CCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞来源的树突状细胞和渗出的巨噬细胞产生流感诱导的肺免疫病理和死亡率gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

高致病性流感毒株的显著死亡率似乎是由于它们倾向于诱导严重的细胞因子介导的免疫病理(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在1918年流感大流行期间，年轻健康成年人的死亡率异常高，感染与毒血症、低氧血症和严重出血性炎症性肺水肿(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．动物感染1918病毒株后，会导致严重的肺部炎症，肺组织中细胞因子和趋化因子的表达增加，以及异常无效的免疫反应(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．感染高致病性禽流感的人死亡率高，急性呼吸窘迫综合征进展为呼吸衰竭、淋巴细胞减少、血小板减少和反应性噬血细胞综合征，据认为是由于免疫激活失控(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．一种细胞因子风暴，血清中有异常高水平的趋化因子和细胞因子(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)及肺(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，常与致命结果相关(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．广泛散布的病毒感染和继发性细菌性肺炎似乎很少见(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

流感感染的免疫病理与几种特定的细胞因子有关。NO合成酶2 (NOS2)缺陷小鼠gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba或TNF-α在感染小鼠适应型流感时显示死亡率降低(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)．这种生存率的增加似乎是因为NOS2和TNF-α诱导明显的肺损伤，但对抗流感免疫应答贡献不大(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)．流感感染期间致病细胞因子的来源尚未确定，但脓毒症期间肺免疫病理的发展与骨髓来源的细胞类型产生的NOS2有关，并通过巨噬细胞消耗减少(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)．在大多数急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)．在流感病例中，髓样浸润占主导地位，体外感染的巨噬细胞是炎症细胞因子的主要来源(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)．流感感染期间肺内单核/巨噬细胞的积累与肺损伤的发展有关。缺乏ccr2的流感感染小鼠显示单核/巨噬细胞积累减少，肺损伤减少，死亡率下降趋势，而缺乏CCR5的小鼠显示肺浸润增加和肺损伤增加(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)．ccr2缺陷小鼠肺中单核/巨噬细胞积累减少，其他炎症性肺疾病的肺损伤减少(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)，表明一个或多个CCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞类型可诱导肺免疫病理。然而，导致流感诱导的免疫病理和死亡率的具体细胞类型和细胞迁移事件尚未确定。gydF4y2Ba

直到最近，所有的巨噬细胞都被认为是沿着单一核吞噬细胞谱系的细胞渐进式成熟发展而来的。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)．现在已经认识到，血液循环中至少存在两种不同的单核细胞种群(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)．构成单核细胞，在小鼠中为CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCCR2gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba细胞，通过趋化因子受体CX3CR1 (gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)．炎性单核细胞是CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2BaCCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba通过CCR2活性进入炎症外周和淋巴组织的细胞(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba)．Gr-1的小种群gydF4y2Ba^intgydF4y2BaCCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞也有描述(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)．单核细胞在体内分化为树突状细胞(DC)已有充分的文献记载(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)．然而，单核细胞在大多数病理条件下作为DC前体的程度尚不清楚(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在这项研究中，我们确定了对CCR2刺激产生反应的小鼠肺中累积的细胞类型，并对其表型和特征进行了描述(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)．然后，我们检测我们在野生型(WT)小鼠流感感染期间识别的细胞类型。我们发现流感感染肺部的大多数炎症细胞来自CCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞，包括单核细胞来源的DC (moDC)，渗出型巨噬细胞(exmac)和一种移行细胞类型。这些CCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞来源的细胞在流感感染的肺部提供了大量的细胞因子生产，是导致流感诱导的免疫病理、发病率和死亡率的主要细胞类型。gydF4y2Ba

BALB/c, C57BL/6和CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠从查尔斯河实验室或杰克逊实验室购买。表面活性蛋白C (SPC)-MCP转基因小鼠(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)在BALB/c背景上回杂交了8代。CX3CR1gydF4y2Ba^{绿色荧光蛋白(GFPgydF4y2Ba}小鼠由D. Littman(纽约大学，New York, NY)提供，并与WT小鼠杂交产生CX3CR1gydF4y2Ba^{+ / GFPgydF4y2Ba}老鼠。DO11.10小鼠(ova特异性TCR)和血凝素(HA)-TCR小鼠(流感HA特异性TCR)从杰克逊实验室购买。所有用于实验的小鼠均在8 ~ 13周龄之间。为了对流感感染的肺细胞进行流动分析，用氯胺酮(100 mg/kg)/羟嗪(10 mg/kg) i.p.麻醉小鼠，然后感染甲型H1N1流感病毒株A/Puerto Rico/8/34 (PR8) (Y.-W.提供)。He, Duke University, Durham, NC)鼻内(30 μl of 8.9 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba组织培养感染剂量gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)每只老鼠/毫升病毒)。每日监测感染小鼠体重。在死亡率、病理和病毒滴度研究中，小鼠感染相同的病毒株(高剂量，30 μl, 5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba/毫升;低剂量，30 μl 8.5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaTCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba/ml)，但来自不同的来源(American Type Culture Collection VR-95)。所有动物实验都是按照美国国立卫生研究院的指导方针和杜克大学动物护理和使用委员会批准的协议进行的。gydF4y2Ba

如前所述，收集BAL细胞(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)．简单地说，将安乐死小鼠的气管用连接1ml注射器的18号血管导管进行插管，然后用0.6 ~ 0.8 ml的PBS冲洗肺部5次。用PBS冲洗一次BAL细胞。肺内灌注hbss -胶原酶3 ml (1 mg/ml)， 37℃孵育30 min，切碎，70 μm网滤解离，450 ×离心，获得肺实质细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下20分钟，在17%的metrizamide(精确化学和科学)垫子。收集低密度细胞，PBS冲洗，进行Ab染色。gydF4y2Ba

使用的抗体包括抗nos2 FITC、抗i- a /I-E FITC、抗cd11c PE和抗gr -1异藻蓝蛋白(均为BD Pharmingen);抗cd11b异藻蓝蛋白/Cy7、抗cd11c PECy5.5、抗cd80 PE、抗cd86 PE、抗cd40 PE、抗icos配体(IcosL)生物素和链霉亲和素PE (eBioscience)。抗ccr2 Ab MC-21由M. Mack (Klinikum大学，Regensburg，德国)提供。细胞在含10 mM EDTA、10 mM HEPES、5%胎牛血清、5%正常小鼠血清、5%正常大鼠血清和1% Fc块(eBioscience)的HBSS中染色，在4℃下孵育30分钟;洗三次;然后用BD LSRII流式细胞仪进行分析。细胞分选时，将细胞按上述方法收集并染色，然后使用BD FACSVantage细胞分选机将细胞分选成2 - 4个群体。为了进行形态学分析，从SPC-MCP肺中提取facs纯化的细胞群，以600转/分钟的速度将细胞纺丝到显微镜载片上，用Giemsa染色，并在光镜下拍照。gydF4y2Ba

从SPC-MCP肺中获得一系列稀释的facs纯化的AM, DC和exmac，用10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba含或不含OVA肽的T细胞在96孔板中培养3天。同种异体CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞使用淋巴细胞M梯度从C57BL/6小鼠的脾脏和淋巴结(LN)中纯化，然后在MACS柱上进行阴性选择，使用生物素化的抗cd8、抗cd11b、抗cd11c、抗b220、抗cd16 /32、抗cd19、抗cd49b、抗gr1和抗ter119 Abs (BD Pharmingen)和链霉亲和素磁珠(Miltenyi Biotec)。幼稚和总ova特异性CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用同样的方法从DO.11.10小鼠的脾脏和淋巴结中提取T细胞，除单纯CD4细胞外gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba阴性选择后用50-70% Percoll进一步纯化T细胞。培养3天后，用BrdU Kit (Roche Applied Science)检测T细胞增殖。对于CD8 T细胞增殖，10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba从流感感染的肺中提取流式细胞学纯化的AM, DC, exmac和双中间(DI)细胞gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞在96孔板中培养3天。CD8 T细胞被纯化为CD4 T细胞，只是在阴性选择中使用了抗CD4而不是抗CD8。CD8 T细胞在与apc培养前用CFSE (Invitrogen Life Technologies)标记。由于APC在感染小鼠中不以不同的群体存在，细胞被门控以有利于具有较低APC活性的群体的纯度。基于严格后排序分析的apc纯度为:AM, 97%;DI, 85%;DC, 65%(被DI细胞污染);exmac, 68%(被AM污染)。3天后，用流式细胞术分析每孔细胞，记录CFSE稀释CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba

从SPC-MCP肺中纯化的AMs、dc和exmac在RPMI 1640中96孔板中培养2天，添加或不添加LPS。使用比色三明治ELISA试剂盒(R&D Systems)测定上清的TNF-α浓度。标准曲线最低浓度为15.6 pg/ml。NOS2细胞内染色，原始WT和流感感染WT和CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}第5天处死小鼠。采集BAL和肺薄壁组织细胞，如上;用抗cd11c、CD11b、I-A/I-E和Gr-1染色;然后使用BD Cytofix/ cytooperm溶液进行固定和渗透。用抗nos2 FITC或IgG FITC染色，流式细胞术分析。gydF4y2Ba

第6天处死感染流感的小鼠。如上所述，获得BAL液(3ml)，并通过离心分离BAL细胞。根据制造商的说明，使用Bradford化验试剂(Pierce)测定总蛋白浓度。使用基于LDH的毒理学分析试剂盒(Sigma-Aldrich)测定BAL液中LDH活性。gydF4y2Ba

小鼠感染流感，第5天处死。如上所述，获得BAL液。肺组织在同样的BAL液(2ml)中切碎，用尼龙网分离，离心去除细胞，收集上清。用Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞标准空斑法或TCID法定量测定肺和血清中流感病毒滴度gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba（gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)．在斑块测定中，肺或血清样品被连续稀释在含有钙的PBS中gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}0.1%牛血清白蛋白。稀释的样品被镀在MDCK细胞融合的单层上，并在组织培养箱中37°C吸附1小时。1 h后去除接种，用含有1× MEM的琼脂覆盖细胞gydF4y2BalgydF4y2Ba-1-tosylamido-2- pheny乙基氯甲基酮处理胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)，最终浓度为0.1 μg/ml。在组织培养箱(37°C, 5% CO)中培养2天gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)使斑块形成。当斑块清晰可见时，取去琼脂，用1%结晶紫甲醇染色以辅助计数，然后测定每个样品的PFU。测定TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba， 10×连续稀释0.2 ml等份肺样品，在96孔板中重复加入3份。共2.5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba每孔加入MDCK细胞，板在37°C孵育5天。用鸡红细胞凝集和TCID鉴定感染孔gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba按所述计算(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

所有数值数据均以平均值±标准差表示。生存曲线之间的比较采用Prism软件的对数秩检验。该测试相当于Mantel-Haenszel测试。其他数据均采用方差分析(ANOVA)或无配对Student 's分析gydF4y2BatgydF4y2Ba使用Prism软件进行测试，如图图例所示。gydF4y2Ba

由于在活动性感染中明确识别肺部炎症细胞通常是困难的，我们通过检查CCL2过表达时在肺中积累的细胞类型来开始这些研究。在流感感染期间，CCL2在肺中以高水平表达，并与该病中单核/巨噬细胞的积累有关(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)．为了模拟在没有伴随细胞激活和细胞病理的流感感染过程中发生的CCL2的稳健表达，我们使用SPC- mcp小鼠，在SPC启动子(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)．我们和其他人已经表明，在SPC-MCP小鼠的肺中有大量的单核细胞和巨噬细胞积累，但尚未对恢复的细胞进行详细的表型分析(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)．我们现在发现SPC-MCP小鼠的BAL和肺包含四种不同的单核-巨噬- dc家族的细胞类型。为了明确起见，我们将根据这些研究的结果来确定每一种细胞类型，尽管在这些研究进行时，一些人群的身份还不知道。gydF4y2Ba

在SPC-MCP肺中发现的第一种细胞类型是肺泡巨噬细胞(AM)。与以往报告一致(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)、AM均为自荧光CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^−gydF4y2BaMHCIIgydF4y2Ba^低gydF4y2Ba在WT小鼠中，>细胞占BAL细胞的90%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba门R3)。在WT肺的消化中可以清楚地看到AM。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba并且在SPC-MCP小鼠的BAL和肺中数量增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba，门R3，和gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．在细胞自旋上，AM表现为大而圆的细胞，具有丰富的液泡化细胞质。gydF4y2Ba1gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在SPC-MCP肺中发现的第二种细胞类型是DC。这些是CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2BaMHCIIgydF4y2Ba^高gydF4y2Ba这些细胞在WT BAL中非常罕见，但在WT肺消化中却很明显(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCgydF4y2BaR1门)。在BAL中DC增加，在SPC-MCP小鼠肺中DC明显增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba， R1门，和gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．来自SPC-MCP小鼠的DC显示Gr-1表达增加(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba模拟gydF4y2BaR1门)，增加了这些细胞最近从Gr-1分化出来的可能性gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba前体人口。形态学上，DC是细胞质空泡化的小细胞，细胞质/核比低，细胞核不规则，树突状突起。gydF4y2Ba1gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在SPC-MCP肺中发现的第三种细胞类型是炎性单核细胞。大部分的CD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2BaMHCIIgydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞表达高水平的Gr-1(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba，门R2和R4)，其余为Gr-1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2BaR5门)。Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba单核细胞与中性粒细胞在几种标记物的表达上重叠(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba模拟gydF4y2Ba， R4门)，但可根据Gr-1表达水平和侧散射与后者区分(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)或通过CX3CR1的表达(见下文)。在WT小鼠的BAL和肺中，单核细胞呈极低水平存在(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．肺单核细胞显示血液中单核细胞的形态。gydF4y2Ba1gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与上述细胞不同，我们在SPC-MCP肺中发现的第四种细胞类型在以前的流式细胞术研究中没有明确识别。在SPC-MCP小鼠的BAL和肺中，在CD11c和MHCII谱中出现了与AM共定位的细胞，但为CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和显示比AM更少的侧散射(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaDgydF4y2Ba门R3和R7)。这些细胞被证明是exmac。在细胞自旋上，exmac几乎和AM一样大，有丰富的细胞质，典型的有双叶状或肾形核(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进一步表征SPC-MCP小鼠的肺细胞类型，我们检测了共刺激分子和趋化因子受体CX3CR1和CCR2的表达。正如预期的那样，肺单核细胞表达高水平的CX3CR1和CCR2，因此可以很容易地与中性粒细胞区分，中性粒细胞两种分子都不表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．肺DC为CX3CR1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，以CCR2为主gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，表达高水平的CD80和CD86，低水平的CD40(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．有趣的是，从SPC-MCP小鼠肺中恢复的DC与从WT肺中获得的DC有所不同。来自SPC-MCP小鼠的结果显示，DEC205的表达减少，正向散射减少，CD11b的表达增加。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)，提示SPC-MCP小鼠的DC可能代表一种招募的细胞群，不同于驻留的肺DC。AM表达低水平CD80，但不表达CX3CR1、CCR2、CD86和CD40(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．相比之下，exmac表达CCR2，统一为CX3CR1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，表达高水平的CD80和CD86，但表达低水平的CD40(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaBgydF4y2Ba)，因此看起来更像直流电而不是调幅。所有肺APC类型均表达高水平的IcosL。gydF4y2Ba

在功能研究中，从SPC-MCP小鼠获得的DC在所有APC活性测定中都能刺激健壮的T细胞增殖，包括异基因T细胞增殖(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，幼稚的ova特异性DO11.10 T细胞增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)和总的(幼稚加记忆)DO11.10 T细胞增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．AM只刺激低水平的异体T细胞增殖，不刺激ag特异性T细胞增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)．exmac刺激中等水平的异基因T细胞增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和中等水平的ag特异性T细胞增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．然而，它们不会刺激幼稚的ag特异性T细胞的增殖(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)，因此在本研究中被定义为巨噬细胞，而不是DC细胞类型。对于先天免疫功能的研究，我们检测了炎症细胞群产生TNF-α的情况。当培养时，从SPC-MCP小鼠纯化的AM只产生背景水平的TNF-α，而DC产生低水平的TNF-α(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaDgydF4y2Ba)．相反，exmac产生大量的TNF-α，这可以通过LPS刺激进一步增加。基于上述试验和之前的报道，我们确定了在SPC-MCP小鼠肺中积累的主要细胞类型为炎症单核细胞、DC、AM和exmac。gydF4y2Ba

一旦我们确定了因CCL2过表达而积累在肺部的炎症细胞类型并对其进行表型分析，我们就试图确定这些相同的细胞类型是否也出现在WT小鼠感染期间。因此，我们检测了感染流感的WT BALB/c小鼠的肺细胞群。在最初的研究中，感染WT小鼠的细胞群与未感染SPC-MCP小鼠的细胞群相似;然而，CD11b的高频率gydF4y2Ba^+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在感染WT小鼠中发现的细胞使中性粒细胞与其他细胞类型难以区分(数据未显示)。然后我们检测了流感感染的CX3CR1肺部的炎症细胞gydF4y2Ba^{GFP / +gydF4y2Ba}小鼠，该模型允许GFP的明显区分gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba来自其他CD11b的中性粒细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞类型(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， GFP门控未显示)。因为CX3CR1gydF4y2Ba^{GFP / +gydF4y2Ba}我们在感染第5天比较了BALB/c和C57BL/6小鼠的炎症细胞数量，发现菌株之间没有显著差异(现在的数据显示)。CX3CR1的流感感染gydF4y2Ba^{GFP / +gydF4y2Ba}小鼠的Gr-1数量显著增加gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba肺中的单核细胞(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．肺Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba单核细胞数量在第5天达到峰值，到第15天回到基线(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．流感感染也会导致肺AM频率的相对和绝对下降(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．AM的数量在第10天达到最低点，但在第15天恢复。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．受感染小鼠的肺exmac数量也会增加。值得注意的是，exmac几乎都是Gr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba但都是Gr-1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba第10天(图5)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)，表明这些细胞最近已经从Gr-1分化出来gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞。ExMAC数量在感染第10天达到峰值。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．出乎意料的是，在流感感染过程中积累最多的炎症细胞类型是DC(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba)．与exmac一样，几乎所有的肺DC都是Gr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在感染后第5天，但Gr-1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba第10天(图5)gydF4y2Ba4gydF4y2BaDgydF4y2Ba)，表明这些细胞来自Gr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞，因此代表moDC。在第5天，单鼻内灌注PBS不会刺激肺细胞群发生显著变化(数据未显示)。gydF4y2Ba

除了上述细胞外，流感感染还导致一种在SPC-MCP小鼠中未观察到的肺炎症细胞类型的存在。这些细胞表达CD11c和MHCII的中间水平，因此在本研究中称为DI细胞(图1)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．DI细胞表达高水平的CD11b、Gr-1和CX3CR1(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba，数据未显示)，似乎代表Gr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞正在分化成更成熟的细胞类型。与此一致的是，DI细胞的数量在感染早期达到峰值。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba)， DI细胞在感染第5天表达中间水平的CD80、CD86和CD40(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．第5天单核细胞的CD80、CD86和CD40表达增加。有趣的是，流感感染导致AM几乎没有改变CD80、CD86或CD40的表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)，表明这些细胞的激活并不促进炎症反应。相反，DC和exmac表达非常高水平的CD80、CD86和CD40(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了确定在流感感染小鼠肺部发现的炎症细胞类型刺激流感特异性T细胞反应的能力，我们检测了这些细胞刺激流感ha特异性CD8增殖的能力gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。感染第5天从肺中回收的流式细胞因子纯化DC刺激了健壮的ha特异性T细胞增殖(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．同时恢复的DI细胞刺激中度的ha特异性T细胞增殖(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．exmac和AM似乎只能刺激低水平的T细胞增殖。gydF4y2Ba

确定表达NOS2的炎症细胞群，NOS2是一种已知的在流感感染期间导致肺损伤和死亡的酶(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)，通过细胞内染色检测NOS2的表达。感染第5天从肺部恢复的exmac和DC均表达NOS2，而AM则不表达NOS2(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．DI细胞中NOS2表达呈双峰分布(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

上述发现与Gr-1模型一致gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba炎症单核细胞在流感感染后进入肺部，上调CD11c和MHCII的表达成为DI细胞，然后成熟为exmac或moDC。为了证实DI细胞、exmac细胞和DC细胞来源于肺内的单核细胞，我们过继地移植了Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba或Gr-1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba单核细胞(来自SPC-MCP小鼠的肺部)通过气管进入WT小鼠的肺部，并检测这些细胞在流感感染存在或不存在的情况下的发育。在移植后48 h和感染后24 h分别检测BAL供体来源细胞的表型。供体细胞均为CD11cgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba和MHCIIgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba传输前(数据未显示)。在没有流感感染的情况下，两者都是Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba和Gr-1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba单核细胞成熟为DI细胞，少部分成熟为exmac细胞，但DC细胞不成熟(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．在感染流感的Gr-1受体中gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba在单核细胞中，大部分exmac细胞和DI细胞都是供体来源的，但很少DC细胞是供体来源的(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．相反，在感染Gr-1受体的DC、exmac和DI细胞中，供者来源的细胞占很大比例gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba单核细胞(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．因此，在流感感染期间，DI细胞，exmac和DC可以从肺部的炎症单核细胞衍生。流感感染似乎增加了单核细胞向moDC的分化(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaDgydF4y2Ba)，虽然这个趋势没有达到统计意义(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.14)。gydF4y2Ba

上述结果有力地表明，流感感染第5天，肺部出现的绝大多数炎症细胞来自CCR2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba炎症单核细胞，因此，这些细胞的积累可能依赖于CCR2。为了验证这一点，我们检测了CCR2中的肺细胞群gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠流感感染后5天。我们发现CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠的DC、exmac、DI细胞和Gr-1的积累明显减少gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞在流感感染期间(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．此外，在CCR2中减少最多的种群gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠是CD11bgydF4y2Ba^高gydF4y2BaGr-1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaDC和exmac的子集(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba而且gydF4y2BaCgydF4y2Ba)和DI细胞(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．这些也是表达CD86和CD40水平最高的细胞类型，导致在感染的CCR2中表达这些共刺激分子的细胞显著减少gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2BaDgydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba,gydF4y2BaHgydF4y2Ba)．在CCR2中表达NOS2的细胞频率也显著降低gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2BaFgydF4y2Ba而且gydF4y2BaHgydF4y2Ba)．总的来说，在CCR2中，流感感染期间DC、exmac和DI细胞的积累减少了约80%gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaGgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

ccr2缺陷小鼠的炎症细胞数量和表达免疫刺激分子和NOS2的细胞频率显著减少，这表明这些小鼠不会受到流感诱导的免疫病理的影响。因此，我们比较了CCR2之间流感诱导肺损伤的标记物和发病率gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}和WT小鼠。大剂量病毒接种后第6天，CCR2 BAL液中总蛋白浓度和LDH活性均显著降低gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}相对于WT小鼠(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠在流感感染后体重也显著下降(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2BaCgydF4y2Ba)．这种减重的减少是高度可复制的。在检查其他终点的研究中，WT小鼠在流感感染第6天平均体重下降19.2%，而CCR2小鼠平均体重下降8.3%gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(gydF4y2BangydF4y2Ba= 14,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0004作者:曼-惠特尼gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试)。最引人注目的是CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠在大剂量流感感染后，流感诱导死亡率下降89%(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2BaDgydF4y2Ba)．重要的是，发病率和死亡率的下降与病毒滴度或传播的增加无关。在高剂量感染5天后，CCR2的肺部流感滴度略有下降，但并不显著gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}与WT小鼠相比(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba)，两组的血液中均未检测到病毒(数据未显示)。为了检查之后时间点的病毒滴度，我们进行了低剂量感染。低剂量感染8天后，CCR2在肺部的滴度再次略低gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaFgydF4y2Ba)，在第10天两组均未检测到。这些结果强烈表明，ccr2依赖的单核细胞迁移和肺中单核细胞衍生的炎症细胞的发育在很大程度上导致了流感感染期间发生的肺损伤和随后的发病率和死亡率。gydF4y2Ba

众所周知，感染流感病毒可引起严重的肺部免疫病理。参与这一过程的细胞类型包括中性粒细胞、激活的AM和由新招募的单核细胞产生的巨噬细胞(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)．在这项研究中，我们证明炎症性单核细胞来源的DC和巨噬细胞是导致小鼠流感感染期间发生的肺损伤、发病率和死亡率的主要细胞类型。这一结论是基于几项调查结果得出的。首先，在流感感染期间，缺乏CCR2会导致体重减轻和死亡率显著下降。死亡率的降低与肺炎症、TNF-α和nos2产生细胞的显著减少相关，并与肺损伤的两个指标相关，强烈提示单核细胞浸润、肺免疫病理和死亡率之间存在因果关系。同时，流感感染导致AM数量减少，而AM的共刺激分子表达、ag递呈活性或NOS2表达很少或没有增加，这表明这些细胞的激活对流感诱导的免疫病理没有显著贡献。我们不能排除中性粒细胞在这一过程中发挥一定作用的可能性，特别是在感染的早期。然而，我们在检查时发现中性粒细胞积累相对较少，我们观察到的积累不受CCR2缺乏的影响(数据未显示)。此外，有条件的Mcl-1敲除小鼠，循环中性粒细胞数量减少了约80% (gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)，尽管肺中性粒细胞积累减少了70% (K. Lin，未发表数据)，但流感感染后的体重减轻或死亡率没有变化。gydF4y2Ba

流感感染CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}小鼠的肺炎症和病理组织学指标下降，BAL中的单核/巨噬细胞数量减少，死亡率下降的趋势(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)．在这项研究中，我们发现CCR2缺乏对炎症和死亡率有更大的影响。这很可能是由于我们使用了更高剂量的流感疫苗，导致WT小鼠的死亡率更高，并且我们使用了流式细胞术分析肺细胞。我们的结果与在nos2缺陷小鼠中获得的结果极为相似，显示流感感染后肺炎和死亡率显著降低(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．这表明NOS2的产生可能是单核细胞来源的细胞诱导免疫病理的主要机制，如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba单核细胞来源的细胞是流感感染过程中iNOS的主要来源。gydF4y2Ba

CCR2中死亡率降低的幅度gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}这是令人惊讶的，因为CCR2是控制许多肺部感染所必需的(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)．然而，与大多数其他病原体不同的是，流感病毒似乎对宿主反应具有耐药性，如NOS2的产生，而这些反应可能只抑制有效的适应性免疫反应(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)．与此一致的是，我们发现流感感染的CCR2gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}与WT小鼠相比，小鼠肺病毒滴度很少或没有增加，也没有病毒传播的证据。在之前的两项研究中，发现缺乏CCR2对(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)或增加(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)肺流感滴度。然而，在后一项研究中，检测的是BAL而不是肺匀浆的滴度。缺乏nos2的小鼠在流感感染期间也显示肺病毒滴度降低(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们在转基因CCL2和感染流感的WT小鼠中检测了单核细胞衍生的炎症细胞类型，提供了CCR2中所见的免疫病理降低的机制gydF4y2Ba^{−−/gydF4y2Ba}老鼠。正如预期的那样，在这两种模型中招募到肺部的主要循环细胞类型是炎症单核细胞，其中包括Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba在较小程度上，还有Gr-1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba细胞(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这一发现与以前在炎症皮肤、腹膜和肺中得到的结果相似，因为Gr-1gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba和Gr-1gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba单核细胞表达CCR2，并已显示在CCL2表达或给药位点积累(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)．进入肺后，炎症单核细胞成熟形成一种移行细胞类型(DI细胞)，增加其CD11c、MHCII、CD40和CD86的表达，同时继续表达高水平的Ly-6C。这些细胞的一部分也表达NOS2。DI细胞似乎继续分化成为moDC或exmac。出乎意料的是，在流感感染期间，向moDC的分化占主导地位，因为这些细胞是在流感感染的肺部发现的最大的炎症细胞群。moDC的命名基于其CD11c和MHCII的高表达、Ly-6C的瞬时表达、形态学、刺激原始T细胞的强大增殖能力以及过继转移的Gr-1的衍生gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba单核细胞。MoDC能够刺激流感特异性T细胞，但目前尚不清楚这是否有助于抗流感免疫应答。gydF4y2Ba

我们在SPC-MCP和流感感染的肺中发现的第二大成熟炎症单核细胞源性细胞群是exmac。我们对这些细胞的命名是基于它们的巨噬细胞样形态、它们刺激记忆的能力而不是单纯T细胞增殖，以及它们直接来自单核细胞(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaEgydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．exmac显示了DC的几种表型特征，包括CD11c、CX3CR1、CD80、CD86和CD40的稳定表达(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．然而，它们不会被归类为DC亚型，因为它们似乎不刺激幼稚T细胞的增殖，而且它们几乎不刺激ha特异性T细胞增殖。exmac是炎症细胞因子的主要来源，产生高水平的TNF-α和NOS2(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

单核细胞来源的细胞是流感感染期间免疫病理的主要原因，这一发现增加了这些细胞在其他类型的急性肺损伤中起重要作用的可能性。类似于moDC和/或exmac的细胞已在几种类型的肺部炎症中被描述过，包括博莱霉素治疗(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)， GM-CSF过表达(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)和气管内灌注热杀剂gydF4y2Ba单核细胞增多性李斯特氏菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)．因此，可以想象，抑制CCR2将提供一种手段，以减少几种类型的肺部炎症的肺损伤。这种可能性可能局限于肺损伤的非传染性原因或流感等感染，在这些感染中，单核细胞来源的细胞对控制感染没有显著贡献。CCR2抑制是否会产生与CCR2缺乏相同的效果，或是否会导致其他不良影响，如继发性细菌感染的增加，仍有待确定。gydF4y2Ba

我们感谢博士。韦杰和何友文向我们提供流感病毒;Matthias Mack博士负责抗ccr2单抗;丹·利特曼博士的CX3CR1gydF4y2Ba^{GFP / +gydF4y2Ba}老鼠;杜克人类疫苗研究所流式细胞仪的John Whitesides、Patti McDermott和Danielle King为他们提供了出色的技术支持;鼠群管理的中野惠子。gydF4y2Ba

作者没有经济利益冲突。gydF4y2Ba