肿瘤坏死因子受体2-Deficient CD8 T细胞对Fas / Fas Ligand-Induced细胞死亡¹

Fas (CD95)及其配体(FasL)³分别TNFR和肿瘤坏死因子家族的成员(1,2)。这receptor-ligand一对中扮演一个重要的角色在外围的体内平衡免疫系统(3)。FasL表达主要激活淋巴细胞,能够诱导细胞程序性死亡在几乎所有Fas-expressing细胞,如果他们接受它的信号(3,4)。这种交互的重要性为淋巴细胞内稳态的维持是在与自然相关的广泛性淋巴组织丧失突变Fas (lpr)及其配体(gld)(2,5)。纯合子小鼠的lpr或gld非常相似的进步发展良性的淋巴增殖性疾病表现为脾肿大,淋巴结病严重,hypergammaglobulinemia,循环自身抗体和过早死亡。

肿瘤坏死因子,原型这个家族的成员,也是潜在的重要诱导细胞程序性死亡(1)。这种细胞因子是许多细胞类型的产品,特别是白细胞,是一个重要的中介在早期的炎症反应(1)。与基因敲除小鼠的实验也表明,这两个TNFRs TNFR1(过去)(6)和TNFR2(我)(7),参与细胞凋亡的诱导和随后删除Ag-specific成熟的T细胞。然而,过去^−−/和我^−−/老鼠是正常的大小和淋巴细胞的成分隔间(8,9)。Fas和TNFR1包含守恒的胞质尾死域,调节蛋白质-蛋白质之间的关系定义(10,11),允许其他死亡的招聘domain-containing蛋白质如Fas-associated死域蛋白质(FADD) (MORT1) TNFR-associated死域蛋白质,或受体相互作用蛋白(RIP) (12,13,14,15,16,17)。FADD的协会Fas的招聘或TNFR1结果Fas-associated死域IL-1-converting酶/ MORT1-associated CED-3同系物(半胱天冬酶8),进而导致细胞死亡的激活(18,19)。Fas或TNFR1相比,胞质尾TNFR2不包含一个死域,不与死domain-containing蛋白质如FADD、撕裂或TNFR-associated死域蛋白质。然而,一些研究表明,TNFR2也可以转换TNF-dependent凋亡信号(7,20.)。最近,结果表明,细胞死亡由TNFR2取决于裂缝的存在,对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之前显示所需NF-κB激活TNFR1 (21)。这些研究表明,其他信号分子调节这种受体诱导细胞死亡。的胞质尾TNFR2已被证明与信号转导分子称为TNFR-associated因素(TRAF)蛋白质,尤其是TRAF1和TRAF2 (22)。在某些情况下,TRAF蛋白质已被证明调解各种生物效应产生的同源受体。例如,TRAF2证明调解NF-κB激活(23,24,25)。

在这项研究中,我们使用欺诈A-activated CD4和CD8 T细胞lpr / lpr,TNFR1^−−/,或者TNFR2^−−/老鼠确定肿瘤坏死因子的相对贡献和Fas信号通路在这些细胞诱导细胞死亡。我们的研究结果与假设一致TNFR2扮演不同的监管角色在激活TNF引起的细胞死亡或FasL CD4和CD8 T细胞。

育种者对C57BL / 6 (B6) B6-p55^−−/,B6-p75^−−/和B6 -lpr / lpr老鼠从杰克逊实验室获得(巴尔港,我)。这些老鼠被饲养在动物单位在我们部门。6 - 8周的小鼠年龄被用于描述的实验。

Abs及其特异性如下:Jo2, Fas (CD95) (PharMingen,圣地亚哥,CA);K10、Fas配体(PharMingen);53.67,CD8α(美式文化集合(写明ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州);53.58,CD8β(写明ATCC);GK1.5, CD4(写明ATCC);145 - 2 - c11 CD3ε(写明ATCC);55 r - 593,过去(Genzyme、剑桥、马);TR75-32,我(Genzyme)。FACScan配备LYSYS II软件(Becton Dickinson)被用来获取和分析数据。对于三色分析,25000事件了。

CD4⁺CD8⁻(CD4)和CD4细胞⁻CD8⁺T细胞(CD8)被孤立的淋巴结显示鼠标线通过孵化细胞与生物素化的anti-CD4或anti-CD8β马伯,分别,其次是使用mac女士积极的选择⁺分离柱和MiniMACS磁铁制造商提供的程序(Miltenyi生物技术,赤褐色,CA)。的纯化CD4和CD8淋巴结细胞纯度> 95%,和5×10⁵/毫升的纯化细胞培养与2.5μg /毫升的反对和20 U /毫升的48 - 2 h。所有细胞培养在Iscove DMEM(生活技术,伯灵顿,安大略省,加拿大)补充10% (v / v)的边后卫和抗生素(I-medium)。文化被分裂1 2 I-medium包含20 U / ml - 2和培养一个附加的后24 h。这种文化时期,这些细胞被评估为细胞表面标记物的表达或TCR-induced细胞死亡化验,表示。评估TCR-induced细胞死亡,第三天激活细胞(1×10⁵)镀上的平底微量滴定井已经预镀2 1μg /毫升的c11马伯在0.20毫升I-medium包含20 U /毫升- 2。16小时的潜伏期后,细胞从个别井收集和评估细胞死亡。这样做是通过孵化细胞7-amino放线菌素D (7-AAD;Calbiochem拉霍亚,CA),如前所述26,27)。然后用多聚甲醛固定细胞,流式细胞仪分析。细胞染色7-AAD⁻被认为是nonapoptotic和可行的。具体的百分比杀死被确定为100×(1−(%的可行的细胞培养2 c11) /(%的可行的细胞培养没有2 c11))。

3 t3成纤维细胞,模拟转染(3 t3-psrγ)或Fas配体转染(FasL-3T3)请提供的尼克博士Crispe(耶鲁大学纽黑文,CT)。3 t3-psrγFasL的表达和FasL-3T3细胞系决心通过流式细胞仪分析。为评估Fas / FasL-mediated杀戮,第三天CD4和CD8 Con爆炸从各种鼠标线⁵¹Cr标记。总共1×10^{4 51}Cr-labeled细胞镀上井包含3×10⁴l×10⁴或3×10³3 t3-psrγ或FasL-3T3细胞和孵化6 h在37°C。自发的发布是由孵化⁵¹Cr-labeled Con同一时期的爆炸成纤维细胞的缺失。特定的百分比杀死被确定为100×((成纤维细胞−自发的版本发布的数)/(最大释放−自发释放))。最大的释放是由冻融⁵¹Cr-labeled反对一个爆炸三次,确定浮在表面的放射性释放到文化。

交联的细胞激活T细胞导致程序性细胞死亡。这种形式的程序性细胞死亡称为propiocidal细胞凋亡和依赖于培养- 2的激活T细胞(28,29日)。Propiocidal凋亡至少部分依赖Fas激活T细胞上的表达(30.)。是否过去和我propiocidal凋亡中发挥任何作用,我们激活纯化CD4和CD8淋巴结T细胞从B6, B6 -lpr / lpr,B6-p55^−−/,B6-p75^−−/老鼠和一个2。Propiocidal凋亡的诱导是通过TCR交联。7-AAD试验(见材料和方法)是用于区分活和死细胞。结果在无花果。1,一个表明反对从B6和B6-p75 A-activated CD4 T细胞^−−/老鼠极易受到propiocidal细胞凋亡。正如所料,从B6 - CD4 T细胞激活lpr / lpr老鼠propiocidal相对耐药细胞凋亡(无花果。1,一个)。从B6和B6 - CD8 T细胞激活lpr / lpr老鼠类似于他们的CD4 T细胞propiocidal凋亡易感性和阻力,分别(无花果。1,B)。出乎意料,从B6-p75 CD8 T细胞激活^−−/老鼠propiocidal高度耐药细胞凋亡(无花果。1,B)。这些结果也表示为特定的百分比杀死(图。1,C),因为这种形式的数据表示提供了更多量化为不同群体之间的比较结果。我们还发现,类似B6小鼠细胞,激活从B6-p55 CD4和CD8 T细胞^−−/老鼠也极易受到propiocidal凋亡(图。1C)。因此,只有我^−−/,而不是过去^−−/具有抗药性突变propiocidal CD8 T细胞激活的细胞凋亡。

因为TCR-induced细胞死亡是介导Fas和FasL的相互作用在很大程度上,我们决定是否激活我的阻力^−−/CD8 T细胞TCR-induced Fas表达的细胞死亡可能是由于变更由这些细胞。结果在无花果。2表明Fas表达反对A-activated CD4和CD8 T细胞不受我的影响^−−/突变。同样,我的表达在反对A-activated CD4和CD8 T细胞不受影响lpr突变。荧光数据也表明,CD4和CD8 Con B6 -爆炸lpr / lpr和B6-p75^−−/老鼠没有表达检测水平的Fas和我,分别。

Propiocidal细胞凋亡也依赖FasL的感应激活T细胞由于细胞交联(31日,32,33,34,35)。因此,一个潜在的解释激活我的阻力^−−/CD8 T细胞对propiocidal凋亡是这些细胞不会调控FasL TCR交联。我是否激活^−−/CD8 T细胞可以调控FasL的TCR交联,反对A-activated CD8 T细胞从B6, B6 -lpr / lpr,B6-p75^−−/老鼠anti-CD3ε马伯6 h,刺激和FasL表达的诱导这些细胞被流式细胞术测定的数量。6小时孵化时间不足对于大多数细胞接受propiocidal细胞凋亡,并提供一个合适的时间点为评估FasL的表达。结果在无花果。3表明我^−−/CD8 T细胞能够调控FasL至少一样有效B6 CD8 T细胞后细胞的刺激。因此,我的阻力^−−/CD8 T细胞propiocidal细胞凋亡并不是由于这些细胞无法调控FasL后细胞的刺激。我们还指出,B6 -lpr / lprCD8 T细胞是最有效的表达FasL细胞刺激后,观察之前报道的其他调查人员(36)。

观察FasL感应不是我的缺陷^−−/CD8 T细胞提高的可能性,这些细胞抵抗细胞死亡由Fas和FasL交互。为了测试这种可能性,我们确定溶解的程度,是由孵化激活T细胞在FasL-expressing成纤维细胞系⁵¹Cr释放试验。FasL的表达水平和FasL父母的成纤维细胞系转染子图所示。4,一个。从这个图很明显,FasL表达只是检测转染子细胞系。图中的数据。4,B表明,CD4 Con B6和B6-p75爆炸^−−/老鼠FasL同样容易杀死⁺细胞系。正如所料,从B6 - CD4爆炸lpr / lpr小鼠抗FasL杀死⁺细胞系。相比之下,从B6-p75 CD8爆炸^−−/老鼠比CD8更耐从FasL B6小鼠造成的爆炸⁺细胞系(无花果。4C)。这一结果表明,从B6-p75 CD8爆炸的阻力^−−/老鼠propiocidal细胞凋亡最可能是由于细胞群的阻力Fas / FasL-mediated杀死。

先前的研究已经表明,TCR-induced细胞凋亡在激活T细胞介导的肿瘤坏死因子和杀害我由TNF介导的受体(7)。B6-p55的可用性^−−/和B6-p75^−−/老鼠可以让我们更直接地决定是否TNF-induced杀死CD4和CD8 Con爆炸是由过去和/或我受体。CD4和CD8 Con的敏感性的爆炸杀死肿瘤坏死因子是由培养这些爆炸与各种TNF浓度存在与否的低浓度(1μg /毫升)的蛋白质合成抑制剂放线菌酮。之前有研究表明,增加放线菌酮TNF的凋亡效应是必要的(37,38)。我们还发现在0.1和10 ng / ml, TNF本身不诱导细胞凋亡在CD4和CD8爆炸从这些小鼠三行(数据没有显示)。环己酰亚胺的存在、CD4和CD8诈骗从B6小鼠高度敏感的爆炸杀死肿瘤坏死因子(无花果。5)。在浓度测试,从过去CD4和CD8爆炸^−−/老鼠完全由TNF抗杀+环己酰亚胺(无花果。5)。虽然从我CD4和CD8爆炸^−−/老鼠被TNF +环己酰亚胺,容易造成肿瘤坏死因子的剂量反应曲线不同于从B6小鼠,观察相应的爆炸。最低的TNF浓度(0.1 ng / ml),之间没有差异容易杀死CD4和CD8爆炸B6或B6-p75^−−/老鼠。然而,在更高的TNF浓度(1和10 ng / ml), CD4和CD8爆炸从我^−−/老鼠比那些来自B6小鼠抗TNF +环己酰亚胺杀死。这些结果表明,表达我受体不足的TNF-mediated凋亡CD4和CD8爆炸。此外,没有我受体在这些爆炸使得他们更不容易杀死在高浓度的TNF。

结果在无花果。5表明我受体信号转导TNF-mediated死亡的能力在CD4和CD8 Con爆炸。其他的研究表明,最优所需的我受体胸腺细胞增殖和细胞毒性CD8 T细胞(39)。进一步定义的功能我在CD4和CD8 T细胞受体,我们确定是否需要我受体为最优的CD4和CD8 T细胞增殖反应反应细胞的刺激。这是通过净化CD4和CD8 T细胞的淋巴结B6和B6-p75^−−/老鼠和激活anti-TCR马伯+ 2和测量他们的增殖反应2天后。图中的数据。6表明,纯化的增殖反应从B6-p75 CD4和CD8 T细胞^−−/老鼠anti-TCR刺激约2倍不到从B6小鼠,观察相应的细胞。相比之下,CD4和CD8 T细胞的增殖反应B6-p55^−−/老鼠在回应刺激anti-TCR马伯+ - 2是类似于从B6小鼠CD4和CD8 T细胞(数据没有显示)。因此,我,但不是过去,受体需要优化增生性反应anti-TCR-stimulated CD4和CD8 T细胞。

细胞复苏后细胞培养在不同时期细胞受到刺激细胞增殖率和细胞死亡。因为我们已经观察到激活从B6-p75 CD8 T细胞^−−/小鼠抗TCR-induced细胞死亡,预计尽管anti-TCR-stimulated我^−−/最佳CD8 T细胞数量少于B6 CD8 T细胞,激活我的更高的阻力^−−/CD8 T细胞TCR-induced细胞死亡将带来生存获益,这可能是反映在更高的细胞复苏后文化的时间点。为了测试这种可能性,我们从B6和B6-p75 unpurified刺激脾细胞^−−/老鼠,它包含CD4和CD8 T细胞的混合物,anti-TCR马伯+ 2和CD4和CD8 T细胞的数量决定恢复后在不同时期文化开始。图中的数据。7显示相当类似的CD8 T细胞数量从anti-TCR-stimulated前3天文化。然而,在第四天,更多数量的CD8 T细胞是我的从文化中恢复过来^−−/细胞相对于B6文化。相比之下,更少的CD4 T细胞是来自我的恢复^−−/文化相对于B6文化,这种复苏明显降低细胞刺激后第三天。我的产量增加^−−/CD8细胞经过4天的文化也反映在培养细胞的CD4 / CD8比率。文化之前,脾细胞的CD4 / CD8比率从B6和我^−−/老鼠分别为0.58和0.50,分别。经过4天的文化、CD8和CD4比率为2.3 4.1 B6和我^−−/脾细胞。这些观察与我们的结论是一致的,没有我受体授予CD8的生存优势,但不是CD4 T细胞对TCR-induced细胞死亡。

在低浓度的环己酰亚胺,CD4和CD8 T细胞被激活TNF(无花果。5)。在我们的实验条件下,TNF-mediated杀死这些细胞是依赖于两个因素:1)过去受体的存在,和2)包含的放线菌酮杀死化验。郑et al。(7)曾报道称,杀害的CD8 T细胞激活TNF介导的我受体。作者的结论是部分基于过去的失败检测表达CD4和CD8 T细胞上受体激活。我们也无法检测到表达过去受体的激活CD4和CD8 T细胞,流式细胞仪分析(数据未显示)。然而,废除过去杀死肿瘤坏死因子+环己酰亚胺的激活^−−/CD4和CD8 T细胞(图5)表明,过去对这一过程至关重要。因此,过去必须被表达在这些细胞水平低于检测通过流式细胞仪分析。我们的数据也表明TNF无法引起死亡的激活通过我CD4和CD8 T细胞受体,因为激活过去^−−/CD4和CD8 T细胞表达相同级别的我激活细胞从B6小鼠(数据没有显示)和耐杀死这些细胞肿瘤坏死因子+环己酰亚胺(无花果。5)。实在et al。(6)也表明需要过去受体激活的删除CD8细胞毒性T细胞体内。我们发现我的作用是增强TNF-induced p55-mediated杀死在高浓度的肿瘤坏死因子(无花果。5)。TNF-induced的增大,TNFR1-mediated TNFR2也被观察到细胞死亡的维斯et al。(37)。以前的研究已经表明TNFR1可以调节凋亡和抗凋亡信号(15,40)。维斯et al。(37)提出增强TNF / TNFR1-mediated TNFR2可能是由于细胞死亡的凋亡蛋白的封存我受体复杂。我也可能增强TNF / TNFR1-mediated杀死CD4和CD8 T细胞类似的机制。

我们发现TCR-mediated CD8激活,但不是CD4 T细胞是大大减少了我在缺乏受体(图。1)。郑et al。(7)建议有两种效应机制与交联引起的细胞死亡的细胞激活T细胞。第一个是FasL的感应激活T细胞由于细胞交联,这可能导致Fas死亡通路的激活Fas-FasL互动的结果。第二个机制是细胞的刺激激活T细胞导致TNF的产生,引发了TNF-dependent死亡通路。郑et al。(7)提出Fas / FasL-mediated TCR-induced杀死的途径是充分的CD4 T细胞激活。他们还提出,Fas / FasL-mediated杀害CD8 T细胞激活是一个较小的途径,和TCR-induced细胞死亡的主要途径激活CD8 T细胞由p75-dependent TNF介导的通路。我们的数据与这些结论不一致的原因如下:1)激活CD8 T细胞受体缺乏过去不被TNF +环己酰亚胺(无花果。5);这项观察表明TNF-induced细胞死亡在通过过去受体CD8 T细胞激活操作。2)激活B6 CD8 T细胞,表达Fas,可以非常有效地死于FasL⁺成纤维细胞(图4)。这个观察表明,Fas / FasL-mediated死亡通路没有缺陷在激活CD8 T细胞。3)激活过去^−−/CD8 T细胞,表达相同级别的我受体激活B6 CD8 T细胞,并不是死于肿瘤坏死因子+环己酰亚胺(无花果。5),这表明TNF-dependent死亡信号不是通过我受体。

而不是调停TNF-induced细胞死亡,我们发现我受体需要高效的Fas / FasL-mediated杀害CD8 T细胞激活(无花果。4)。一起发现我增强TNF受体/ p55-mediated杀死,我们的数据更符合以下替代解释激活我的阻力^−−/CD8 T细胞TCR-induced细胞死亡:1)激活我^−−/CD8 T细胞是高度耐Fas / FasL-mediated杀害,和2)这些细胞的敏感性降低TNF / p55-mediated杀死。

的可能的解释是什么激活我的相对阻力^−−/Fas / FasL-mediated CD8 T细胞死亡通路?以前的研究已经表明Fas-mediated杀死细胞刺激的结果依赖于诱导FasL表达细胞刺激后(31日,32,33)。然而,我们发现,TCR-stimulated FasL感应不是有缺陷的我^−−/CD8 T细胞(图3)。成熟的T细胞已被证明表达高水平的Fas-associated死域IL-1-converting enzyme-inhibitory蛋白质(翻转),阻止死亡receptor-induced细胞死亡(41)。值得注意的是,T细胞抑制体外翻转时被激活,这下调与活化T细胞的敏感性Fas / FasL-mediated细胞死亡(42,43,44)。Retrovirus-mediated表达细胞翻转(c-FLIP)块Fas-induced激活T淋巴细胞凋亡,但并不影响细胞死亡所产生的细胞因子撤军(44)。还有待决定我是否受体复杂可能招募和隔离c-FLIP远离Fas受体以这种方式复杂,干扰Fas / FasL-mediated杀死。复杂也可以招募我受体细胞凋亡蛋白的抑制剂(c-IAPs) (45),这导致凋亡信号(46,47)。因此,另一个潜在机制的规定Ag-induced我受体通过细胞死亡的蛋白质的封存c-IAPs远离Fas受体等复杂。

有趣的是,Fas / FasL-mediated杀死CD4 T细胞激活不受我受体。一个潜在的解释我的独立CD4 T细胞受体的激活Fas-mediated杀死是抑制剂Fas-mediated杀死c-FLIP和/或c-IAPs等可能出现在激活我相对较低的水平^−−/CD4 T细胞,这些因素的封存Fas-mediated所需的复杂我受体可能不是杀死CD4 T细胞激活。这种可能性正在调查中。

的lpr表型是加速在过去^−−/lpr / lpr老鼠(48)。最近,这是表明TNF^−−/gld / gld老鼠那么严重得多gld表型(49)。的淋巴增殖性疾病lpr和gld老鼠是由于CD4的积累⁻CD8⁻αβTCR⁺B220⁺(双重否定)T细胞群在这些小鼠的外周淋巴器官(5)。可想而知,在过去^−−/lpr / lpr老鼠,缺乏信号通过过去,但是通过我受体信号仍然可以发生。我们推测,信号通过我受体可能促进双重否定细胞的扩散和加剧了lpr表现型。最优的要求我受体增生性反应最有可能是由于NF-κB-mediated信号通路的激活(23,24),它可以对抗TNF-mediated细胞凋亡(50,51,52)。相比之下,在肿瘤坏死因子^−−/gld / gld老鼠,信号通过我受体不能发生和增殖信号提供的我为这些细胞受体缺乏,这也许可以解释那么严重gld表现型。

的研究lpr和gld老鼠和我们目前的工作说明,Fas和肿瘤坏死因子信号通路密切相关。我们已经表明,信号通过TNFR1和Fas受体可以由TNFR2信号。描述之间的串音的性质不同的受体TNFR家庭无疑将导致小说的见解关于这些受体的多种功能的分子基础的多重表现相关的淋巴组织和自身免疫性疾病gld和lpr突变。

我们感谢爱德华·金的优秀的技术援助,尼克博士Crispe FasL-expressing成纤维细胞系的礼物。