文摘gydF4y2Ba
在解决炎症反应,招募中性粒细胞粒细胞吞噬细胞凋亡,并被组织在感应没有引发的继发性坏死促炎细胞因子的生产和释放。促进生理中性粒细胞间隙机制可能代表一个可行的治疗策略治疗炎症或自身免疫性疾病中,切除的凋亡细胞受损。的机制增强巨噬细胞的凋亡细胞的吞噬能力强大的抗炎药糖皮质激素的家庭仍然难以捉摸。在这项研究中,我们报告说,人类monocyte-derived巨噬细胞培养的地塞米松展览membrane-intact的吞噬能力,增强早期凋亡细胞只有在血清的存在因素。我们的结果消除一些潜在的调理素的作用,包括补充、pentraxin-3,纤连蛋白。使用离子交换和凝胶过滤色谱法,我们发现了一个高血清分子质量分数包含C4-binding蛋白质和蛋白S负责增加凋亡中性粒细胞的吞噬作用。由于凋亡中性粒细胞专门用于本研究结合蛋白S,我们建议糖皮质激素治疗巨噬细胞诱导切换到蛋白质S-dependent凋亡细胞识别机制。符合这个建议,预处理的巨噬细胞与Abs Mer酪氨酸激酶,Tyro3成员/妳/ Mer受体酪氨酸激酶家族,预防糖皮质激素增加吞噬作用。诱导蛋白S / Mer酪氨酸kinase-dependent凋亡细胞间隙通路可能导致糖皮质激素的抗炎作用,代表一个潜在的目标,促进解决炎症反应。gydF4y2Ba
成功恢复其原始状态的组织炎症侮辱后需要大量的,嗜中性粒细胞被清除的发炎。在这项决议阶段的炎症,招募中性粒细胞凋亡,并随后被吞噬作用(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),一个快速和有效的过程,不刺激炎性巨噬细胞反应(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。相反,效率低下或有缺陷的清除membrane-intact凋亡中性粒细胞释放可能导致histotoxic细胞内的内容由于继发性坏死,可能导致局部组织损伤和炎症性疾病的发病机理(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。一个有吸引力的方法治疗炎性疾病会因此操作流程参与生理间隙的中性粒细胞炎症。尽管促进中性粒细胞凋亡是可能实现的药物(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba体内),在某些情况下这将是重要的,以确保组织中的凋亡细胞间隙的能力相匹配,以避免潜在的有害后果的存在nonphagocytosed凋亡细胞(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们以前报道,糖皮质激素的抗炎药家族(甲基强的松龙、氢化可的松或地塞米松(Dex))gydF4y2Ba3gydF4y2Ba具体检测不到发炎增强迹象由人类和小鼠巨噬细胞吞噬凋亡细胞(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。糖皮质激素,调节超过100个基因的表达,包括那些与凋亡细胞的吞噬作用有关,如CD163 FPR1, Mer受体酪氨酸激酶(Mertk)和MFG-E8 C1q血清蛋白(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。此外,我们表明,人类单核细胞分化5天的糖皮质激素具有更均匀的表型和分子的磷酸化参与信号转导和细胞骨架重排(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。然而,精确的机制(s)糖皮质激素的增加凋亡细胞的吞噬作用仍然难以捉摸。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们调查了机制增强人类monocyte-derived巨噬细胞吞噬能力(MDMφ)早期membrane-intact人类暴露于糖皮质激素后中性粒细胞凋亡。凋亡中性粒细胞表面显示一个不同的分子表型衰减的重要功能反应(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)和额外的表面变化,目标为去除死细胞吞噬细胞(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。许多存在于血清可溶性因素,包括补充C1q C3b,备解素,collectins,长pentraxin-3 MFG-E8 galectin-3,αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白,已报告绑定到人类细胞凋亡(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),因此调节他们的识别和吸收通过许多不同的巨噬细胞表面受体,包括清道夫受体,补体受体,受体磷脂酰丝氨酸,Mertk (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。然而,重要的是要注意,这些调理素作用的事件发生在凋亡过程中相对较晚,伴随膜完整性(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们表明,糖皮质激素增加MDMφ吞噬作用与一个开关从serum-independent serum-dependent凋亡细胞识别机制,可以完成与纯化蛋白,75 kda维生素K-dependent抗凝因子存在于等离子体在相对高浓度的∼25μg /毫升(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba成员),包括巨噬细胞Mertk Tyro3 /妳/ Mer的免疫调节受体酪氨酸激酶(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。我们的数据表明,糖皮质激素批判性调节开关在凋亡细胞间隙机制使用的巨噬细胞,有可能导致他们强大的抗炎作用,因此代表目标促进炎症的决议。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
血清血清蛋白质,和其他试剂gydF4y2Ba
所有化学品都从Sigma-Aldrich购买,除非另有说明。培养基(IMDM)缓冲区(哈佛商学院和PBS没有二价阳离子),和trypsin-EDTA PAA实验室。Percoll来自通用电气医疗集团。右旋糖酐T500 Pharmacosmos。敏捷获得从工具论。Roscovitine来自默克。获得的血清,从凝固全血,心脏穿刺从野生型膜联蛋白I-deficient (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和C1q-deficient (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)在C57BL / 6小鼠的背景。从默克C1q-depleted人类血清得到。一种可溶性重组人类补体受体1用于抑制血清中C3激活(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。一剂250μg /毫升完全块补充活动,由溶血性试验评估。从人类血清/血浆蛋白质纯化得到下列来源:蛋白S(酶研究实验室),C1q(默克公司)和αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白(Sigma-Aldrich)。gydF4y2Ba
抗体gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba从DakoCytomation山羊anti-mouse Igs (1:50)。PE-conjugated anti-CD16马伯(克隆3 g8, IgG1)获得BD生物科学。从Sigma-Aldrich Agarose-coupled山羊anti-rabbit搞笑了。gydF4y2Ba
细胞隔离gydF4y2Ba
单核和多形核白细胞分离出新鲜,柠檬酸盐人类血液的右旋糖酐沉降和离心不连续Percoll梯度(最终浓度55、70和81% Percoll),(如前所述)(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。单核细胞从55/70%接口,吸气和中性粒细胞70/81%接口。recalcification自体血清制备的富含血小板血浆(最终CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba浓度:22毫米),(如前所述)(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
人类MDMφ的离体培养gydF4y2Ba
单核细胞在4×10 resuspendedgydF4y2Ba6gydF4y2Ba/毫升IMDM和坚持48-well组织培养板1 h公司37°C的5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。与IMDM不依从淋巴细胞都被清洗,附着单核细胞培养5天在IMDM含有10%自体血清±1μM敏捷。这些细胞CD14 > 90%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在5天的巨噬细胞功能和表型特征(Dex-MDMφ)(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
离体培养诱导细胞凋亡的中性粒细胞gydF4y2Ba
中性粒细胞在4×10培养gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/毫升IMDM缺乏血清或10%自体血清的存在37°C公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba20 - 24 h,大气在此期间细胞进行了细胞凋亡的比例(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。细胞凋亡和继发性坏死是由膜联蛋白V-FITC绑定(罗氏应用科学)和propidium碘染色(Sigma-Aldrich),分别。另外,中性粒细胞在IMDM resuspended 2×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba/毫升,用荧光标记细胞追踪染料5-chloromethylfluorescein二乙酸(CMFDA;表达载体),2μg /毫升为15分钟37°C公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。中性粒细胞的20 - 24 h,然后清洗和培养如上所述。gydF4y2Ba
凋亡细胞的吞噬作用分析gydF4y2Ba
凋亡细胞的吞噬作用是评估本质上描述(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),使用方法,仔细的特点,显示区分绑定和内化凋亡细胞,比较顺利地和显微镜分析。CMFDA-labeled凋亡中性粒细胞在200×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba和resuspended 2.5×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaIMDM /毫升,0.5毫升叠加MDMφ培养的48-well板块(∼200000 MDMφ/嗯,∼10中性粒细胞/巨噬细胞的比率),然后coincubated 30分钟37°C的5%股份gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。介质从井轻轻吸气,所有细胞都分离500μl trypsin-EDTA之前确定吞噬作用(百分比FL-1-positive MDMφ,被他们独特的前进和侧散射属性)通过流式细胞术使用FACScan (BD生物科学)。化验进行血清的存在或纯化蛋白质,中性粒细胞在IMDM resuspended自体血清包含1%,10μg /毫升纯化蛋白,或1毫克/毫升蛋白质分数从离子交换和凝胶过滤色谱法,除非另有说明在图中传说。对实验要求预孵化与Abs或其他蛋白质分数从离子交换和凝胶过滤色谱法,MDMφ或中性粒细胞孵化与饱和浓度的Abs(最终∼10μg /毫升的浓度取决于流仪结果)或10μg /毫升纯化蛋白或1毫克/毫升蛋白质分数从离子交换和凝胶过滤色谱法,除非另有说明在图中传说。细胞被洗了,之前在IMDM resuspended吞噬化验使用。gydF4y2Ba
血清分离gydF4y2Ba
人类血清透析对50 mM消息灵通的缓冲区(pH值7.0)包含0.14氯化钠一夜之间在阴离子交换色谱使用Q琼脂糖(Sigma-Aldrich)。蛋白质筛选了使用50 mM玫瑰含有氯化钠0.2米,和分数包含最多的蛋白质结合之前透析对50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.4)包含0.14 M氯化钠液(TBS)和集中在凝胶过滤色谱使用Sephacryl s - 300(通用电气医疗集团)。蛋白质浓度筛选了分数被吸光度的测量估计280海里(A280)使用分光光度计或使用bicinchoninic酸蛋白质化验设备,由制造商指定(皮尔斯)。凝胶过滤分数包含吞噬活动被sds - page分析,免疫印迹,和质谱分析来确定蛋白质(两个独立的分析;j . Creanor爱丁堡大学、英国爱丁堡)。gydF4y2Ba
Immunodepletion和免疫印迹gydF4y2Ba
0.2生理盐水洗出液从阴离子交换色谱法与蛋白S孵化Ab(5μg /毫升洗出液)1 h在冰上。Immunodepletion是通过孵化1 h和agarose-coupled山羊anti-rabbit免疫球蛋白在4°C扶轮混合器,紧随其后的是离心13000×gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟到琼脂糖颗粒。为了确保有效的蛋白质消耗,消耗的上层清液受到了三轮。样本使用9% sds - page凝胶nonreducing条件下解决,除非另有说明,转移electrophoretically (80 V 50分钟)到聚偏二氟化物或硝化纤维素膜(微孔)。膜被封锁在TBS含有0.1%渐变与Abs探索。绑定前20 anti-protein年代发现Ab与HRP-conjugated山羊anti-rabbit Igs一起发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团)。gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
所有孵化项目进行冰防止Ab内化。附着MDMφ被孵化分离在哈佛商学院二价阳离子含0.1% EDTA BSA和3毫米。洗后与含有2%的边后卫的冰冷的哈佛商学院,细胞(10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba/分析)与饱和浓度的孵化马伯30分钟。在哈佛商学院细胞被洗两次含有2%的边后卫在孵化FITC-conjugated F (ab′)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba山羊anti-mouse Igs前30分钟分析使用FACScan流式细胞分析仪(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
分析的结果gydF4y2Ba
结果提出了均值±SEM,gydF4y2BangydF4y2Ba=数量的独立实验使用不同捐赠者的巨噬细胞。结果分析重复测量单向方差分析Bonferroni期末测验。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
Glucocorticoid-augmented清除凋亡中性粒细胞巨噬细胞是依赖于血清gydF4y2Ba
先前的研究涉及glucocorticoid-enhanced凋亡细胞的吞噬作用使用monocyte-derived巨噬细胞和凋亡细胞目标培养的血清的存在(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。评估血清调理素作用的潜在作用促进凋亡中性粒细胞间隙,人类血液单核细胞培养5天没有或敏捷,一夜之间和中性粒细胞凋亡呈现文化在无血清条件下(图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。中性粒细胞数量采用无血清培养条件20 h展览的比例略高(63 - 70%,gydF4y2BangydF4y2Ba= 35,95%置信上限)的膜联蛋白VgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ propidium碘化gydF4y2Ba−gydF4y2Ba(凋亡)细胞与中性粒细胞相比培养的血清(50 - 60%,gydF4y2BangydF4y2Ba= 10),符合一个生存因素的存在在人类血清(s)。此外,有更高比例的膜联蛋白VgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ propidium碘化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(其次坏死)采用无血清中性粒细胞文化(18 - 26%,gydF4y2BangydF4y2Ba= 35)相比,中性粒细胞培养的血清(8 - 17%,gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)。gydF4y2Ba
当我们决定治疗的比例MDMφ和Dex-MDMφ中性粒细胞的吞噬能力,我们惊奇地发现,没有明显增加血清观察到凋亡中性粒细胞的吞噬作用Dex-MDMφ(图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。相比之下,在10%自体血清的存在中,我们观察到增加吞噬能力Dex-MDMφ(图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba和gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。血清的存在与否也有一个小,但统计上显著的刺激影响凋亡中性粒细胞的吞噬作用治疗MDMφ(图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaEgydF4y2Ba)。血清的影响在吞噬Dex-MDMφ浓度依赖,达到意义为1%(数据未显示)。血清的存在行为的可能性,促进吞噬活性MDMφ直接被排除在一系列的实验中,预培养的凋亡中性粒细胞与血清被发现提供增强的Dex-MDMφ吞噬能力(数据未显示),提高血清因子结合的可能性Dex-MDMφ凋亡中性粒细胞表面促进吞噬作用。gydF4y2Ba
增强吞噬作用的血清中性粒细胞坏死的存在无关gydF4y2Ba
中性粒细胞凋亡相对异构的方式并在体外培养(图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),因此很难确定增强吞噬调理素作用后,其次取决于存在凋亡或坏死细胞。因此我们对待与roscovitine中性粒细胞,迅速引起中性粒细胞凋亡的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,均匀无感应的继发性坏死(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。中性粒细胞数量培养20μM roscovitine无血清条件4 h展览比例高(80 - 90%)的膜联蛋白VgydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ propidium碘化gydF4y2Ba−gydF4y2Ba(凋亡)细胞的膜联蛋白V不到3%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba/ propidium碘化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba其次坏死细胞(图。1gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。Serum-dependent吞噬作用的增强roscovitine-treated凋亡中性粒细胞Dex-MDMφ证实调理素作用的早期凋亡细胞需要(33.7±9.3%和51.8±6.3% Dex-MDMφ没有和血清的存在,分别)。数据是指比例吞噬±SEM、gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 (∗∗,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01)。gydF4y2Ba
Serum-dependent增强凋亡中性粒细胞的吞噬作用不需要补体激活gydF4y2Ba
下调补充监管分子CD55(衰变加速因子),CD46(膜辅助因子的蛋白质)和CD35 (CR1)表面上的人类凋亡中性粒细胞(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)可能允许补充血清蛋白结合,从而促进其去除吞噬细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。我们发现增加商用C1q-depleted人类血清未能提供增强的吞噬作用(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),这表明C1q血清调理素绑定凋亡中性粒细胞。然而,单独添加70μg /毫升人类C1q(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或C1q-depleted血清(数据未显示)没有恢复吞噬Dex-MDMφ水平观察自体血清的存在。在一系列的实验中研究不同物种的血清的影响,我们指出,增加Dex-MDMφ也观察到当凋亡中性粒细胞的吞噬作用被孵化从小鼠血清中获得,允许我们使用特定血清淘汰赛中定义组件(数据没有显示)。我们发现血清来源于男性或女性C1q-deficient老鼠能够显著增强Dex-MDMφ凋亡中性粒细胞的吞噬作用,证明C1q没有所需的血清调理素(图。2gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。我们下一个抑制补体的激活和随后沉积的表面C3b凋亡中性粒细胞通过预处理自体血清250μg /毫升C3抑制剂试验前10分钟。C3 inhibitor-treated血清的影响区别控制接受pbs血清的增强Dex-MDMφ吞噬作用(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。进一步证实缺乏要求补体的激活和调理素作用的目标是通过使用heat-inactivated血清(图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
识别所需的血清组件增加Dex-MDMφ的凋亡中性粒细胞吞噬作用gydF4y2Ba
已报告的血清因素调节凋亡细胞被巨噬细胞吞噬作用,包括小分子非常大的蛋白复合物。一系列的实验使用大小分离血清表示血清组件要大于100 kDa(数据没有显示)。我们最初试图使用一个“添加”的方法来评估特征明显的作用的血清蛋白质观察调理素作用的现象。这种策略消除免疫球蛋白的作用,pentraxin-3,纤连蛋白、血小板源因素,免疫复合物(表我gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。膜联蛋白我和lipoxin A4是由糖皮质激素抗炎介质,并将其作为刺激通过formyl-peptide受体1(凋亡细胞的吞噬作用gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。然而,预处理Dex-MDMφ10μM WRW4 (formyl-peptide受体1拮抗剂)1 h之前评估凋亡中性粒细胞的吞噬作用的存在10%自体血清没有抑制效果(50.5±9.1%和42.5±6.5% Dex-MDMφ有或没有预处理;平均百分比吞噬作用±标准差,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。同样,凋亡细胞的吞噬作用的比较的控制或膜联蛋白I-deficient小鼠血清证明这个途径不是通过Dex-MDMφ用于识别凋亡中性粒细胞(80.4±6.3%和79.3±3.23% Dex-MDMφ在野生型膜联蛋白分离血清,分别;平均百分比吞噬作用±标准差,gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)。gydF4y2Ba
血清分数的识别和吞噬活性gydF4y2Ba
初步实验表明,血清因子可以绑定在50 mM问琼脂糖玫瑰缓冲区在pH值7.0或以上,筛选了0.2氯化钠(数据没有显示)。因为更少的蛋白质会绑定在pH值为7.0,我们在这个pH促进了后续的分离因子的识别。0.2米的进一步分离氯化钠洗出液使用Sephacryl s - 300列了两个部分重叠峰的大小降序的蛋白质(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba),作为粗蛋白可能部分与第一高峰,代表高分子量蛋白质(> 300 kDa),能够提供增强的吞噬作用(图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
使用质谱鉴定血清组件gydF4y2Ba
蛋白质质谱分析的主要出现在高分子蛋白质质量分数表明校长IgM、αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白,C4-binding蛋白质(C4BP),最有可能在复杂的蛋白S (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。蛋白S的存在的高分子质量分数与凝胶过滤色谱法证实了免疫印迹分析(图3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。先前的工作已经消除了IgM的角色凋亡细胞的吞噬作用的增强Dex-MDMφ(数据没有显示)。凋亡中性粒细胞的吞噬作用Dex-MDMφ20μg /毫升α的存在gydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白没有增强,表明αgydF4y2Ba2gydF4y2Ba巨球蛋白也无关(图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),而中纯化蛋白的年代测定凋亡中性粒细胞的吞噬作用恢复Dex-MDMφ水平所观察到的类似的10%血清(图。4gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。因此我们测试是否immunodepletion 0.2 M蛋白S的生理盐水洗出液影响Dex-MDMφ凋亡中性粒细胞的吞噬作用。如图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,immunodepletion没有导致蛋白质的非特异性清除从0.2 M氯化钠洗出液所评估的总蛋白质染色。确认蛋白质的消耗从0.2年代生理盐水洗出液包含prophagocytic活动是由免疫印迹(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。相比模拟0.2 Ab损耗的生理盐水洗出液、蛋白质S-depleted 0.2生理盐水洗出液未能提供增强的吞噬Dex-MDMφ(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。结合数据呈现在图3gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba,这些数据表明,蛋白S,可能包裹着C4BP,要求赋予Dex-MDMφ的全部吞噬能力。有趣的是,除了250 ng / ml净化人类蛋白S(相当于血清蛋白S的浓度在1%),蛋白质S-depleted 0.2生理盐水洗出液从离子交换色谱法完全恢复Dex-MDMφ吞噬作用(图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。这些数据提出了这样的可能性:蛋白S作为调理素,绑定凋亡中性粒细胞表面Dex-MDMφ专门促进间隙。gydF4y2Ba
蛋白S结合凋亡中性粒细胞calcium-dependent方式Dex-MDMφ调解他们删除gydF4y2Ba
确认蛋白S能够调理的凋亡中性粒细胞,我们preincubated血清凋亡中性粒细胞与高分子质量分数从凝胶过滤色谱法或2.5μg /毫升人类蛋白S在洗涤之前IMDM有或没有添加EDTA 5毫米。绑定蛋白S的中性粒细胞在CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba端依赖的方式可以通过流式细胞仪检测到使用anti-protein年代Ab一起CD16染色定义凋亡和nonapoptotic细胞(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。anti-protein年代Abs绑定的可能性是非通过FcR-mediated互动排除了使用兔子Ig控制(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)以及马伯的封锁FcγRIIa(数据没有显示)。在CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba凋亡、蛋白质结合(CD16 low-expressing)也nonapoptotic (CD16 high-expressing)细胞,但是绑定到凋亡细胞的水平高出2.3倍相对于观察nonapoptotic细胞(图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。相比之下,蛋白S结合差对细胞没有二价阳离子(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。有趣的是,高水平的蛋白S绑定其次坏死细胞观察(CD16中间细胞;图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),证明对许多其他调理素,包括c反应蛋白和C1q (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。凋亡中性粒细胞绑定蛋白S洗时二阶cation-containing介质,但不是在洗EDTA-containing介质,符合calcium-dependent调理素作用事件(图。6gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaDgydF4y2Ba)。然而,我们也观察到低水平的蛋白S绑定nonapoptotic中性粒细胞在二价阳离子的存在,这表明prophagocytic蛋白S对吸收的影响凋亡中性粒细胞的Dex-MDMφ可能需要额外的细胞表面信号。gydF4y2Ba
我们还测试了预孵化的影响中性粒细胞有或没有蛋白质,然后anti-protein年代Ab之前评估的吞噬作用。在进行了两个实验,glucocorticoid-treated巨噬细胞的结果如下:无血清(18%),1%血清(56%),1%血清+ anti-protein S (68%)。一种可能性是,绑定anti-protein年代Ab的中性粒细胞(如图6所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)可能会导致与免疫球蛋白的调理素作用导致FcγR-mediated吞噬作用的途径。没有商用外事局anti-protein年代′准备直接Ab测试这种可能性,我们使用function-blocking马伯,IV.3,阻止交互的绑定到中性粒细胞和巨噬细胞表面免疫球蛋白FcγRII (CD32)。吞噬IV.3治疗不影响吞噬作用(65%与1%血清+敏捷MDMφanti-protein年代;62%的吞噬DexMDMφ1%血清+ anti-protein S IV.3的存在;gydF4y2BangydF4y2Ba= 2)。这些数据可能表明,本研究中使用的多克隆Ab蛋白质S不中和prophagocytic活动或多个FcγRs (FcγRIII和/或FcγRI)表达的MDMφ调解的吸收anti-protein S-opsonized中性粒细胞。gydF4y2Ba
蛋白质由Dex-MDMφ依赖Mertk增强的吞噬作用gydF4y2Ba
表面的表达Mertk,一个潜在的受体蛋白S (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),增加(1.6倍)Dex-MDMφ与未经处理的MDMφ相比(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),与先前的报道一致使用寡核苷酸阵列(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。观察到的老年病Mertk表达并不是由于非特异性受体表达增加,因为CD44是减少Dex-MDMφ相对于未经处理的表面MDMφ(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。评估的贡献Mertk蛋白质S-dependent吞噬,Dex-MDMφ被使用了反Mer Ab吞噬前10分钟。尽管anti-Mer没有影响吞噬作用缺乏蛋白质的年代,anti-Mer显著抑制吞噬Dex-MDMφ在2.5μg /毫升蛋白S(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。类似的实验来确定是否进行Abs蛋白S对吞噬作用起到类似的抑制作用。然而,预处理的中性粒细胞anti-protein年代导致了增加巨噬细胞的吞噬作用,可能通过一个调理素作用的事件(见图6gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)导致FcγR-mediated吞噬作用。相比之下,Mer的封锁也显著抑制血清自体吞噬作用的10%,这意味着Mertk通路对糖皮质激素增加凋亡中性粒细胞的吞噬作用至关重要(图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。我们还研究了短期治疗的效果与敏捷的蛋白S依赖MDMφ凋亡中性粒细胞的吞噬作用。MDMφ被培养在缺乏敏捷96 h被治疗24 h和敏捷。与未经处理的MDMφ(18±5%的吞噬作用缺乏蛋白质S), 96 - 120 h Dex-treated MDMφ水平略高于基底的凋亡细胞的吞噬作用缺乏蛋白S(25±6%),但表现出增加吞噬作用的蛋白S (60±8%)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在这项研究中,我们检测了血清要求背后机制在人类巨噬细胞凋亡中性粒细胞吞噬功能的增强与糖皮质激素治疗后。我们表明,蛋白S调理的早期凋亡中性粒细胞(诱导治疗roscovitine) Dex-MDMφ推销自己的内化,那细胞的存在,经历了二次坏死并不是必要的。这是一个重要的观察,因为大量的血清调理素已报告绑定到晚期凋亡或继发性坏死中性粒细胞,包括C1q pentraxins, c反应蛋白和pentraxin-3 (gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。恢复Dex-MDMφ的吞噬能力高血清分子质量分数提高的可能性要求C4BP-protein年代复杂,已报道抑制凋亡淋巴细胞的吞噬细胞系(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。我们的数据显示存在蛋白S高分子质量分数意味着C4BP-protein年代复杂的可以增强吞噬作用在某些情况下。因为蛋白S绑定可以证明孵化后中性粒细胞在无血清培养高分子质量分数从凝胶过滤或纯化蛋白,一种可能是,在某些情况下,蛋白S可以使分离C4BP和随后oligomerize凋亡中性粒细胞表面(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。我们的数据清楚地表明,蛋白S仅能够带来增加我们观察凋亡中性粒细胞的吞噬作用。gydF4y2Ba
补充蛋白质的重要性在凋亡细胞调理素作用一直在强调补充不足的研究。C1q缺乏症,凋亡细胞的清除受损的发展被认为有助于系统性红斑erythematosus-like自身免疫性疾病(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。Dex-MDMφ,C1q没有恢复水平所观察到的吞噬作用的血清的存在即使C1q-binding蛋白质如pentraxin-3或纤连蛋白(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。此外,C1q-deficient小鼠血清能够赋予吞噬活动,证明C1q并不需要高效的Dex-MDMφ凋亡中性粒细胞的吞噬作用。我们也无法证明调理素作用的角色与C3bi凋亡中性粒细胞通过CR3和CR4删除,据Elkon和他的同事们(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。此外,本研究中给出的数据反驳免疫球蛋白的作用,pentraxin-3,纤连蛋白,膜联蛋白,血小板源因素,免疫复合物在Dex-MDMφ凋亡中性粒细胞的吞噬作用。gydF4y2Ba
我们相信这是第一次报告演示一个开关在使用的分子机制人力MDMφ凋亡细胞间隙。我们的观察显然不同于phosphatidylserine-dependent承认凋亡的诱导小鼠胸腺细胞通过与β1来源于小鼠巨噬细胞治疗的骨,3葡聚糖由Fadok et al。(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。治疗β1 3葡聚糖没有增加吞噬潜力与未经治疗的骨骨髓来源的巨噬细胞相比,但改变的分子机制。相比之下,我们的研究结果表明,凋亡细胞的吞噬作用Dex-MDMφ极其的糖皮质激素,促进关键开关从蛋白质的蛋白质S-dependent识别途径。gydF4y2Ba
组织微环境有可能影响机制参与凋亡细胞清除,因此凋亡细胞的清除能力。细胞因子和基质成分将决定吞噬细胞的分化状态的人群在炎症反应的进展。有趣的是,蛋白质S-dependent凋亡B细胞系识别是以前在csf MDMφ由分化特征(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),促进发展的M2巨噬细胞抗炎表型属性和应对TLR刺激产生il - 10 (gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。我们发现当MDMφ培养的自体血清,凋亡细胞识别途径主要是使用蛋白S dependent-independent(如图1所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。在与dex-treated MDMφ,这些MDMφ更促炎的表型和释放il - 12 TLR刺激,表明蛋白质S-dependent识别途径可能限制炎症巨噬细胞表型与分辨率有关。gydF4y2Ba
的生产和释放潜在的调理素(补充组件、pentraxins膜联蛋白,蛋白S,等等)也监管在炎症。一些报告显示,炎症和凝血级联密切监管,尤其是在急性期反应。蛋白S在肝脏和内皮细胞(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。生产在肝脏蛋白S和C4BP似乎是由炎症介质,包括il - 6 (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。牛奶的蛋白质含量减少缺血性中风患者(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)和脓毒症患者(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),可能通过内皮细胞肿瘤坏死因子的影响(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。相比之下,糖皮质激素已报告提升水平的蛋白S (gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)。基于数据提出了工作,我们建议的主要影响糖皮质激素对巨噬细胞分化的诱导能力识别一组不同的分子信号,提出了凋亡细胞表面。凋亡细胞显示一个复杂表面的分子签名结果细胞死亡受体的表达水平改变了一起绑定(或调理素作用)的许多不同的蛋白质。我们观察的一个推论就是,凋亡细胞的表面分子签名可能解释的不同白细胞数量。gydF4y2Ba
我们也检查治疗的影响区分MDMφ敏捷为24小时(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)在收购的能力蛋白质S-dependent凋亡细胞的吞噬作用。我们的数据表明,增加短期治疗后观察到的吞噬作用也与使用相关的蛋白质S-dependent途径凋亡细胞的识别。因为未经处理的MDMφ和Dex-MDMφ数量检查在这项研究中表达Mertk,之所以Dex-MDMφ启用使用蛋白质S-dependent间隙通路尚不清楚。Mertk表达的一种可能性是,观察到的老年病Dex-MDMφ表面可能足以赋予吞噬的潜力。另外,Mertk可能与其他糖皮质激素治疗后细胞膜受体。Ligand-activated Mertk形成二聚体的膜,导致Mertk自身磷酸化,激活(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),可能与其他Tyro3 /妳/梅尔家族受体二聚化或配合其他受体参与吞噬的过程,比如清道夫受体(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)或αgydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba5gydF4y2Ba(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。诱导受体的协同作用可以调节凋亡细胞的吞噬作用,以应对不同的环境因素在炎症反应中遇到。gydF4y2Ba
此外,糖皮质激素可能会影响下游信号通路的参与Mertk-dependent吞噬作用的关键。我们以前证明glucocorticoid-treated MDMφ表现出减少桩蛋白的磷酸化和本地化和pyk2 podosome-like粘附结构,增加Rac一起活动(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。有趣的是,Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav1激活下游Mertk (gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。Mertk也被报道为α诱导FAK磷酸化和招聘gydF4y2BavgydF4y2BaβgydF4y2Ba5gydF4y2Ba和形成p130Cas / CrkII / Dock180复杂(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。一种可能性是,Mertk在酪氨酸的磷酸化gydF4y2Ba867年gydF4y2Ba没有装配的粘附结构促进MDMφ吞噬活动(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Mertk的诱导表达和蛋白S糖皮质激素可以促进收购一个负反馈通路都关掉促炎细胞因子的生产(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),提高吞噬凋亡细胞的能力。糖皮质激素的疗效在治疗系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的特点是损伤凋亡细胞的清除可能是由于,在某种程度上,这些proresolution机制的参与。操纵Mertk通路可能代表一种新颖的方式参与糖皮质激素的作用,有利于解决炎症没有促进有害的副作用。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢阿德里亚诺罗西,西蒙•布朗在英国医学研究理事会和约翰Savill炎症研究中心有关这项工作的建设性意见。我们感谢马里诺Botto(医学部门、帝国理工学院、伦敦、英国)讨论有关补充的角色在凋亡细胞的吞噬作用。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
作者没有财务利益冲突。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这篇文章的出版成本支付部分费用的支付页面。这篇文章必须在此标记gydF4y2Ba广告gydF4y2Ba按照18事项部分1734只表明这个事实。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项工作由欧洲共同体支持格兰特(qlk3 - ct - 2002 - 02017),英国心脏基金会,德意志Forschungsgemeinschaft和医学研究理事会(英国)。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba地址对应Ian Dransfield博士和重印请求医学研究理事会炎症研究中心女王医学研究所,47个小法国新月,爱丁堡,英国。电子邮件地址:gydF4y2Bai.dransfield在{}ed.ac.ukgydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba3gydF4y2Ba略语摘要:敏捷,地塞米松;C4BP C4-binding蛋白质;二乙酸5-chloromethylfluorescein CMFDA;MDMφmonocyte-derived巨噬细胞;Mertk Mer酪氨酸激酶。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2008年10月17日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2009年6月3日。gydF4y2Ba
- 版权©2009年由美国免疫学家协会有限公司gydF4y2Ba
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