摘要gydF4y2Ba
上皮细胞直接与环境中的细菌相互作用,并在气道防御微生物病原体中发挥关键作用。在本研究中,我们检测了呼吸道上皮细胞对非型感染的反应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.使用体外细胞培养模型,我们发现上皮细胞单层释放大量的IL-8,并表达增加水平的ICAM-1 mRNA和表面蛋白gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.相比之下,IL-1β、TNF-α和MHC I类的水平没有受到显著影响,这表明上皮基因的特定亚群优先激活,定向防御细菌。ICAM-1的诱导需要细菌直接与上皮细胞表面相互作用,纯化后不能重现gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Balipooligosaccharide。与此反应的功能作用一致,ICAM-1的诱导gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba介导中性粒细胞粘附上皮细胞表面增加。此外,在体内气道感染的小鼠模型gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,上皮细胞ICAM-1表达的增加与气道趋化因子水平和中性粒细胞募集的增加一致。这些结果表明,ICAM-1在人呼吸道上皮细胞上的表达是由上皮细胞与ICAM-1相互作用引起的gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba并提示依赖于icam -1的机制可以介导中性粒细胞粘附在这些细胞上,而不依赖于其他细胞类型释放的炎症介质。细菌感染直接诱导特定上皮细胞基因(如ICAM-1和IL-8)可能允许气道内快速有效的先天防御。gydF4y2Ba
呼吸系统中的上皮细胞在攻击上皮屏障时不是被动的旁观者,而是积极参与炎症反应以保护气道(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).由于上皮细胞位于与外部环境接触的部位,它们往往是第一个与潜在的微生物病原体相互作用的细胞。事实上,细菌粘附在上皮细胞上可能是定植和感染的先决条件(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba),通过这种相互作用,上皮细胞可能有机会检测和响应病原体,而不依赖于呼吸系统中其他细胞类型的信号。上皮细胞直接检测微生物病原体并立即启动定向防御的基因表达的能力可能允许更有效地激活炎症反应。虽然一些参与气道防御的分子已经被确定,但在上皮表面导致快速有效炎症反应的因子的激活和协调才刚刚开始被阐明。gydF4y2Ba
上皮细胞参与气道防御的一个机制是通过协调白细胞流入和通过表面粘附蛋白的表达和趋化分子的分泌激活。在炎症刺激下黏附糖蛋白ICAM-1细胞表面表达的增加是上皮细胞促进白细胞募集的一个重要例子(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).ICAM-1与CD18/β的相互作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba白细胞上的整合素反受体是气道上皮细胞对白细胞粘附和激活的重要机制(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).上皮细胞协调气道中白细胞流入的能力的第二个例子是CXC趋化因子IL-8的分泌,它通过其趋化剂和激活特性将中性粒细胞靶向到攻击部位(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).虽然已经描述了气道上皮细胞表达、细胞粘附分子和介质分子分泌对炎症细胞因子和病毒反应的途径(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),上皮细胞在气道对细菌感染的反应中所起的作用还不太成熟。然而,绒毛素介导的粘附gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba已显示可刺激气道上皮细胞产生IL-8 (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),为呼吸系统中的上皮细胞在直接检测到细菌刺激后启动白细胞募集的可能性提供了先例。基于人类肺部暴露于许多不同细菌物种的事实,多种检测机制可能已经进化到允许上皮细胞对各种潜在致病性微生物做出有效反应,这似乎是合乎逻辑的。gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2Ba是一种多形性革兰氏阴性杆菌,经常在人的呼吸道黏膜上定植,并经常引起局部呼吸道疾病(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).封装的分离株gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba根据六种抗原性不同的多糖胶囊(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).隔离的gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba不能与已知囊结构的分型抗血清凝集的被指定为非分型。虽然血清型b株占大多数病例的菌血症和全身性疾病,由于gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,由于最近广泛使用针对血清型b胶囊的疫苗,这种血清型感染正变得不那么常见(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).我们专注于非类型菌株,因为这些微生物是由细菌引起的大多数疾病的原因gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba局限于呼吸道的疾病,包括中耳炎、鼻窦炎、支气管炎和肺炎(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维化患者特别容易感染非型gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba).直接接触gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba气道上皮细胞在气道感染时已被证实,上皮细胞的附着是由特定的细菌表面分子介导的(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).虽然上皮细胞的这些细菌粘附蛋白受体已经比较难以识别,但利用上皮细胞上的表面分子来检测和响应感染gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba似乎是可能的。因此,我们推测肺上皮细胞可能具有检测感染的能力gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba然后通过激活特定的气道防御基因如ICAM-1和IL-8做出反应。gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们检查了气道上皮的反应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba利用体外上皮细胞-细菌相互作用系统和体内小鼠感染模型。我们的结果表明gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba与气道上皮细胞的相互作用迅速诱导IL-8的产生、ICAM-1的表达和ICAM-1依赖的中性粒细胞粘附。Lipooligosaccharide(洛杉矶)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba释放gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba不足以直接诱导上皮细胞ICAM-1;相反,出现在细菌细胞表面的其他分子是这种上皮细胞反应所必需的。在小鼠气道感染模型中,上皮细胞ICAM-1表达与趋化因子水平升高和中性粒细胞募集一致gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba这表明这种反应与呼吸道防御细菌的生理相关性。直接诱导特定的上皮基因(如ICAM-1和IL-8)可能允许快速靶向和激活中性粒细胞的部位gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染,导致气道内有效的先天防御。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
细菌制备和定量gydF4y2Ba
使用了以下细菌:不可分类的gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba应变12;一个缺乏高m.w. (HMW) 1和2黏着素表达的突变株12 (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba);nontypablegydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba应变N187;HMW1、HMW2和HMW2表达缺失的突变株N187gydF4y2Ba嗜血杆菌gydF4y2Ba粘附及渗透蛋白(Hap)黏着素(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba);nontypablegydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba应变11;菌株11突变体缺乏表达gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba黏附素(Hia) (gydF4y2Ba21gydF4y2Ba);gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba血清型Eagan菌株;一个缺乏胶囊表达的Eagan突变体(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba);gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba菌株PAK和PA01(华盛顿大学S. Lory赠送)(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba);gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaHB101和DH5α染色(Life Technologies, Gaithersburg, MD);临床分离株gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(CDC1, 97 - 033191;CDC2, 97 - 033192;疾病控制和预防中心,亚特兰大,佐治亚州);临床分离物gydF4y2Ba链球菌引起的肺炎gydF4y2Ba(圣路易斯儿童医院);而且gydF4y2Ba百日咳博德特氏菌gydF4y2BaTohama I株(毒性阶段)和Tohama III株(等基因无毒阶段)(华盛顿大学W. Goldman赠送)(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在添加1% Isovitalex的巧克力血琼脂上生长(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)或加入血素及NAD的脑-心灌注汤(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba).gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在Luria-Bertani (LB)琼脂或LB肉汤中培养。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba用5%羊血(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)或2号营养肉汤(Oxoid, London, U.K.)培养胰蛋白酶大豆琼脂。gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba用5%羊血或Todd-Hewitt肉汤(Difco, Detroit, MI)培养胰蛋白酶大豆琼脂。gydF4y2Bab .百日咳gydF4y2Ba在琼脂或含有改良Stainer-Scholte培养基的肉汤中生长,并添加如上所述的补充剂(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).为了制备曝气的对数相细菌,将新鲜培养皿中的菌落接种到3-20毫升的肉汤中,在37°C下用旋转震动培养,直到浊度估计(ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba= 0.6 ~ 0.7) ~ 1 ~ 3 × 10gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU/ml (1.5-2 h)。通过将肉汤培养物、培养基、上皮细胞或均质肺或琼脂颗粒连续稀释后,在适合每种生物的固体琼脂培养基上进行细菌定量。LOS(来自爱荷华大学M. Apicella的礼物)从非类型化中提纯gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba苯酚/氯仿/石油醚法测定菌株2019 (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba).二磷酰脂质A(来自N. Qureshi,威斯康星大学的礼物)是从gydF4y2BaRhodobacter sphaeroidesgydF4y2Ba如前所述(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
上皮细胞培养与感染gydF4y2Ba
A549呼吸道上皮细胞系(American Type Culture Collection CCL-185;弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas, VA)在RPMI 1640培养基中培养,培养基中添加10%热灭活(56°C 1 h) FBS, 2 mMgydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺,100u /ml青霉素,100 μg/ml链霉素,0.25 μg/ml两性霉素B. BEAS-2B正常气道上皮细胞株(美国国立癌症研究所J. Lechner赠送)(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)在LHC-8e培养基中培养(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba)装于上文所述涂有胶原蛋白/白蛋白的烧瓶内(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba).HUVEC (Clonetics, San Diego, CA)在添加了内皮细胞的基础培养基中保持,在有明胶涂层的flask中直到前文所述的第10代(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).囊性纤维化气道上皮细胞株IB3-1(基因型ΔF508/W1282X)和匹配的获救细胞株C38(来自P. Zeitlin, Johns Hopkins University) (gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)用LHC-8培养基培养(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba),添加5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.2 mg/ml亚胺培南(Merck, West Point, PA)、80 μg/ml妥布霉素(Eli Lilly, Indianapolis, IN)和2.5 μg/ml两性霉素B,装入胶原蛋白/白蛋白包被烧瓶中。细胞在37°C, 5% CO中培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并在相同的培养基中与细菌一起孵育,除非有特殊情况。我们发现接种量≥200 CFU/上皮细胞(10gydF4y2Ba7gydF4y2BaCFU/ml培养基)导致最大的ICAM-1诱导,与细菌生长达到固定阶段水平的最低需求相关(10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU/ml培养基)。gydF4y2Ba
酶联免疫测定gydF4y2Ba
如前所述,用酶联免疫吸附法测定24孔或96孔组织培养板上上皮细胞和内皮细胞汇合处表面的蛋白质水平(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),并稍加修改。在一些实验中,利用0.1 μm孔径的聚碳酸酯膜Transwell培养系统(cornning - costar, Acton, MA)将上皮细胞从细菌中分离出来,上皮细胞在下层培养,细菌在上层培养。与细菌孵育后,上皮细胞单层在含有0.5% BSA、1 mM CaCl的PBS缓冲液中洗涤gydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 1mm MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba然后在1%多聚甲醛PBS中25℃固定15分钟。细胞单层被彻底清洗,非特异性Ags在37°C下暴露于阻塞溶液(洗涤缓冲液中含3% BSA) 90分钟后被阻塞。然后将细胞暴露于1 μg/ml抗人ICAM-1的鼠单抗84H10 (Immunotech, Westbrook, ME)、抗人HLA-A,B,C/MHC类I的鼠单抗B9.12.1 (Immunotech)或对照鼠单抗在37°C下1小时。采用在ab -滴定曲线上反应最大的单克隆抗体浓度。用0.04 μg/ml F(ab’)孵育,检测单抗初次结合。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba片段特异性,山羊抗小鼠IgG结合HRP (Pierce, Rockford, IL)在阻断溶液中,然后是3,3 ',5,5 ' -四甲基联苯胺+ HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba衬底(皮尔斯)。通过加入等体积的2 M H,显色反应在15 min后停止gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba
RNA印迹分析gydF4y2Ba
在细菌感染后,通过异硫氰酸胍裂解从上皮细胞单层中分离出细胞总RNA,然后通过氯化铯离心或柱状分离试剂盒(Qiagen, Santa Clarita, CA),并进行RNA印迹分析,如前所述(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba).探针用[α-标记gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] dtp (>3000 Ci/mmol);Amersham International, Little Chalfont, uk),包括:1)1.4 kbgydF4y2BaXhogydF4y2BapCDM8中含有人类ICAM-1 cDNA的pCD1.8片段(来自华盛顿大学M. Dustin和哈佛大学D. Staunton的礼物)(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba);2) 0.55 kbgydF4y2BaXbagydF4y2Ba我- - - - - -gydF4y2Ba欣gydF4y2BapBR322 (American Type Culture Collection)中含人GAPDH cDNA的pHcGAP dIII片段。gydF4y2Ba
细菌粘附试验gydF4y2Ba
在24孔组织培养板的合流处,细菌对上皮细胞的粘附使用先前描述的测定方法进行量化(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba).简单地说,将细菌接种到无抗生素培养基中的上皮细胞单层上,并在165 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,便于细菌与上皮细胞接触。在37℃5% CO中孵育gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在30分钟内,用PBS冲洗单层膜5次以去除非粘附生物,然后用0.05%胰蛋白酶+ 0.5% EDTA在PBS中释放。搅拌孔内容物,并在巧克力血琼脂上连续稀释以进行细菌定量。gydF4y2Ba
中性粒细胞粘附试验gydF4y2Ba
在96孔组织培养板上,中性粒细胞粘附于上皮细胞合流处,使用一种改进于先前描述的检测方法(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).通过多态性oprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)一步梯度分离健康献血者全血中的中性粒细胞,然后进行两个周期的低渗裂解以去除污染的红细胞。细胞悬液(>95%中性粒细胞)用1 μg/ml钙钙素AM荧光标记(Molecular Probes, Eugene, OR)在含0.1% BSA的CMF (calcium- and - mg -free, CMF) HBSS中标记30分钟,25°C。离心收集标记的中性粒细胞,计数,在含有100 U/ml TNF-α(来自Genentech, South San francisco, CA)的CMF-HBSS + BSA中孵育15分钟,在37℃下激活粘附蛋白,并在CMF-HBSS + BSA中重悬。上皮细胞单层冲洗彻底,3 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba中性粒细胞加入100 μl HBSS +含钙、镁的BSA。在部分组织培养孔中加入30 μg/ml阻断鼠单抗R15.7抗人β预处理的中性粒细胞gydF4y2Ba2gydF4y2Ba整合素/CD18(来自R. Rothlein, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ridgefield, CT) (gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)或对照鼠单抗在37°C下30分钟。在其他孔中,用50 μg/ml的小鼠单抗R6.5的阻断F(ab)预处理细胞单层,以对抗人ICAM-1 (R. Rothlein赠送)(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)或对照鼠单抗F(ab)在37°C孵卵30分钟。使用最大限度抑制中性粒细胞粘附的Ab浓度(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),并且在随后的粘附期间没有去除腹肌。在37°C下,允许中性粒细胞粘附15分钟。加入孔的所有中性粒细胞荧光定量使用荧光微板阅读器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)设置为λgydF4y2Ba前女友gydF4y2Ba= 485 nm和λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2Ba= 538 nm。然后用HBSS + BSA填充每个孔并在200 ×下离心倒置板2min以去除不粘附的中性粒细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba.重复这一步骤,加入100 μl HBSS + BSA,用酶标仪检测每孔中粘附在单层上的中性粒细胞的荧光。从未添加中性粒细胞的井中测定背景荧光,并从实验井中获得的值中减去该背景值。使用公式(粘附荧光/总荧光)× (3 × 10)将荧光测量值转换为粘附中性粒细胞数/孔gydF4y2Ba5gydF4y2Ba中性粒细胞)。初步实验证实了两者之间的高度相关性(gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.99)的中性粒细胞测量值与手工细胞计数得到的值(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
小鼠肺部感染模型gydF4y2Ba
NontypablegydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba菌种12采用改良的技术被纳入琼脂颗粒中(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba).细菌从20毫升充气的对数相培养物中通过离心(10,000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba, 4°C, 10分钟),在2× 10浓度的感染缓冲液(1× = 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM磷酸钠,pH 7.4, 10 mM葡萄糖,2% casamino acids)中重悬gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU /毫升。将细菌悬浮液加热至45°C,在45°C下将3ml与3ml熔融的4% Noble琼脂(Difco)混合。将细菌-琼脂混合物吸入注射器,立即用23g针头将3ml注射到27 ml在4℃下快速搅拌的1×感染缓冲液中。这就产生了含有细菌~ 10的悬浮液gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU/ml加入30 ~ 200 μm的无定形琼脂颗粒中。将四周大的C57BL/6小鼠(Taconic, Germantown, NY)置于无病原体条件下,用87 mg/kg盐酸氯胺酮和13 mg/kg盐酸甲苯嗪静脉注射麻醉。然后将小鼠置于插管器(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),用22号静脉导管经气管插管。将30 μl体积的PBS、对照琼脂颗粒或37℃的细菌-琼脂颗粒悬浮液(随后注入100 μl空气)注入气道,让小鼠恢复。gydF4y2Ba
肺部感染定量和免疫组化gydF4y2Ba
感染一段时间后,小鼠被麻醉,然后颈椎脱位安乐死,暴露肺部,经右心室用无菌生理盐水冲洗肺血管系统。对于小鼠趋化因子定量,将右肺的膈叶从根部结扎,取出并保存在−80°C。在所有时间点采集肺组织后,使用玻璃组织研磨机(Kontes glass, Vineland, NJ)将0.5 ml 50 mM磷酸钠均质,pH值为6.0,含0.5%十六烷基三甲基溴化铵,然后使用声波分解器(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)将超声设置为30%。样品经15,000 ×离心清除gydF4y2BaggydF4y2BadgydF4y2Ba-柠檬烯基清除液(Stephens Scientific, Riverdale, NJ),并在分级乙醇溶液中再水化。用苏木精和伊红染色的连续切片评估琼脂颗粒附近的炎症细胞流入。对于肺切片的ICAM-1免疫染色,用5%双氧水处理5分钟可阻断内源性过氧化物酶活性,在25°C下暴露于阻断溶液(3%非免疫山羊血清在PBS中)30分钟可阻断非特异性Ags。然后用2 μg/ml抗小鼠ICAM-1 (PharMingen, San Diego, CA)的仓鼠单抗3E2或同型匹配的对照仓鼠单抗在4℃下孵育载片18小时。用7.5 μg/ml生物素化的山羊抗仓鼠IgG Ab (Vector Laboratories, Burlingame, CA)在阻断液中孵育,然后用链霉亲和素偶联的HRP和3,3 ' -二氨基联苯胺+ H检测初步Ab结合gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba基质(矢量实验室)。组织切片用苏木精反染色,在分级乙醇中脱水,并安装镜检(型号D-7082;卡尔蔡司,Thornwood,纽约州)。使用计算机化的数码相机系统(SPOT-2;诊断仪器,斯特林高地,MI)界面Photoshop 5.0软件(Adobe系统,圣何塞,CA)。gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba在O压力下,用10%缓冲福尔马林固定18小时gydF4y2Ba统计分析gydF4y2Ba
中性粒细胞和细菌粘附试验和酶联免疫试验进行了2 - 4次,以确保结果的可重复性,并使用单因素方差分析(one-way ANOVA)对具有代表性的实验值进行分析,以确定统计学意义。单因素方差分析的多重比较显著性水平为0.05。如果通过单向分析获得显著性,则使用Scheffe进行均值的方差分析后比较gydF4y2BaFgydF4y2Ba测试(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱导呼吸道上皮细胞表达ICAM-1gydF4y2Ba
使用基于特异性抗ICAM-1单抗的酶联免疫分析法检测体外培养的人呼吸道上皮细胞单层表面的ICAM-1蛋白水平(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).这些实验表明,A549呼吸道上皮细胞的ICAM-1表达较低,与非分型孵育24 h后,ICAM-1水平显著升高gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba应变12(图1 .gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).BEAS-2B人支气管上皮细胞的培养gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba菌株12也导致ICAM-1表达显著增加。BEAS-2B细胞诱导的相对程度较低,反映了这些细胞上相对较高的ICAM-1组成水平,而在体内气管和支气管上皮细胞上观察到的ICAM-1表达水平较低(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba).我们还测试了IB3-1和C38气道上皮细胞,发现这些细胞系对其有反应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba通过诱导细胞表面ICAM-1达到与BEAS-2B细胞相似的水平(结果未显示)。通过研究接种量与ICAM-1诱导之间的关系,发现接种量越低,在早期诱导的ICAM-1越少。接种量大小的影响在12 h后不太明显,可能反映了达到固定阶段和细菌浓度为10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba9gydF4y2Ba此时CFU/ml,与初始接种量无关(A.G.F.和D.C.L,未发表观察)。gydF4y2Ba
为了检验免疫法检测到的ICAM-1表面蛋白的增加是否伴随ICAM-1 mRNA的增加,对上皮细胞总RNA进行RNA印迹分析。在A549细胞实验中,ICAM-1 mRNA水平也上调gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染后,mRNA表达量在8小时达到峰值,随后逐渐下降(图1gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).综上所述,这些结果表明gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba具有通过控制mRNA水平直接激活上皮细胞ICAM-1表达的能力,类似于某些细胞因子对该基因的调控(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
铜绿假单胞菌gydF4y2Ba还可诱导呼吸道上皮细胞表达ICAM-1gydF4y2Ba
为了确定ICAM-1的诱导是否是呼吸道上皮细胞对细菌感染的一致反应,我们检查了上皮细胞对其他几种呼吸道病原体的反应。在进行这些实验时,我们用A549细胞单层培养细菌,然后验证每个菌株的密度至少为10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU/ml(结果未显示)。与上皮细胞孵育24小时后,gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Bab型菌株Eagan诱导细胞表面ICAM-1表达量与非型菌株相似gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba应变12(图2 .gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).相比之下,分离的gydF4y2Ba肺炎链球菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Bab .百日咳gydF4y2Ba不能刺激ICAM-1表达。实验gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba感染12小时后单分子膜出现明显的细胞毒性作用,可能是由于外毒素或蛋白酶的释放。为了解决这一问题,我们在单层细菌感染8小时后(即ICAM-1 mRNA表达峰值的时间点)进行RNA印迹分析gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染)。在这些条件下,感染gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba诱导上皮细胞ICAM-1 mRNA水平略高于对照组gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,而gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba影响最小(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).虽然我们不能排除所使用的培养系统不同地影响这些细菌种类的表型或生长的可能性,或者所测试的分离物缺乏这种效果所需的适当毒力因子,但我们的结果表明,在人类肺部感染中重要的选定细菌种类具有诱导呼吸道上皮细胞ICAM-1表达的能力。gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2Ba也诱导呼吸上皮细胞分泌IL-8gydF4y2Ba
最近的研究研究了gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba和呼吸道上皮细胞提示上皮细胞可能通过释放细胞因子如IL-8 (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba).检查…的效果gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba我们进行了MHC I类的上皮细胞表达和IL-1β、IL-8和TNF-α的释放的酶联免疫测定。使用A549细胞,我们观察到MHC I类表面表达和IL-1β和TNF-α分泌的影响很小(结果未显示)。与此相反,与H292肺上皮细胞(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),感染gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba导致高水平的IL-8释放(图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).IL-8诱导的时间过程与ICAM-1相对快速的表达相似gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(图3gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba),提示优先激活一个特定的上皮细胞基因亚群,旨在早期防御细菌。由于IL-8和ICAM-1对中性粒细胞的协同作用,这种上皮细胞基因亚群可能在介导气道中性粒细胞募集和激活以应对细菌方面特别重要。gydF4y2Ba
呼吸道上皮细胞与表面的一种构成分子相互作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱发ICAM-1gydF4y2Ba
来进一步定义交互的性质gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba我们进行了一组实验,在这些实验中,我们调整了培养条件,以影响相互作用的特定特征(例如,细菌活力,细菌-上皮细胞的直接接触)。在这些实验中,有足够的不可分型接种剂gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba菌株12(≥10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU/ml)添加到上皮细胞中,以确保治疗效果不仅仅是由于抑制细菌生长。我们发现治疗gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba以足够的抑菌浓度氯霉素选择性抑制细菌蛋白质合成(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)和杀害gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba使用杀菌剂量的庆大霉素对细菌诱导上皮细胞ICAM-1的能力没有显著影响(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),表明ICAM-1的诱导是由构成性细菌因子介导的。然而,无菌滤液从一个可行的培养gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba与固定阶段感染添加的体积相当的剂量对上皮细胞ICAM-1水平的影响最小,这表明相关的细菌因子不会从生物体中释放或不会通过0.2 μm孔径的聚醚砜过滤器。为了支持这一结论,直接的相互作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba用0.1 μm孔径的聚碳酸酯膜单层分离(在培养液中孵育期间)与上皮细胞的相互作用进行比较。尽管事实上细菌的密度是相似的gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba与直接接触上皮细胞培养相比,在过滤器上方培养(>10gydF4y2Ba9gydF4y2BaCFU/ml),通过半透膜从上皮细胞中分离细菌几乎完全消除了ICAM-1和IL-8的诱导(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
为了消除可能在上皮细胞上诱导ICAM-1表达的可溶性细菌因子的新合成和构成存在,我们进行了预处理gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba用杀菌浓度的庆大霉素或多聚甲醛,然后广泛清洗细菌。gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在处理≥10之前,使用与接种菌相对应的细菌,杀死和清洗后的细胞保持诱导上皮细胞ICAM-1的能力gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU/mlgydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba).用庆大霉素处理后清洗的细菌诱导的上皮细胞ICAM-1水平与未处理或用庆大霉素处理但未清洗的接种体相似。gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba用多聚甲醛处理,然后清洗,导致了较低水平的ICAM-1,这可能反映了这种处理引起的细菌表面Ags的改变,或者我们在清洗时观察到的细菌的轻度损失(结果未显示)。这些发现表明gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2BaICAM-1的诱导是由细菌表面不释放的因子介导的,这表明细菌-上皮细胞接触是ICAM-1诱导所必需的。在我们的实验中,从细菌中释放出的可溶性因子的物理特性(例如,倾向于粘附在膜上或形成大的聚集体)似乎不太可能通过分离膜。有趣的是,用地塞米松处理上皮细胞导致部分抑制ICAM-1诱导gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(图4gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),表明由细菌激活的上皮信号通路受到皮质类固醇的影响。gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2BaLOS不诱导呼吸道上皮细胞表达ICAM-1gydF4y2Ba
脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的组成部分,但在这些细菌的生长和死亡过程中也会释放(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba).与肠道革兰氏阴性细菌不同,gydF4y2Ba嗜血杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba博代氏杆菌属gydF4y2Ba,gydF4y2Ba莫拉克斯氏菌属gydF4y2Ba,gydF4y2Ba奈瑟氏菌属gydF4y2Ba种合成一种含有与脂质a相连的低聚糖而不重复亚基O-Ag多糖链的LPS(称为低脂糖或LOS) (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba).gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2BaLOS是高度疏水的,它的生化特性可能会限制通过我们测试的膜的渗透性。因此,要直接评价的作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在上皮细胞活化的LOS中,我们从非类型中测试了高度纯化的LOSgydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和使用二磷酰脂A从gydF4y2BaRhodobacter sphaeroidesgydF4y2Ba(RsDPLA),其功能是竞争性LPS拮抗剂(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba).利用LPS-responsive HUVEC模型验证了这些制剂的生物活性gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2BaLOS引起HUVEC上ICAM-1的诱导,而这在RsDPLA浓度≥10倍时是被抑制的(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).然而,活细胞和庆大霉素处理的A549细胞诱导ICAM-1gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba没有被RsDPLA抑制(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).由于RsDPLA在高浓度时具有部分激动剂活性,因此不具有阻断高水平LPS的能力(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),我们进行了纯化测试gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在浓度(1-100 μg/ml)下,A549细胞上的LOS先前被证明是由细菌(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba).我们发现,尽管这种LOS制剂对HUVEC具有高水平的诱导作用,但对A549细胞没有诱导ICAM-1(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba).虽然这些结果并不排除高水平的LOS是必要的可能性gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱导上皮细胞ICAM-1表达,他们认为LOS是不够的,另一种成分gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba是这种效果所必需的。gydF4y2Ba
已知细菌黏着素的作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱导上皮细胞ICAM-1表达gydF4y2Ba
许多促进上皮细胞粘附的蛋白质已在非型和b型菌株的表面被鉴定gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,而这些黏着素的表达因分离物而异(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).大约75%的非分型菌株表达高分子量粘连蛋白,即HMW1和HMW2 (gydF4y2Ba45gydF4y2Ba).其余的大多数非型菌株和几乎所有的b型菌株表达一种称为Hia的粘连蛋白或一种称为Hsf的同源蛋白(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba).在非分型菌株中,表达HMW1/ hmw2样蛋白的菌株普遍缺乏Hia同源物(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba).另一个gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba黏连蛋白是Hap丝氨酸蛋白酶(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),它存在于表达HMW1和HMW2的菌株中,也可能存在于其他菌株中。此外,所选分离株表达血凝菌毛(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
来检查这些已知的每一个潜在的作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba粘附素诱导上皮细胞ICAM-1表达,我们测定了A549细胞与一系列野生型培养的ICAM-1水平gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba菌株或等基因粘连蛋白缺失突变体。在这些实验中,三种野生型非分型菌株(菌株12、N187和11)缺乏与菌毛生物发生有关的基因,诱导了相似水平的ICAM-1表达(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).将菌株12与缺乏HMW1和HMW2的等基因突变体进行比较,发现其对A549细胞的粘附性有显著差异,但诱导ICAM-1表达的能力无差异(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BaBgydF4y2Ba).同样,将菌株N187与一个缺乏HMW蛋白和Hap的等基因突变体进行比较,发现突变株的粘附性降低,但诱导A549细胞表达ICAM-1的能力相当。菌株11和缺乏Hia表达的菌株11突变株表现出类似水平的粘附A549细胞(提示这些细胞上缺乏Hia受体),并诱导类似水平的ICAM-1。我们还检查了b型胶囊对gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba粘附A549细胞和诱导ICAM-1表达。值得注意的是,这种细菌胶囊已知会干扰某些粘附机制的功能,但不会干扰其他机制(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba).我们发现包封的菌株Eagan表现出对A549细胞最低限度的稳定粘附(图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).然而,该菌株仍能有效诱导上皮细胞ICAM-1的表达(图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).综合考虑,这些结果表明gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba上皮细胞ICAM-1的诱导不依赖于HMW1、HMW2、Hia和Hap粘连素,这些粘连素促进了高亲和力的细菌粘附。此外,诱导是独立于piliation,这似乎与低亲和粘附有关(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba).ICAM-1的表达可能是由其他细菌表面分子介导的,这些分子参与了与上皮细胞的低亲和力、不稳定的相互作用。gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱导icam -1依赖性中性粒细胞粘附于呼吸道上皮细胞gydF4y2Ba
目的:观察细胞间粘附分子1 (ICAM-1)对呼吸道上皮细胞的作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在A549细胞孵育前后,观察中性粒细胞对A549细胞的粘附gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.A549细胞感染24 hgydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba使用体外检测系统,菌株12导致上皮细胞-中性粒细胞粘附增强(图7gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).将特异性阻断单抗添加到检测中,以确定上皮细胞ICAM-1及其白细胞反受体(β的成员)的贡献gydF4y2Ba2gydF4y2Ba整合素(CD18)家族。我们发现上皮细胞感染后上皮-中性粒细胞粘附增加gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba几乎完全被抗icam -1或抗cd18单克隆抗体所抑制。与抗icam -1单抗相比,我们观察到抗cd18更有效的阻断与其他报道一致(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),可能反映了其他上皮细胞表面分子与白细胞CD18受体之间的相互作用。功能ICAM-1的表达响应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染证实,这种机制可能有助于中性粒细胞在气道中的募集或激活。gydF4y2Ba
流感嗜血杆菌gydF4y2Ba在体内诱导白细胞募集和ICAM-1表达gydF4y2Ba
观察体内上皮细胞对gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba,我们修改了细菌气道感染的小鼠模型,已用于检查肺部对呼吸道病原体的反应,包括gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba).在这个模型中,小气道内的琼脂颗粒夹闭损害了细菌从肺部的清除,导致感染和白细胞在气道内的募集。因为尚未发现人类IL-8的鼠类结构同源物(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),我们测定了KC和MIP-2的水平,它们是IL-8的功能性CXC趋化因子同源物,因为它们具有诱导中性粒细胞趋化的能力(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba).与其他肺部感染模式相似(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba),在感染的小鼠肺部检测到高水平的这些趋化因子gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba24小时(图8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).感染72 h后KC和MIP-2水平较感染24 h时降低。这些趋化因子的表达可能解释了肺部细菌感染过程中早期选择性中性粒细胞募集的原因。gydF4y2Ba
我们还检测了ICAM-1的上皮细胞表达gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba呼吸道感染。值得注意的是,在对照组进行气管内注射的小鼠肺部没有培养出细菌,而注射含有gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba72小时内肺部细菌负担增加(图9gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).这些小鼠的肺免疫组化分析显示,在注射无细菌的PBS或琼脂颗粒24小时后,气道上皮细胞中白细胞和ICAM-1很少。ICAM-1在I型肺泡上皮细胞上的高水平本构表达作为每个样本中ICAM-1染色的阳性对照(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba).在感染4小时的小鼠气道中也有少量白细胞内流和ICAM-1表达gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.然而,在感染24小时的小鼠样本中,我们观察到位于琼脂颗粒附近的白细胞(特别是中性粒细胞)数量大幅增加,气道上皮细胞ICAM-1染色增加。因此,感染后气道上皮细胞ICAM-1表达gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba与我们的体外研究相关的模式是随时间变化的。感染72小时后,小鼠气道白细胞数量持续增加,但此时气道ICAM-1染色较24小时时有所下降。感染期间白细胞主要定位在气道腔内,这与ICAM-1的上皮细胞表达是气道中白细胞募集和/或激活的组成部分的概念一致。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
白细胞进入和通过上皮组织是气道防御功能的一个重要特征。然而,关于白细胞在上皮细胞间的迁移和对细菌感染反应的激活机制知之甚少。本报告表明上皮细胞与gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba结果诱导特异性上皮细胞基因,可协助气道防御。诱导ICAM-1对上皮细胞的作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba可能有助于白细胞通过上皮细胞迁移到气道和/或激活白细胞抗菌机制,以帮助清除感染。可溶性介质(如IL-8)也参与了这一过程,通过将特定的白细胞亚群(如中性粒细胞)直接靶向感染区域(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).在感染反应中,中性粒细胞招募进入气道可能受到可溶性或细胞表面介质梯度的指导,以及在化学引诱剂的作用下,中性粒细胞偏好从气道上皮细胞的基面迁移到根尖面(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba).虽然参与这一过程的许多介质和因素之间复杂的相互作用才刚刚开始被理解,但目前的发现提供了进一步的证据,证明肺中的上皮细胞在肺防御微生物病原体中发挥积极作用。gydF4y2Ba
利用四种呼吸道上皮细胞系,我们观察到感染gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba直接刺激ICAM-1表达,提示该机制可能与细胞因子依赖性表达协同作用,并可能推广到气道上皮细胞在体内的行为。鉴于未受刺激的II型肺泡、气管和支气管上皮细胞在体内通常表达低水平的ICAM-1 (gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba),我们使用A549上皮细胞系进行了许多实验,该细胞系也显示出低水平的构成性ICAM-1,使我们能够最大限度地检测对细菌反应的表达增加。有趣的是,非呼吸道上皮细胞在微生物感染反应中也有直接诱导ICAM-1表达和细胞因子分泌的报道,尽管反应的机制和细胞因子谱并不总是相同的。这些例子包括:1)感染后人黏膜上皮细胞IL-8、GM-CSF、TNF-α和ICAM-1增加gydF4y2Ba淋病奈瑟氏菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba);2)感染后人尿上皮细胞IL-6、IL-8和ICAM-1升高gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba60gydF4y2Ba);3)几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌侵袭人肠上皮细胞后,IL-8、TNF-α、GM-CSF、单核细胞趋化蛋白-1和ICAM-1升高(gydF4y2Ba61gydF4y2Ba,gydF4y2Ba62gydF4y2Ba).因此,我们观察呼吸道上皮细胞分泌IL-8和ICAM-1表达的反应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染与宿主上皮细胞与潜在致病生物相互作用的概念非常吻合,当感染发生时,宿主上皮细胞已经进化出激活防御反应的机制。细菌诱导宿主细胞介质通常是快速的,这表明这些机制允许早期动员炎症细胞在感染部位保护宿主。gydF4y2Ba
哺乳动物细胞对细菌的反应通常是通过检测特定的细菌产物,如脂多糖、菌毛或肽聚糖(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64gydF4y2Ba).上皮细胞防御基因对细菌反应的激活决定因素取决于细菌刺激的物理特性,包括因子是否构成性产生、在细胞表面表达和/或由细菌释放。我们的研究结果表明后上皮细胞ICAM-1表达增加gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba感染需要上皮细胞直接接触(可能通过低亲和相互作用)与细菌细胞表面的组成分子。然而,出于几个原因,我们将初始实验导向确定释放的LOS是否在上皮细胞ICAM-1诱导中发挥作用。首先,LPS诱导哺乳动物细胞的多种反应,并可能调节气道上皮细胞的细胞因子基因表达(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64gydF4y2Ba).其次,我们不能从一开始就排除这样一种可能性:诱导上皮细胞ICAM-1的细菌细胞外因子可能具有物理特性(可能不是分子大小),无法通过0.2 μm和0.1 μm膜,或者细菌相关的LOS可能激活上皮细胞。最后,从nontypable中部分纯化LOSgydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba据报道,肺癌患者分离的气道上皮细胞中细胞因子的释放和ICAM-1的表达增加(gydF4y2Ba65gydF4y2Ba).然而,gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba本研究中使用的LOS是高浓度的部分纯化制剂,我们推测该制剂中的杂质可能包括其他非LOS因子,可诱导上皮细胞上的ICAM-1表达。gydF4y2Ba
我们的工作提供了多条证据,表明LOS不是诱导上皮细胞ICAM-1的原因gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.我们无法通过高水平的纯化LOS来诱导这种效应gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.因此,我们无法使用特定的LPS竞争性抑制剂抑制上皮细胞ICAM-1表达的诱导。此外,我们发现与其他释放脂多糖的革兰氏阴性细菌(gydF4y2Bab .百日咳gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)在相似的感染水平没有诱导上皮细胞ICAM-1。此外,血清和血清相关的LPS辅因子LPS结合蛋白和可溶性CD14 (gydF4y2Ba64gydF4y2Ba,gydF4y2Ba66gydF4y2Ba)在文化媒体上没有影响gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba诱导上皮细胞ICAM-1 (A.G.F.和D.C.L,未发表的观察)。我们和其他研究人员此前无法通过来自其他生物的几种不同的LPS制剂在人呼吸道上皮细胞中诱导ICAM-1表达或IL-8释放,包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(参考文献。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba67gydF4y2BaA.G.F.和D.C.L,未发表的观察)。虽然有明显的结构差异gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2BaLOS和其他形式的LPS一样,LPS的生物活性存在于脂质A部分,脂质A的存在和结构特征在各种革兰氏阴性菌中高度保守,包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba63gydF4y2Ba,gydF4y2Ba64gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68gydF4y2Ba).气道上皮细胞ICAM-1表达对LPS反应的相对缺乏敏感性可能反映了上皮细胞持续暴露于环境中的许多细菌产物的事实,因此上皮细胞利用其他因素来区分细菌存在与感染。有趣的是,腺病毒癌蛋白E1A的上皮表达将上皮表型改变为LPS反应型,这表明环境因素可能改变上皮细胞中的LPS信号通路(gydF4y2Ba69gydF4y2Ba,gydF4y2Ba70gydF4y2Ba).虽然我们的研究结果表明气道中的上皮细胞对LOS不单独有反应,但他们不排除LOS可能是必要的,或通过其他因素促进了ICAM-1的诱导。该系统可以类似于诱导上皮细胞IL-6的系统,在该系统中,其他尚未识别的因素与之协同作用gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba洛杉矶(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65gydF4y2Ba,gydF4y2Ba71gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
细菌附着在上皮细胞上是定植过程和疾病发病机制的基础,是由称为黏着素的细菌因子介导的,黏着素与特定的宿主细胞表面结构相互作用(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).表面的粘合剂gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba包括聚合结构,如血凝毛和单体或寡聚分子,包括HMW1, HMW2, Hia和Hap。非型菌株12不表达菌毛(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba),但该菌株能够激活上皮细胞ICAM-1的表达gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba各种因素促成了这种反应。缺乏HMW1、HMW2、Hia和/或Hap的等基因突变体保留了诱导上皮细胞ICAM-1的能力,这表明这些粘连素对这种作用不是必需的。类似地,包封的b型菌株能够诱导ICAM-1,尽管包封干扰了非菌毛粘连素的功能,并几乎消除了对A549细胞的粘附。我们的工作表明,诱导上皮细胞ICAM-1的因素并不是高亲和力的粘连蛋白gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba用于最初的细菌粘附和定植。有趣的是,推测从定殖到疾病的进展需要低亲和力细菌因子与上皮细胞表面的相互作用,从而激活炎症反应。gydF4y2Ba
我们的发现可能的生理学意义是通过显示icam -1依赖的中性粒细胞粘附上皮细胞感染后体外gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.这一发现得到肺部感染小鼠模型的进一步支持,其中气道感染导致中性粒细胞募集和CXC趋化因子水平升高,同时上皮细胞ICAM-1表达升高。在这个模型中,我们使用琼脂颗粒来破坏细菌的清除,因为我们发现没有气道功能受损的小鼠通常是清除的gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba24小时内(L.P.和D.C.L,未发表观察)。这种气道清除率降低的要求可能与人类相似,在人类中,与气道功能障碍相关的预先存在的肺部疾病(如囊性纤维化、支气管扩张、支气管炎)易使患者感染gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba.我们研究中使用的体内模型系统并没有将细菌和上皮细胞之间的直接相互作用与更好理解的炎症基因调节的细胞因子依赖机制区分开来。IFN-γ和TNF-α似乎是气道上皮细胞ICAM-1表达的主要细胞因子刺激因子(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba67gydF4y2Ba),体内LPS诱导ICAM-1的上皮细胞可能依赖TNF-α (gydF4y2Ba72gydF4y2Ba).然而,通过细菌与上皮细胞的直接相互作用快速诱导ICAM-1和其他介质,独立于其他细胞类型释放的炎症介质,可能允许中性粒细胞早期靶向gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Ba导致气道内有效的先天防御的感染。综上所述,我们的研究结果提出了一个气道中白细胞迁移和激活的模型,其中上皮细胞对细菌感染的细胞粘附分子和趋化因子的表达可能通过细胞因子与其他细胞类型的通信间接介导,也可能由气道中的细菌直接介导。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢M. Apicella、M. Dustin、W. Goldman、J. Lechner、S. Lory、N. Qureshi、R. Rothlein、D. Staunton和P. Zeitlin慷慨赠送的试剂;S. Brody, D. Dean, W. Goldman和M. Holtzman的有益讨论;以及D. Cutter和D. Dickhaus的技术援助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项研究得到了美国国立卫生研究院和囊性纤维化基金会的资助。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba地址:华盛顿大学医学院,校园信箱8052,南欧euclid大道660,圣路易斯,MO 63110。电子邮件地址:gydF4y2Ba显得在}{msnutes.wustl.edugydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba本文中使用的缩写:LOS,低脂糖;HMW,高m.w;CMF,不含钙和镁;偶然,gydF4y2Ba嗜血杆菌gydF4y2Ba粘附渗透蛋白;投资法、gydF4y2Ba流感嗜血杆菌gydF4y2Baadhesin;磅,Luria-Bertani;人类致癌实验室;MIP-2,巨噬细胞炎症蛋白-2;RsDPLA,gydF4y2BaRhodobacter sphaeroidesgydF4y2Ba二磷酰脂A。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba1999年7月20日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2000年2月4日。gydF4y2Ba
- 版权所有©2000美国免疫学家协会gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba