的巨噬细胞的敏感性。PR8 mouse-adapted病毒,基因突变在多个IAV已被证明导致毒性,但添加糖基化PR8 HA足以减弱疾病。相比之下,取消聚糖从巴西公顷导致严重疾病和死亡。这些研究提供关于IAV的机制可以在小鼠诱发疾病。此外,减少了HA的糖基化可能是一个重要因素与鼠肺适应人类IAV的增长。
聚糖甲型流感病毒的血凝素(HA) (IAV)连接N糖苷联系天冬酰胺(Asn)残留的守恒的糖基化网站主题Asn-X-Ser /用力推,X可能代表任何氨基酸除了脯氨酸(1)。低聚糖与茎地区不同IAV菌株之间非常保守,是重要的在确定适当的折叠和HA的构象(2- - - - - -5)。相比之下,球状的头的位置和数量的聚糖HA IAV菌株之间明显不同(6,7)。
哈中和Abs作为主要的目标,和聚糖表达HA的头可能会屏蔽或修改抗原网站(8),从而防止由Abs引起识别以前流行株。自1977年重新崛起,糖基化网站添加了,失去了从季节性H1N1流感病毒的HA IAV,尽管大多数菌株保持三到五个网站(9,10)。损失或获得的聚糖IAV的也会影响生物性能通过改变HA对宿主细胞受体的亲和力(11,12),调节蛋白水解HA的乳沟0前体(13)或干扰受体结合活动之间的平衡和高效粒子释放(14)。此外,糖基化对HA是重要的在确定的敏感性IAV凝集素特异性免疫系统的识别。
表面活性剂蛋白(SP) - d, calcium-dependent collectin家族(c型)凝集素,结合mannose-rich聚糖在流感病毒HA /神经氨酸酶(NA)糖蛋白调解范围的体外抗病毒活动(15- - - - - -17)。此外,巨噬细胞甘露糖受体(MMR),膜相关c型凝集素,也结合寡糖促进病毒HA / NA被巨噬细胞吸收和破坏(Mϕ)(18,19)。先前的研究已经报道之间的关联程度的HA和糖基化的头:1)易感性中和通过表面活性剂蛋白D (SP-D) (17,20.,21);2)能力结合MMR和感染小鼠Mϕ(18,19);和3)小鼠的毒性不同的IAV (17,20.,22)。mouse-adapted /公关/ 8/34应变(PR8, H1N1)缺乏糖基化对HA (23),是抵抗SP-D (17,24),感染Mϕ可怜的能力(18,19,25)和高毒性对小鼠(22,26)。的突变体/巴西/ 11/78 (H1N1)巴西,抵抗的牛collectin conglutinin,发现所缺乏的N糖基化位点Asn104年(公顷(H1编号)27)和显示适度减少对老鼠SP-D (28)。详细分析特定的糖基化位点的作用在决定对先天免疫防御和毒性尚未报道。
我们研究糖基化的角色头上H1亚型IAV的鼠科动物先天免疫系统的调节敏感组件(SP-D和Mϕ)体外和小鼠的毒性。定点诱变允许顺序删除或添加潜在糖基化网站的哈,和反向遗传学(RG)被用来工程师7:1重组病毒表达野生型(WT)或糖基化突变HA PR8骨干。我们已经删除了的四个潜在的网站从巴西的头哈,以及产生突变体中多个站点被删除。我们还添加了个人N糖基化位点PR8 HA和生成一个突变表达两个网站的负责人哈。提出了研究数据表明,HA糖基化是一个关键因素决定灵敏度SP-D但并不是一个主要因素影响小鼠Mϕ感染的易感性。RG病毒表达减少糖基化被老鼠肺部液体和抵抗中和在老鼠引起严重疾病。使用HA PR8或巴西,我们证明Asn144年是特别重要的在确定对小鼠mannose-specific凝集素在体外和疾病的老鼠。
材料和方法
老鼠和病毒
C57BL / 6 (B6)老鼠繁殖和安置在特定的无菌条件的微生物学和免疫学,墨尔本大学(墨尔本、维克、澳大利亚)。雄性小鼠6 - 8周的年龄被用于实验。流感病毒株/公关/ 8/34西奈山(PR8, H1N1流感和BJ×109 (H3N2)获得世界卫生组织流感参考和研究合作中心,北墨尔本,维克,澳大利亚。病毒是生长在10 d受孕卵和标准程序的滴定空斑实验下Madin-Darby狗肾细胞(MDCK)作为描述(29日)。
糖基化的建设使用RG突变病毒
重组IAV用于本研究由eight-plasmid RG如前所述(30.)。按顺序删除执行定点诱变N与糖基化网站从巴西公顷(H1)或将网站添加到球状PR8公顷(H1)。删除N糖基化的网站是通过用Asn在阿拉巴马州废除糖基化序列图案Asn-X-Ser /刺(即。,Asn104年(NGT→AGT], Asn144年(NIT→AIT), Asn172年(门店→AGS)和Asn177年(NLS→肌萎缩性侧索硬化症))。添加N糖基化网站PR8哈,核酸突变进行促进氨基酸替换,糖基化图案(即创建。Asn-X-Ser /刺),网站相同的巴西公顷(即序列。,Asn104年(进行下一代NGI→NGT], Asn144年[NTNG→NTTRG], Asn172年[EGS→门店),Asn177年[KLK→NLS])。定点诱变进行使用克隆空斑形成单位DNA聚合酶(Stratagene),然后通过孵化消化了父母的模板DpnI(新英格兰生物学实验室)。病毒生成与WT 7:1 PR8骨干组成的重组或糖基化突变HA PR8或者巴西。包含7基因的质粒载体PR8 (HA)用于创建RG-engineered病毒请由罗伯特·韦伯斯特圣裘德儿童研究医院(孟菲斯,TN)。产生的所有病毒HA基因RG测序,以确保适当的突变是保留的,额外的突变没有期间推出的一代的RG病毒。
传染性病毒的滴度测定使用标准的空斑实验(12)或对MDCK细胞免疫荧光。免疫荧光,层的MDCK细胞培养在96 -孔板(Nunc)接种稀释的病毒,孵化1 h公司37°C的5%2、清洗和孵化6 - 8 h。孵化后,细胞被洗,固定为80% (v / v)在水、丙酮和彩色的表达新合成病毒核蛋白(NP)使用马伯MP3.10G2。IC7(世界卫生组织流感参考和研究合作中心,墨尔本,维克,澳大利亚),其次是FITC-conjugated羊anti-mouse搞笑(西勒诺斯)。盘子被认为在×100原始放大,荧光疫源地的总数在重复井是用来计算传染性病毒的效价。
在一些实验中,50%的组织(TCID culture-infective剂量50)确定使用层的MDCK细胞的平底96 -组织培养板(Nunc)。样本滴定和孵化37°C公司5%2对3 d的2μg /毫升胰蛋白酶(TPCK-treated;沃辛顿生化)。层评估使用光学显微镜和病理变化的稀释50%的细胞培养可以检测到被用来计算TCID50效价,TCID表达50每毫升的原始样本。
Desialyation resialyation红细胞
方法红细胞酶改性的低聚糖前面描述的(31日)。总之,悬浮液(10%)的人类红细胞desialylated 600亩/毫升唾液酸酶perfringens梭状芽胞杆菌(Sigma-Aldrich) 1 h在37°C,洗两次,并使用1.5毫米resialylated CMP -N-acetylneuraminic酸(Neu5Ac;Sigma-Aldrich)和4μβ-galactoside-α2,3-sialyltransferase(日本烟草、静、日本)或β-d-galactosyl-β1,4 -N-acetyl-β-d-glucosamine-α2 6-sialyltransferase(默克公司)或单独使用缓冲区(sham-treated) 37°C 4 h。红细胞在TBS清洗和使用标准公顷滴定。
病毒中和试验
小鼠支气管肺泡灌洗(BAL)液体的能力和重组鼠SP-D中和病毒传染性是衡量fluorescent-focus减少层的MDCK细胞培养在96 -孔板作为描述(17)。天真的小鼠安乐死,BAL液体通过冲洗三次肺1毫升TBS通过钝化23-guage针插入气管。落下帷幕的液体被离心澄清,上层清液冻结在−20°C。重组鼠SP-D教授是一个慷慨的礼物Erika克劳奇(病理学和免疫学、华盛顿大学医学院,圣路易斯,密苏里州)。BAL上层清液或SP-D稀释与10毫米CaCl TBS补充2为30分钟,孵化与病毒,并将其添加到MDCK细胞单层膜。IAV-infected细胞的数量确定在7到8 h postinfection使用免疫荧光如上所述。荧光疫源地的总数在四个领域代表的数量清点,表示为一个百分比的焦点在相应区域的重复控制井单独感染病毒(即。病毒控制百分比)。
感染的老鼠Mϕ和上皮细胞
小鼠腹膜渗出物细胞Mϕ或小鼠LA-4肺上皮细胞系是准备和感染病毒eight-well室幻灯片描述(17)。幻灯片是彩色IAV NP如上所述的表情,然后10μg /毫升propidium碘(π;Sigma-Aldrich)可视化原子核的贴壁细胞,因此确定总细胞数。最后,幻灯片被广泛安装在80% v / v甘油,并使用荧光显微镜评估。荧光细胞的百分比确定至少四个随机领域用最少的200个细胞数为每个样本。测试由甘露聚糖抑制感染细胞孵化与甘露聚糖(最终浓度10毫克/毫升)在室温下30分钟之前的病毒。
确定在上层的传染性病毒的效价IAV-infected LA-4上皮细胞,细胞层和10孵化6病毒空斑形成单位每60分钟,洗了三次取消免费的病毒,在37°C和孵化公司5%2。在2到24 h postinfection,上层清液被移除时,由离心澄清,传染性病毒的滴度由TCID决定50对MDCK细胞单层膜。
病毒感染的老鼠
五组小鼠麻醉和感染105空斑形成单位或103PFU IAV通过鼻内的路线在50μl PBS。老鼠体重每天和评估临床疾病的迹象包括静止,折边的皮毛,呼吸困难,蜷缩的行为。动物失去了原来≥25%的体重被安乐死。墨尔本大学的研究符合所有的动物实验伦理指导方针和政策。在不同时期postinfection、小鼠安乐死和肺部,鼻组织,大脑和心脏被移除,在PBS均质,通过离心澄清。传染性病毒的滴度在组织匀浆测定标准空斑实验或对MDCK细胞免疫荧光。
复苏和描述来自小鼠的白细胞
BAL细胞和肝素化血液得到老鼠所描述(32)。Thymi压到70年——μm塑料网3-ml塑料注射器的柱塞产生单细胞悬浮体。样本Tris-NH对待4Cl NH(0.14米4Cl 17毫米三,调整pH值7.2)溶解红细胞和洗RPMI 1640中补充FCS为10%。细胞数量和细胞生存能力测定通过台盼蓝排斥。
流仪分析、单细胞悬浮体准备从血液,落下帷幕,在冰上和thymi孵化20分钟的上层清液从2.4杂种细胞g2阻止Fc受体,紧随其后的是染色FITC的适当组合,PE、和allophycocyanin共轭Gr-1 (RB6-8C5) CD45.2 (104), CD8a (53 - 6.7), CD4 (GK1.5) B220 (RA3-6B2) TCRβ(h57 - 597),和NK1.1 (PK136)。添加10μg /毫升π到每个样本被用来确定可行的细胞。细胞进行了分析使用一个FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)和至少50000π−细胞被收集。气道Mϕcytospin后被确定和微分染色BAL细胞。
肺组织病理学
肺灌注、膨胀和固定在4%甲醛溶液(如前所述)(33之前4-μm部分是准备和沾染了)。气道炎症H&E-stained肺癌部分是评价主观范围0 - 5(0,没有炎症;1、非常温和;2、温和;3、中等;4、标志;5、严重的炎症)由三个独立的读者,为描述(33)。部分失明和随机的,样本对应的最严重和最严重的炎症被分配分数为0,5,分别。所有样本然后分级peribronchiolar炎症(约三到五个小航空公司/部分)和牙槽炎在多个随机领域每部分由三个独立的读者描述(34)。肺部分被认为在徕卡显微镜DMI3000 B(徕卡微系统)和拍摄100×原始放大,除非另有说明使用徕卡DFC徕卡490相机运行应用软件(徕卡微系统)。
细胞因子珠阵列炎症介质的检测
的水平IFN-γTNF-α,il - 6、il - 10、il - 12。p70年,和MCP-1 in BAL supernatants and serum were determined with the use of a BD Cytometric Bead Array mouse inflammation kit (BD Biosciences) according to manufacturer’s instructions. The detection limit was 5 pg/ml for all cytokines tested.
评估肺部水肿和血管泄漏
肺wet-to-dry重量比作为一个索引的肺部液体积聚在流感病毒感染。肺手术解剖,立即涂抹干燥,称重(湿重)。注意,肺中使用这些研究没有分析之前落下帷幕。肺组织干在烤箱60°C 72 h和reweighed(干重)。weight-to-dry的比率计算为每个动物评估组织水肿如前所述35,36)。BAL上层清液中蛋白质的浓度无细胞测量通过添加布拉德福德蛋白染料。标准曲线用BSA构造和OD决定在595海里。
统计分析
比较两组的值,一个学生t使用测试(双尾,两个示例等于方差)。比较三个或更多套值时,数据分析了单向方差分析(非参数)其次是事后分析使用图基的多重比较检验。组织病理学的分析数据,克鲁斯卡尔-沃利斯检验(非参数)其次是邓恩的期末测验。生存比例比较使用Mantel-Cox生存率较。一个p值≤0.05被认为是具有统计学意义。
结果
流感病毒的HA蛋白起着至关重要的作用在决定对天生的敏感宿主防御BAL流体和小鼠的毒性
巴西HA有四个潜在的网站N与糖基化的头,而PR8缺乏糖基化对HA (图1一个)。两种病毒表达类似数量的潜力N糖基化网站哈茎。确定的角色哈毒性H1 IAV的老鼠,RG用于插入HA巴西PR8 seven-gene骨干,从而生成RG-Brazil-HA 7:1病毒。
我们首先比较巴西和PR8的敏感性,以及RG-Brazil-HA,通过鼠标BAL中和液(图1B)。病毒潜伏在稀释的鼠标BAL(10毫克/毫升甘露聚糖的存在与否)和传染性病毒的数量取决于免疫荧光(18,22)。鼠标的强有力的中和活动落下帷幕对巴西逆转的甘露聚糖(图1B),这表明SP-D(或相关mannose-specific凝集素)是主要在肺液中和活动(22)。PR8落下帷幕,在很大程度上是对鼠标而RG-Brazil-HA中和等效水平到巴西。因此,巴西的表达HA与增强灵敏度来中和鼠标落下帷幕。
我们接下来研究了HA的角色在决定感染小鼠MϕIAV的能力(图1C我)。与先前的报道一致(18,22,25,26),感染MϕPR8很穷的能力。相比之下,巴西和RG-Brazil HA∼60%的Mϕ感染和感染是由甘露聚糖抑制,MMR的配体。PR8、巴西或RG-Brazil哈没有差别的能力感染小鼠肺上皮细胞系(LA-4)和感染LA-4细胞不受甘露聚糖(图1C二世)。
接下来,老鼠感染105空斑形成单位的巴西、PR8或RG-Brazil-HA和监控日常减肥和疾病。小鼠感染巴西或RG-Brazil-HA不减肥(图1D)或显示可见疾病的迹象(数据未显示)在10 d监测期间,而PR8-infected老鼠迅速减肥,和所有的动物死于疾病。因此,巴西的表达HA导致中和敏感性增加了鼠标BAL和增强Mϕ感染的易感性。巴西在老鼠身上,表达HA的毒性明显衰减。
代的RG和不同数量的流感病毒N糖基化网站哈
表达不同的H1 HA是至关重要的在确定敏感lectin-mediated先天防御和小鼠的毒性(图1)。接下来,一个策略设计顺序删除(巴西)或添加(PR8)N糖基化位点的球状的头哈,RG IAV生成PR8骨干。RG病毒表达WT巴西或PR8公顷被生成的控件。对巴西哈,我们生成的单步突变体(172−−−104年,144年,和−177),双突变体(−−172/177 104/144),和一个突变体缺乏所有四个糖基化网站(−104/144/172/177)。PR8哈,我们生成的单步(+ 104,+ 144,+ 172,+ 177)突变体和双突变体(+ 104/144)。尽管多次尝试,传染性病毒无法救出+ 104/144/172/177变异,表明添加糖基化干扰PR8公顷的功能和/或稳定。此外,特定的糖基化的组合网站不能被添加到PR8哈,和拯救病毒回归哈共识(如双+ 172/177)。
糖基化的头哈调节毒性IAV的老鼠
检查去除的效果(巴西)或(PR8)N糖基化网站的负责人哈,老鼠感染105空斑形成单位(图2一个)或103空斑形成单位(图2B)RG病毒表达WT公顷或表达突变HA与糖基化改变。感染小鼠105空斑形成单位RG-Brazil-HA (WT)与体重无关(图2一个我),和类似的结果使用单步糖基化突变体缺乏Asn104年(104−)或Asn172年(172−)。糖基化突变体缺乏Asn144年单(144−)或结合Asn104年(−104/144)4 d postinfection迅速减肥,并被实施安乐死。单步突变体缺乏Asn177年(177−)诱导温和,但意义重大,减肥,和所有的老鼠从感染中恢复过来,而突变体缺乏Asn172年和Asn177年(−172/177)是致命的,所有的动物都被处以安乐死。小鼠感染了糖基化变异缺乏这四个网站的负责人哈(−104/144/172/177)4 d postinfection死于疾病。
小鼠感染105PFU RG病毒表达RG-PR8-HA (WT)快速减肥和死于疾病图2一个二世)。单站点N糖基化在Asn104年,Asn144年,Asn172年,或Asn177年(+ 104,+ 144,+ 172,+ 177突变体,分别)或添加Asn104年和Asn144年(+ 104/144)并没有减少毒性,所有老鼠安乐死4到5 d postinfection。
我们下一个接种小鼠低剂量的100倍(即。,103空斑形成单位)的RG病毒强调更微妙的区别病毒引起疾病的能力。巴西−144公顷突变引起的疾病和死亡小鼠接种105空斑形成单位(图2人工智能),但并没有引起疾病低剂量(图2Bi),而104/144和−−104/144/172/177保留毒性。添加单一网站PR8 HA(即。,+104,+144,+172 or +177 mutants) did not alter weight loss or mortality, whereas the +104/144 virus was attenuated, and all animals survived infection (图2Bii)。因此,删除从巴西糖基化HA与增强的毒性,而添加糖基化PR8 HA减毒病。
突变病毒受体特异性的糖基化
我们比较RG病毒在一系列化验调查因素影响小鼠的毒性。糖基化网站的增加或损失可以改变绑定的HAα(2、3)加-或α(2,6)-Gal-linked唾液酸(SA) (12,37,38)。我们首先比较RG病毒能力粘合红细胞从不同物种,和RG病毒轴承巴西哈没有在人类粘合能力差异,鸡肉、火鸡、天竺鼠、马红细胞(数据没有显示)。此外,当人类红细胞desialylated和resialylated, RG病毒表达巴西哈没有粘合能力不同红细胞轴承α(2、3)加-或α(2,6)-Gal-linked Neu5Ac (表我)。添加糖基化PR8 HA对人类并没有改变绑定,鸡肉、火鸡、或豚鼠红细胞(数据没有显示)。然而,与WT相比,+ 144,+ 104/144突变体在低效率的凝集红细胞轴承α(2、3)-Gal-linked Neu5Ac (表我),表明PR8公顷的受体结合特性的差异。
在HA糖基化能力的病毒不同感染小鼠Mϕ和上皮细胞
IAV感染呼吸道上皮细胞导致生产病毒复制(26,39,40),而流感病毒感染Mϕ流产,和传染性病毒粒子释放(18,26,41)。因此,糖基化突变体感染不同细胞类型的能力可能是一个重要的因素影响毒性。层的小鼠Mϕ或LA-4上皮细胞感染增加剂量的RG病毒和免疫荧光被用来确定感染细胞的百分比。病毒轴承适当WT公顷相比,糖基化突变体轴承的HA巴西(图3一个,上面板)或PR8 (图3一个,较低的面板)没有差别在感染上皮细胞的能力。在小鼠模型中,Mϕ扮演至关重要的角色限制疾病严重程度26,42),MMR在内的受体IAV感染小鼠Mϕ(18,19)。尽管如此,我们没有观察到病毒主要区别轴承WT或糖基化突变的能力哈感染Mϕ(图3B)。应该指出的是,+ 104/144 PR8 HA变异,然而,在能力与适度增加感染Mϕ相比,其相应的WT病毒。RG病毒轴承WT巴西HA和巴西HA−104/144/172/177突变的能力也同样有效感染小鼠Mϕ,Mϕ通过病毒和感染是减少到< 15%的10毫克/毫升甘露聚糖(数据没有显示)。
糖基化的敏感突变体通过鼠标BAL或鼠SP-D中和
肺表面活性物质含有蛋白质的先天免疫系统和充当障碍流感病毒感染的航空公司。SP-D, collectin mannose-specific凝集素的家庭,代表鼠标的主要中和活动落下帷幕对糖化流感病毒(图1)(22)。因此,我们决定如果添加或删除糖基化网站HA对灵敏度影响老鼠SP-D鼠标BAL或重组。RG病毒轴承WT巴西公顷被老鼠BAL敏感中和(图4一个,左面板)或鼠SP-D (图4B,左面板)。删除Asn104年或Asn172年不改变灵敏度中和平衡或SP-D和病毒没有诱导疾病(图2一个)。糖基化在Asn144年和Asn177年然而,重要的在确定敏感性鼠标BAL和SP-D和单步突变体缺乏这些网站显示增强小鼠的毒性(图2一个,左面板)。RG和−−104/144 104/144/172/172巴西HA突变体在很大程度上对中和SP-D或落下帷幕。注意鼠标BAL的中和活动(图4一个,右面板)和老鼠SP-D (图4B,右面板)RG病毒轴承WT巴西HA在甘露聚糖的存在逆转,而等量的BAL / SP-D没有中和−104/144/172/172巴西公顷。落下帷幕的中和活动/ SP-D 104−−144−172−177巴西HA突变体也逆转的甘露聚糖(数据没有显示)。
添加一个糖基化位点在Asn144年PR8公顷(+ 144)中和敏感性增加了鼠标拜尔(图4C,左面板)和SP-D (图4D,右面板),但是这种病毒没有不同于WT毒性(图2)。顺序添加糖基化网站(+ 104/144)导致进一步增加鼠标BAL和SP-D敏感性,以及衰减的毒性。中和落下帷幕(+ 104/144突变的老鼠图4C,右面板)和SP-D (图4D,右面板)被推翻在甘露聚糖的存在。总的来说,这些结果表明逆相关性敏感性在老鼠老鼠BAL和疾病严重程度。对于巴西和PR8,糖基化在Asn144年,并在较小程度上Asn177年是敏感性的重要决定因素,鼠标BAL和疾病严重程度。
复制RG糖基化突变病毒在体外和体内
接下来,我们研究了参数与疾病严重程度与RG病毒感染小鼠后表达:1)WT巴西哈(RG-Brazil WT)或RG-Brazil哈104/144/172/177 (“RG-Brazil−4”);或2)WT PR8公顷(“RG-PR8 WT”)或RG-PR8公顷+ 104/144 (“RG-PR8 + 2”)。分析6 postinfection在天,小鼠感染的时间RG-Brazil−4和RG-PR8 WT病毒死于疾病。
首先,老鼠感染103每个病毒空斑形成单位,传染性病毒的滴度上(鼻组织)和低(肺)呼吸道测定(图5一个)。传染性病毒中没有检测到肺(图5一个我)和鼻组织出现在低浓度(图5一个二世)的小鼠接种RG-Brazil WT,而被检测出含有高滴度的航空RG-Brazil−4-infected老鼠(和∼∼2600倍高20倍浓度在肺部和鼻腔组织,分别)。病毒滴度在肺部和鼻腔组织的老鼠感染RG-PR8 + 2低于从小鼠感染RG-PR8 WT(∼30倍减少肺部和鼻腔组织)。
鉴于显著区别在RG病毒在体内复制,我们比较他们在老鼠LA-4细胞复制的能力来决定如果有本质区别病毒在呼吸道上皮细胞复制的能力。在这些实验中,LA-4细胞感染106PFU RG-Brazil WT, RG-Brazil−4, RG-PR8 WT,或RG-PR8 + 2病毒,和上层的删除2和24小时postinfection被TCID传染性病毒化验50。滴度的病毒相似的2和24小时RG-Brazil WT与RG-Brazil−4和RG-PR8 WT与RG-PR8 + 2(数据未显示)。这些数据表明,不同病毒的复制能力的航空公司老鼠很可能由于对宿主防御的易感性的差异,而不是缺陷的能力在目标细胞感染和复制。
感染后肺组织病理学与RG糖基化突变的老鼠
我们检查肺部分小鼠感染103PFU RG-Brazil WT, RG-Brazil−4, RG-PR8 WT,或在一天6 postinfection RG-PR8 + 2病毒。从天真的动物包括肺部分比较。肺部分失明和得分了peribronchiolar炎症和牙槽炎由三个独立的读者(图5B)。peribronchiolar炎症和牙槽炎在小鼠的肺部感染更严重RG-Brazil−4与动物感染RG-Brazil WT,和肺分数从RG-Brazil−4-infected老鼠相当于来自小鼠感染RG-PR8 WT (图5C)。肺部病理没有明显不同RG-PR8 WT RG-PR8 + 2在两个独立的实验。
多孔性的炎症介质和生产航空的老鼠感染RG-Brazil−4和RG-PR8 + 2
细胞的总数BAL决心6 d postinfection 103PFU RG-Brazil WT, RG-Brazil−4, RG-PR8 WT,或RG-PR8 + 2病毒。低细胞数量从老鼠的呼吸道感染RG-Brazil WT (图6一个)。同等剂量的感染的老鼠RG-Brazil 4导致大量的白细胞,招聘数量和细胞从老鼠∼3.5倍高于感染RG-Brazil WT。感染RG-PR8 WT或RG-Brazil−4导致类似BAL细胞数量。BAL细胞从老鼠感染RG-PR8 + 2减少∼2倍相比,小鼠感染RG-PR8 WT。
详细检查细胞渗透,平衡细胞的流式细胞术分析了天6 postinfection和数字的中性粒细胞,NK细胞、T细胞、CD8+T细胞和B细胞决定(图6B)。数量的气道Mϕcytospin测定和微分平衡细胞的染色。中性粒细胞被感染后的主要细胞类型RG-Brazil−4, RG-PR8 WT,或RG-PR8 + 2,而一些中性粒细胞恢复小鼠感染RG-Brazil WT。感染RG-Brazil−4与中性粒细胞增加,T细胞、B细胞、气道Mϕ相比RG-Brazil WT。相比之下,RG-PR8 + 2招募中性粒细胞减少,T细胞、B细胞与RG-PR8 WT。
相比,小鼠感染RG-Brazil WT,肺部炎症RG-Brazil−4-infected动物与增强BAL il - 6 (图6C;p< 0.05,单向方差分析),但不是MCP-1 TNF-α,或IFN-γ。IFN-γ显示水平倾向于加强从RG-Brazil−4-infected老鼠;然而,这不是明显的两个独立的实验。感染小鼠RG-PR8 WT导致落下帷幕的TNF-α水平,IFN-γMCP-1, il - 6,从小鼠感染明显高于RG-PR8 + 2 (p< 0.05,单向方差分析)。
血管渗漏、肺水肿和系统性的老鼠与RG病毒感染后的反应
严重的流感感染与血管渗漏和肺水肿(26,33)以及系统性表现,包括白血球减少症和胸腺萎缩(43- - - - - -46)。相比,小鼠感染RG-Brazil WT,高水平的总平衡蛋白质从RG-Brazil−4-infected老鼠(图7一个)和增强肺湿/干比观察(图7B)。RG-PR8 + 2-infected老鼠血管渗漏和肺部水肿而减少小鼠感染RG-PR8 WT。我们也记录在血白细胞总数减少小鼠感染RG-Brazil−4或RG-PR8 WT与天真的动物(图7C),这是与减少B细胞、CD8+T细胞和CD4细胞+T细胞。感染RG-PR8 + 2导致中性粒细胞和B细胞数量的增加,而CD8+T细胞和CD4+T细胞是未受影响。没有差异,指出在细胞之间的数老鼠感染RG-Brazil WT和天真的动物。最后,多孔性感染小白鼠的thymi RG-Brazil−4或RG-PR8 WT病毒相比,减少小鼠感染RG-Brazil WT RG-PR8 + 2病毒,分别(数据没有显示)。在每种情况下,流量仪分析表明一个特定的减少double-positive胸腺细胞和阳性CD4 (SP)+CD8−胸腺细胞(图7D),而CD4的数量−CD8+SP和CD4−CD8−双重否定胸腺细胞没有差别。
讨论
H1序列(1918 - 2010)的分析表明,糖基化的受体结合域HA是缺席1918年和2009年大流行的病毒株,但出现在几乎所有的季节性IAV (47),符合角色的糖基化调解逃税Ab-mediated中和人类人口。积累聚糖附近的抗原网站哈可能提供屏蔽的进化优势在人群免疫抗原网站(7,48,49);然而,这些有利影响平衡的增强识别糖化collectins IAV的先天免疫系统(17,20.,50)。糖化IAV由collectins中和高度敏感,显示显著衰减老鼠(17,20.,51)。在这项研究中,我们使用IAV感染的小鼠模型系统地定义了特定的糖基化网站季节性H1 IAV的扮演的角色在调制灵敏度先天免疫防御和毒性。
红细胞凝集抑制研究使用不同的H1N1 IAV鹿角et al。(50)建议Asn144年和Asn172年是对人类SP-D灵敏度的重要因素。使用RG病毒,我们确认Asn144年是一个重要的决定因素的敏感性落下帷幕,鼠标的丰富来源SP-D (22),以及小鼠的毒性。删除Asn144年从巴西HA减少对鼠标BAL和小鼠的毒性增加。此外,同时添加或删除的Asn104年和Asn144年从PR8或巴西哈,分别对鼠标BAL导致显著的变化敏感,毒性与损失相比单独的站点。这些发现表明,同时绑定SP-D IAV公顷多聚糖是可能增加的整体关联绑定,因此抗病毒活性。单删除Asn177年,但不是Asn172年、鼠标灵敏度降低BAL / SP-D和增加小鼠的毒性,这一发现可能反映了配体特异性差异人类和小鼠SP-D (52)。的兴趣,不同的低聚糖collectins也显示不同的特异性表达IAV。巴西(H1N1)的突变体选择抗conglutinin,牛collectin,缺乏Asn104年从哈(27SP-D(),但仍有些敏感28)。在我们的研究中,RG-Brazil 104−耐conglutinin(数据未显示);然而,它对老鼠BAL和纯化SP-D是类似于病毒表达WT公顷。因此,Asn104年代表一个重要的配体对H1 IAV conglutinin,但不代表被啮齿动物SP-D多糖的主要物种。
许多研究报道之间的关联损失潜在糖基化网站HA和适应人类IAV增长的老鼠。志诚et al。(53)报道,消除糖基化网站的Asn71年和Asn104年改编后的新喀里多尼亚/ 20/99 (H1N1)小鼠肺的增长。此外,顺序通过苏联/ 90/77 (H1N1)在小鼠肺导致损失的Asn104年和Asn144年,这样只有Asn172年和Asn177年哈,保持头部和合成病毒复制小鼠肺高滴度(54,55)。然而,希洛夫et al。(54)报道,Asn144年独自一人与小鼠血清抗抑制剂,这对老鼠突变是致病性变异缺乏Asn104年和Asn144年。在小鼠适应人类IAV的增长,研究表明,突变的额外基因,包括PB2 PB1-F2, PA, M, NS1 (56- - - - - -60),可以提高病毒的复制和毒性。此外,HA的突变,影响受体结合或劈理也被卷入适应人类IAV的老鼠(53,61年,62年)。强度的RG研究在于基因病毒定义来确定具体的使用HA的变化对毒性的影响,消除并发症中引入额外的基因突变小鼠适应增长。使用这种方法,我们定义了特定的糖基化网站的重要性在H1公顷调制灵敏度鼠标BAL(以及纯化SP-D)和毒性。
IAV应变PR8 mouse-adapted毒株引起的间质性肺炎类似于看到的人类病毒性肺炎病例(63年,64年)。PR8由> 300年适应小鼠连续的段落在小鼠肺(65年),并有可能获得突变与病毒复制小鼠组织中增加有关先天的和/或逃避宿主防御。RG和八个每个PR8基因的质粒表达,我们证明的两个潜在糖基化网站(Asn104年/ Asn144年)PR8 HA足以减轻其他突变引入PR8基因组鼠肺适应的结果。RG-PR8 + 2是充分减毒老鼠,它不再是致命的,尽管质量RG-PR8体外复制类似的水平。
RG-Brazil−4和RG-PR8 WT诱导小鼠的严重疾病和死亡,尽管病毒滴度的肺RG-Brazil−4-infected老鼠∼100倍低于小鼠感染RG-PR8 WT。尽管阻力中和蛋白BAL可能是H1 IAV毒性的主要因素,其他内在特性的HA有助于增强PR8复制的航空公司。巴西受体特异性差异(特异性α(2、3)加和α(2,6)-Gal-linked SA)和PR8(特异性α(2、3)-Gal-linked SA)可能是重要的,作为α(2、3)-Gal-SA鼠标肺(表达的主要联系66年,67年)。此外,研究已经证明,在鼠肺适应人类流感病毒的增长与一个开关有利于受体特异性结合小鼠呼吸道细胞(61年,62年)。
提出了研究结果表明潜在糖基化网站Asn144年和Asn177年H1是重要的决定因素调节灵敏度SP-D和小鼠的毒性。这些发现表明,Asn144年和Asn177年携带聚糖容易受SP-D(例如,高mannose-type聚糖),而其他网站的负责人哈(Asn104年和Asn172年)携带聚糖不容易访问和/或承担终端聚糖绑定SP-D有效较少(如复杂聚糖终止在半乳糖)。我们不能确定的分子质量变化HA的单步突变体相对于WT公顷用免疫印迹,HA (nonreducing)和哈1(减少)出现弥漫性乐队,可能由于microheterogeniety聚糖egg-grown病毒的HA(数据没有显示)。虽然我们的数据表明,突变引入改变糖基化,有可能改变底层单独序列的蛋白质(即。,在缺乏多糖附件)可能会影响对鼠标BAL和毒性。然而,中和鼠标BAL和纯化啮齿动物SP-D逆转甘露聚糖的存在,证明mannose-specific凝集素是鼠标的主要中和活动落下帷幕。生化分析的HA /苏联/ 90/77,一种H1N1病毒与一个相同的HA与巴西(糖基化模式68年),展示了复杂的混合物,high-mannose和混合型聚糖(69年的本质),尽管聚糖表示在每一个糖基化网站并不确定。需要进一步的实验来确认多糖的存在以及特定的寡糖的性质表达了Asn104年,Asn144年,Asn172年,Asn177年巴西和PR8公顷。
是糖基化的HA能够抑制识别由Abs (48,70年)。在最近的研究中,Asn142年和Asn177年H1N1大流行性流感HA三与降低敏感度中和WT流行公顷的Abs (47),这表明多糖屏蔽可能是一个重要机制,大流行性病毒进入人类进化成季节性流感病毒株。然而,分析H1N1大流行性流感HA序列提交国家生物技术信息中心显示的潜在糖基化网站Asn179年(例如,/基多/ WR1589N / 2009 /塔林/ INS374/2010,加入数字ADM14775 ADM31858,分别)和Asn136年(例如,/荷兰/ 1493 b / 2009 /雅典/ INS257/2009,加入数字ADJ40554 ADK33831,分别)在某些H1N1大流行性流感病毒株,这是不同的网站记录在季节性H1N1 IAV的球状的头。它将定义的角色主要感兴趣的小说聚糖添加到H1N1大流行性流感在HA HA对掩蔽抗原决定以及调制灵敏度collectins先天免疫系统。
流感病毒感染小鼠Mϕ需要绑定的HA细胞表面SA以及MMR之间的相互作用和聚糖表达HA / NA糖蛋白(18,19)。我们以前证明受体特异性的HA是重要的在确定能够感染小鼠Mϕ因为这些细胞表达高水平的α(2,6)-Gal-linked SA (71年)。此外,resialylated Mϕ表达α(2、3)-Gal-linked SA被PR8宽容MMR-mediated感染,病毒缺乏聚糖头上的HA但对α受体偏好-Gal-linked SA (2、3)。在这项研究中,RG-Brazil WT和RG-Brazil−4-infected本机Mϕ类似的水平(图3B),感染抑制的甘露聚糖(数据没有显示)。两种病毒偏爱α(2,6)-Gal-linked SA (表我),主要的SA Mϕ表达的链接(71年),进一步突出显示匹配的重要性HA特异性和表达的特定SA联系Mϕ表面。的增强毒性RG-Brazil−4没有能力与降低感染Mϕ,而是与灵敏度降低可溶性mannose-specific凝集素在小鼠肺部液体。在一起,我们的数据突出特定网站的重要性N-linked糖基化在H1 HA在决定SP-D敏感性,因此小鼠的毒性。
披露的信息
作者没有利益上的冲突。
确认
我们感谢罗伯特·韦伯斯特圣裘德儿童研究医院,孟菲斯,TN,提供质粒向量用于创建逆向工程病毒在这项研究中。
脚注
这项工作是支持的项目拨款509230澳大利亚国家健康与医学研究委员会。pcr是一种国家卫生和医学研究理事会r•赖特研究员。墨尔本世界卫生组织流感参考和研究合作中心由澳大利亚政府部门支持健康和老龄化。
本文中使用的缩写:
- Asn
- 天冬酰胺
- 落下帷幕
- 支气管肺泡灌洗
- 巴西
- 一个/巴西/ 11/78
- 哈
- 血凝素
- IAV
- 甲型流感病毒
- Mϕ
- 巨噬细胞
- MDCK
- Madin-Darby犬肾
- MMR
- 巨噬细胞甘露糖受体
- NA
- 神经氨酸酶
- Neu5Ac
- N-acetylneuraminic酸
- NP
- 核蛋白质
- π
- propidium碘化
- PR8
- 一个/公关/ 8/34
- RG
- 反向遗传学
- SA
- 唾液酸
- SP
- 单纯的好
- SP-D
- 表面活性剂protein-D
- TCID50
- 50%的组织culture-infective剂量
- WT
- 野生型。
- 收到了2011年1月28日。
- 接受2011年6月13日。
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