摘要gydF4y2Ba
早期炎症事件包括细胞因子的释放、激活和中性粒细胞的快速积累,随后单核细胞的募集。p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞内信号通路在调节许多不同细胞的广泛炎症反应中起核心作用。我们建立了lps诱导的小鼠轻度肺部炎症模型,以研究p38 MAPK通路在肺部炎症启动中的作用。一种新的p38 MAPK抑制剂M39被用来确定p38 MAPK激活的功能后果。体外暴露于M39可抑制lps刺激的小鼠和人中性粒细胞和巨噬细胞中p38 MAPK的活性,阻断TNF-α和巨噬细胞炎症蛋白-2 (MIP-2)的释放,并消除小鼠中性粒细胞向趋化因子MIP-2和KC的迁移,相反,肺泡巨噬细胞需要1000倍浓度的M39才能阻断TNF-α和MIP-2的释放。p38 MAPK的全身抑制导致气管内给药后TNF-α的释放和中性粒细胞在气道中的积累显著减少。p38 MAPK的抑制不影响MIP-2和KC从空气中恢复,单个核细胞的积累也没有显著减少。当KC作为促炎刺激输注时,p38 MAPK抑制显著减少中性粒细胞积累,而不依赖于TNF-α或LPS。总之,这些结果表明,与其他白细胞相比,中性粒细胞对p38 MAPK级联的依赖性更大,并提出了一种选择性研究和潜在调节肺部早期炎症的方法。gydF4y2Ba
在促炎刺激下,中性粒细胞向肺的快速积聚是许多肺部疾病发病机制中最早可识别的事件之一。中性粒细胞穿过肺血管系统,通过肺间质迁移,最终积聚在气道的过程需要循环白细胞和肺细胞之间复杂的相互作用(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).虽然中性粒细胞积累的许多方面尚不清楚,但已经确定了一些离散的事件。在健康状态下,有相当一部分的循环中性粒细胞在任何时间点通过肺毛细血管床,形成边缘池(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).在肺损伤的情况下,中性粒细胞向空气空间的有效迁移和积累需要协调的反应,包括粘附分子的上调、细胞骨架的重排、细胞大小和硬度的增加以及趋化性(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).在很大程度上,细胞因子和其他可溶性促炎刺激协调了白细胞的反应。在某些疾病状态下,中性粒细胞自身合成的细胞因子可扩大并使白细胞持续聚集到空气中(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).单核细胞和巨噬细胞在肺部的聚集通常发生在中性粒细胞的初始募集之后。在一些急性炎症动物模型中,单核细胞在肺部的积聚是中性粒细胞依赖的(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
特别令人感兴趣的是LPS诱导肺部炎症的能力,因为局部或全身性内毒素释放是许多疾病的重要特征,包括局灶性肺炎、囊性纤维化和急性呼吸窘迫综合征。LPS不是中性粒细胞的有效化学引诱剂,但可通过常驻肺泡巨噬细胞(AM)合成细胞因子和其他促炎介质引发炎症级联反应。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba局部肥大细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞。TNF-α和中性粒细胞定向趋化因子如IL-8的释放对于lps介导的早期中性粒细胞募集至关重要。gydF4y2Ba
TNF-α和IL-8对中性粒细胞募集的联合作用是复杂且不完全了解的。TNF-α的已知作用包括激活内皮细胞以表达粘附蛋白,诱导一系列继发性炎症介质,以及“启动”中性粒细胞以增强吞噬和杀菌活性(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).通过特异性抗体和转基因小鼠的研究,证实了TNF-α在lps诱导的休克和组织损伤的发病机制中的需要。然而,这些技术不允许选择性地减少细胞类型对TNF-α的释放,也不允许调节中性粒细胞对TNF-α的反应能力。作为单一药物,TNF-α也不会诱导中性粒细胞趋化。然而,ELR(+)CXC趋化因子IL-8是目前所描述的最特异的中性粒细胞趋化因子之一(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).IL-8尚未在小鼠中发现,但巨噬细胞炎症蛋白-2 (MIP-2)和KC具有相同的ELR(+)CXC结构,并作为人类IL-8的功能同源物(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
细胞对外部刺激的选择性反应可以通过细胞内信号传导机制的差异激活来理解。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族是高度保守的信号激酶,调节细胞生长、分化和应激反应(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba).哺乳动物细胞中至少存在三个不同的MAPKs家族:p42/44细胞外信号调节激酶(ERK) MAPKs, c-Jun NHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-末端激酶(JNKs)和p38 MAPK (gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).无论是宿主防御细胞对细胞因子的协同释放,还是中性粒细胞对细胞因子和其他促炎因子的功能性反应,都不同程度地受到p38 MAPK的调控。在中性粒细胞中,p38α MAPK在许多刺激下被激活,包括LPS和TNF-α (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).一旦被激活,p38α MAPK能够通过转录因子的磷酸化和其他激酶的激活来调节功能反应。在lps刺激的中性粒细胞中,p38α MAPK调节明显不同的功能,包括粘附、NF-κB的激活以及TNF-α和IL-8的合成(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba).在受趋化剂FMLP刺激的中性粒细胞中,p38α MAPK的激活调节超氧阴离子释放和趋化性(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba).在lps刺激的单核细胞/巨噬细胞中,抑制p38α MAPK可阻断TNF-α和IL-8的释放(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba).在白细胞以外的细胞中,p38 MAPK也调节应激反应,包括支气管上皮细胞在TNF-α或其他炎症刺激下释放IL-8 (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba).LPS刺激还会激活内皮细胞中的p38 MAPK,导致ICAM-1粘附分子的上调(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
鉴于p38 MAPK作为多种不同细胞类型的多种炎症反应的调节剂的核心作用,我们质疑体内p38 MAPK抑制对肺中性粒细胞积累的影响。在这些研究中,我们采用了一种小鼠模型,该模型对空气中单次给药LPS有轻微的肺部炎症反应。p38α MAPK的抑制作用是由新的化合物M39完成的,M39是迄今为止描述的最具选择性和最有效的p38 MAPK抑制剂(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba).我们研究了选择性抑制p38 MAPK对小鼠肺早期炎症反应发病机制中几个关键事件的影响。在这里,我们报道了p38 MAPK的体外抑制导致小鼠中性粒细胞功能显著下降,但对其他炎症反应的影响有限。在体内,这导致初始中性粒细胞募集到空气空间的损失,而后来单核细胞的积累基本保持完整。综上所述,这些数据表明在体内中性粒细胞反应的相对选择性抑制的潜力。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
材料gydF4y2Ba
所有实验均采用无内毒素试剂和塑料。抑肽蛋白、胰肽、Tris-HCl、Triton X-100、igepal、PMSF、EDTA、EGTA、Nonidet P-40和蛋白A-Sepharose购自Sigma (St. Louis, MO)和[γ-]gydF4y2Ba32gydF4y2BaP]ATP是从Amersham (Arlington Heights, IL)购买的。M39 [(gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)-5-[2-(1-苯基乙胺)嘧啶-4-基]-1-甲基-4-(3-三氟甲基苯基)-2-(4-哌啶基)咪唑]由Merck (Rahway, NJ)提供,保存在DMSO中,温度为- 20°C。LPS是从gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
1 - 110gydF4y2Ba是按照前面描述的方式准备的(gydF4y2Ba动物gydF4y2Ba
所有实验均采用6 - 12周龄、体重16-20 g的雌性C57BL/6小鼠(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)。他们被随意给予商业颗粒食物和水。在国家犹太医学和研究中心动物护理和使用委员会审查了协议后,所有实验都按照《动物福利法》和《美国公共卫生服务关于实验动物的人道关怀和使用政策》进行。麻醉方式为单次静脉注射333 mg/kg维维汀。将10g三溴乙醇(Aldrich, Milwaukee, WI)与10ml三元戊醇(Aldrich)混合,并将其稀释为无菌生理盐水中2.5%的溶液,制备Avertin。gydF4y2Ba
小鼠支气管肺泡灌洗(BAL)gydF4y2Ba
戊巴比妥过量或颈椎脱位致动物牺牲后立即行BAL。该手术是在原位肺的情况下进行的,但胸腔通过中线切口打开。气管用20g导管(Baxter quick - cath, Baxter Health Care, Deerfield, IL)口服或直接通过覆盖气管的皮肤小切口插管。输注2 ~ 4份0.8 ml等分生理盐水,含20 U/ml肝素,用1 ml注射器用手轻轻地吸出。定量回收BAL的体积,并用血细胞计对回收的细胞进行计数。用赖特染色法测定纺丝样品的细胞类型。所有的载玻片都由不同的观察者进行两次计数,这些观察者对动物的状态一无所知。用于细胞因子分析的样品立即冷冻在干冰/乙醇浴中,保存在- 70°C。gydF4y2Ba
细胞分离gydF4y2Ba
用血浆Percoll法分离人中性粒细胞(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),悬浮在pH为7.2、含有0.2%葡萄糖的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液中或RPMI 1640培养基中(BioWhittaker, Walkersville, MD)。从小鼠股骨和胫骨中分离成熟小鼠骨髓中性粒细胞。采用颈椎脱位法处死动物,解剖骨头。取每根骨的两端,用25号针在5ml含HBSS(不含钙、镁、碳酸氢盐或酚红)的注射器上表达骨髓。骨髓采集于50ml聚丙烯锥形管(Becton Dickinson, Bedford, MA)中,随后用19号针轻轻吸吸悬浮液重悬。112 ×离心使骨髓细胞成球gydF4y2BaggydF4y2Ba洗涤6分钟,用HBSS洗涤一次,再用HBSS重悬至最终体积为2ml,准备密度梯度离心。Percoll原液(100%细级);法玛西亚精细化工公司(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)采用10倍HBSS, Percoll:10倍HBSS的比例为9:1 (v/v)。在15 ml聚丙烯锥形管(Becton Dickinson)中制备3 × 2 ml Percoll不连续密度梯度(72、64和52%,1× HBSS)。骨髓悬浮液在Percoll梯度上分层,在1060 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba形态成熟的中性粒细胞在浓度为> ~ 95%时,在64和72% Percoll层的界面处形成条带。仔细抽吸该条带,在15ml锥形管中与12ml 1× HBSS混合,在112 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba洗涤6分钟,用1倍HBSS洗涤2次,用1倍HBSS重悬至2ml体积,用血细胞计计数。典型产量为~ 1-2 × 10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba每只小鼠成熟骨髓中性粒细胞。在单独的研究中,与外周小鼠中性粒细胞相比,骨髓中性粒细胞显示出相同的功能反应和再循环模式(b.t.s.,未发表的观察结果)。采用改良的方法分离小鼠外周血中性粒细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)用于兔外周中性粒细胞的纯化。小鼠体积扩大,放血至3.8%柠檬酸溶液中,300倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将细胞颗粒在6%葡聚糖和0.9% NaCl溶液中(葡聚糖:生理盐水的比例为1:5.25)重悬至最终体积为原始血容量的150%,并在等重力下沉积30分钟。抽吸富含白细胞的上清,在HBSS中洗涤一次,在Percoll梯度(78、66和54%)上分层,并在1060倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba致密带细胞纺丝样品显示中性粒细胞约占90%。用低渗盐水裂解后,典型产量为~ 2-4 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每只小鼠外周血中性粒细胞。台盼蓝染色排除后,纯化后的细胞存活率为97%。小鼠AM通过两个连续的bal分离。典型产量为~ 2 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba纺丝样品的赖特染色评估为97-99% AM。gydF4y2Ba
中性粒细胞功能测定gydF4y2Ba
所有的实验都是在1%人或鼠热灭活的贫血小板血浆存在的情况下进行的。细胞因子释放试验用从外周血中分离的小鼠中性粒细胞或小鼠AM重悬在含有2%小鼠热失活血小板贫血浆浓度为5 × 10的RPMI 1640中进行gydF4y2Ba6gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),并稍加修改。在所有的迁移实验中,使用含有0.25%人血清白蛋白的克雷布-林格-磷酸葡萄糖作为缓冲液。在2到5 × 10之间gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在每种情况下,每个凝胶都装载中性粒细胞。将凝胶倒置到含有0.1%的安装介质上gydF4y2BapgydF4y2Ba-苯二胺和70%甘油加1滴规定直径的荧光珠(DNA-Check;Coulter, Hialeati, FL)建立尺度。所有凝胶用×40干物镜和0.55数值孔径检测。每隔5 μm制作每个凝胶切片的细胞图,记录每个深度的细胞数。每种情况下至少检查三个凝胶切片,并计算每个深度的平均值。每个深度的细胞分布值表示为整个垂直切片中观察到的细胞总数的百分比。gydF4y2Ba
P38 MAPK免疫沉淀测定gydF4y2Ba
通过磷酸化ATF-2的能力,从免疫沉淀样品中检测p38α MAPK的激酶活性gydF4y2Ba1 - 110gydF4y2Ba如前所述(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
气管内注入促炎刺激gydF4y2Ba
阿维汀麻醉后,将300 μ ng LPS或1 μg KC溶解于含0.1%人血清白蛋白的50 μl生理盐水中,经口咽部将球直径1.25 mm的22号弯曲喂食针(Popper & Sons, New Hyde Park, NY)注入小鼠气道。gydF4y2Ba
p38 MAPK的体内抑制作用gydF4y2Ba
麻醉小鼠经胃插管使用直径2.25 mm的22号直喂针(Popper & Sons)给药。将禁食小鼠置于半直立位置,以3mg /kg的剂量滴注悬浮在100 μl羟丙基甲基纤维素(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中的M39。M39分别在KC或LPS气管内灌注前2 h和后12 h给药,除早于12 h给药的时间点外。gydF4y2Ba
小鼠肺组织中性粒细胞积累的组织学检查和定量分析gydF4y2Ba
在M39存在或不存在的情况下,用生理盐水或LPS处理动物。24 h,用戊巴比妥过量处死动物,中线切开。将20g导管(Baxter Health Care)插入气管,用2-0丝绑紧,然后仔细剥离,将肺从胸腔中取出。在空气充分充气至25 cm的水压力后,将气管捆绑,将肺浸泡在1.5%的戊二醛溶液中24小时。石蜡包埋整个肺切片(4 μm)。矢状面切片苏木精-伊红染色,光镜检查。每种情况下研究2 - 4只动物,并由两名不知道动物治疗状态的独立观察者选择具有代表性的肺切片。以×400放大倍率拍摄显微照片。髓过氧化物酶(MPO)测定法定量全肺(不包括肺腔)中性粒细胞的积累,如前所述(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),并稍加修改。BAL后,分离的全肺在液氮中冷冻,称重,然后均质。在20000 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将不溶性颗粒在50mm磷酸钾缓冲液中重悬30min, pH为6.0,含0.5%十六烷基三甲基溴化铵。样品经超声处理,在60℃下孵育2小时,并在过氧化氢/中测定活性gydF4y2BaogydF4y2Ba-二苯胺缓冲液460 nm。结果以每克肺组织的MPO活性单位表示。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
数据分析采用JMP统计软件(SAS Institute, Cary, NC)。学生的未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba采用双尾检验来确定p38 MAPK抑制的显著性(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)和中性粒细胞积累和MPO含量(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)作为一个时间点。趋化性差异(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)进行χ分析gydF4y2Ba2gydF4y2Ba测试。采用单因素方差分析分析lps诱导的细胞因子释放和白细胞积累随时间的影响(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).在存在和不存在p38 MAPK抑制的情况下,随着时间的推移,体内细胞积累和细胞因子释放的差异(图5gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,和9gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)进行双因素方差分析。当抑制与时间存在显著交互作用时,对每个时间点的抑制效果分别进行分析。对于所有的测试gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01被认为是显著的,除非另有说明。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
小鼠中性粒细胞p38α MAPK活化的抑制作用gydF4y2Ba
先前的报道已经证明,在LPS刺激下,人中性粒细胞中p38α MAPK的磷酸化和激活(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).为了确定小鼠中性粒细胞对LPS的反应是否会激活p38α MAPK,并评估M39抑制p38α MAPK活性的能力,在M39存在和不存在的情况下,用LPS刺激小鼠骨髓中性粒细胞。通过对LPS刺激或未刺激的中性粒细胞裂解物中p38α MAPK激酶的免疫沉淀,同时评估p38α MAPK的活性和磷酸化。通过SDS-PAGE分离p38α MAPK,并用能够检测p38α MAPK酪氨酸磷酸化的Ab进行Western blot染色(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).为了进行比较,以相同的方式刺激和分析相同数量的人中性粒细胞(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).然后用第二个针对p38α MAPK的抗体进行印迹处理,确认在每种情况下免疫沉淀了等量的激酶(数据未显示)。采用免疫沉淀p38α MAPK与ATF-2联合检测p38α MAPK活性gydF4y2Ba1 - 110gydF4y2Ba,已知底物(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba),在…面前gydF4y2Ba32gydF4y2BaP]ATP(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).LPS刺激导致小鼠和人中性粒细胞中p38α MAPK的酪氨酸磷酸化。然而,从lps刺激的细胞中分离出的p38α MAPK,用M39处理后,其激酶活性显著降低。M39对p38 MAPK的抑制可能导致不同细胞类型和物种之间不同程度的酪氨酸磷酸化降低(我们未发表的观察结果)。这些结果证明了p38α MAPK在小鼠中性粒细胞中的磷酸化和激活,以及M39抑制lps诱导的p38α MAPK激活的能力。gydF4y2Ba
抑制p38 MAPK可阻断趋化因子诱导的小鼠中性粒细胞趋化gydF4y2Ba
趋化是一种复杂的反应,涉及粘附和肌动蛋白组装的协调。我们之前报道过p38 MAPK的抑制导致人类中性粒细胞对FMLP的趋化反应丧失(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba).我们测试了p38 MAPK抑制对小鼠中性粒细胞向趋化剂MIP-2和KC迁移的影响,通过在暴露于趋化因子75 min后的5 μm间隔内计数细胞数量,量化中性粒细胞通过三维胶原基质的趋化性。在M39存在的情况下,中性粒细胞趋化MIP-2(图2)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和KC(图2)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)被封锁了。gydF4y2Ba
抑制p38 MAPK对lps刺激小鼠中性粒细胞和AM细胞因子释放的影响gydF4y2Ba
AM的一个重要作用是对LPS的细胞因子释放,从而触发和协调早期炎症。中性粒细胞也有能力合成和释放有限数量的细胞因子(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),在某些情况下可能对持续炎症反应很重要。p38 MAPK的激活与单核/巨噬细胞和中性粒细胞的细胞因子产生有关。我们测试了M39抑制p38 MAPK对lps诱导的TNF-α、MIP-2和KC从粘附的中性粒细胞和AM释放的影响(见gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba).一个集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba当M39浓度<0.1 nM时,可以抑制lps刺激的中性粒细胞对TNF-α和MIP-2的释放(图3)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).相比之下,ICgydF4y2Ba50gydF4y2BaM39对lps激活AM达到抑制TNF-α和MIP-2释放的作用比lps激活AM高1000倍(图3)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).在研究的条件下,lps刺激的中性粒细胞和AM都没有释放大量的KC(图3)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba).10 μM M39处理后的中性粒细胞和巨噬细胞的活力在97 ~ 99%之间,与未处理的细胞的活力相等(数据未显示)。这些结果支持了在体外抑制p38 MAPK可能导致中性粒细胞比AM相对更大的功能反应损失的结论。gydF4y2Ba
小鼠肺部炎症对气管内LPS反应的表征gydF4y2Ba
为了研究p38 MAPK激活在肺部中的作用,我们建立了一个轻度肺部炎症模型。在气管内给药LPS后,在一系列时间点上对BAL样本中的白细胞和选定的细胞因子进行量化。选择一定剂量的LPS可引起大量中性粒细胞内流,随后是单个核细胞(主要是巨噬细胞和单核细胞)的继发性积累,在72小时内几乎完全溶解(图4)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).中性粒细胞在空气中的最大积累发生在LPS安装后24小时(图4)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).在LPS的作用下,TNF-α、MIP-2和KC的产生在4小时内达到峰值,12小时后恢复到基线水平(图4)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).在中性粒细胞内流最大的24小时内,细胞因子的恢复可以忽略不计,这表明在该模型中,中性粒细胞释放的细胞因子最少。gydF4y2Ba
体内抑制p38 MAPK可减少空气中白细胞的积累gydF4y2Ba
为了量化体内p38 MAPK抑制情况下观察到的炎症变化,我们在给药LPS 72小时后进行了BAL研究。计算小鼠经气管内LPS处理后BAL恢复的中性粒细胞和单核细胞数量。给药后4 ~ 24 h,中性粒细胞积累显著减少(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).到48小时,气道中不再存在中性粒细胞,而是被单核细胞/巨噬细胞所取代。当评估总单个核细胞时,系统性p38 MAPK抑制的效果无统计学意义(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).总之,这些图支持这样的结论:体内抑制p38 MAPK主要导致早期中性粒细胞积累的减少,而对后期单核细胞/巨噬细胞的募集几乎没有影响。gydF4y2Ba
体内抑制p38 MAPK导致空气中TNF-α释放减少gydF4y2Ba
在给药后0-72小时的小鼠BAL研究中,我们分析了TNF-α、MIP-2和KC的含量,发现只有TNF-α被M39在体内抑制p38 MAPK显著降低(图6)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba), MIP-2的释放未见明显变化(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba)或KC(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba).这些数据表明,p38 MAPK的全身抑制可以对细胞因子的释放产生不同的影响,并且在所研究的条件下,小鼠常驻肺免疫细胞释放KC和MIP-2趋化因子对p38 MAPK信号的依赖性相对小于TNF-α。gydF4y2Ba
体内p38 MAPK的抑制导致肺部炎症的组织学证据减少gydF4y2Ba
评估体内p38 MAPK抑制对lps诱导的轻度肺部炎症组织学变化的影响。在m39存在和不存在的情况下,动物气管内注射LPS,并与盐水处理的对照组进行比较。24 h后,lps处理小鼠(图7)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba)与生理盐水处理的动物相比,显示出明显的间质和肺泡内白细胞积聚和水肿(图7)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).在存在38 MAPK抑制的情况下,炎症变化明显,但程度较轻(图7)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
抑制p38 MAPK选择性地阻断中性粒细胞在空气中的积累gydF4y2Ba
LPS抑制p38 MAPK后,空气中中性粒细胞积累减少,可能是由于肺血管或肺间质中中性粒细胞潴留减少,或者细胞迁移到肺泡的能力丧失。MPO测定用于定量肺血管和肺间质中性粒细胞负荷。在M39存在和不存在的情况下,动物气管内注射LPS,并在24小时与盐水处理的对照组进行比较,与图7所示的条件相同gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba.用BAL测定空气空间中性粒细胞积聚(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba), BAL后对离体肺进行MPO测定(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).尽管在体内p38 MAPK抑制的情况下观察到中性粒细胞积累的显著减少(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba),在p38 MAPK抑制或不抑制的分离肺中存在的中性粒细胞数量是相等的(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).这些结果支持了p38 MAPK的系统性抑制导致中性粒细胞向气道迁移的丧失的结论,这与体外p38 MAPK抑制对中性粒细胞趋化性的影响一致(图2)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
体内通过抑制p38 MAPK减少中性粒细胞积累是由于中性粒细胞趋化反应的减少gydF4y2Ba
由于TNF-α释放减少,中性粒细胞对LPS的反应减弱,p38 MAPK全系统抑制后肺部炎症的减少可能发生(图6)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或选择性抑制中性粒细胞趋化性(图2)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaBgydF4y2Ba).为了评估系统性p38 MAPK抑制对中性粒细胞趋化性的影响,不依赖于LPS和TNF-α,我们研究了kc诱导的肺部炎症模型。KC是一种有效的、选择性的小鼠中性粒细胞化学引诱剂,很少触发炎症级联反应。在M39存在和不存在的情况下,小鼠气管内给予KC, BAL研究从0到48小时进行。在研究条件下,KC诱导中性粒细胞快速和自限性迁移,体内p38 MAPK抑制显著减少中性粒细胞迁移(图9)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).与LPS不同的是,KC并没有导致大量单核细胞的后期积累(图9)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).BAL分析显示没有可测量的MIP-2和TNF-α释放,给药后空气中KC水平迅速下降(数据未显示)。这些结果表明,在系统性抑制p38 MAPK后,lps诱导的中性粒细胞积累的减少可能是由于中性粒细胞反应的减少,而不依赖于TNF-α的产生。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
上述小鼠肺部炎症模型使用单次低剂量气管内给药LPS诱导急性炎症反应,其特征是细胞因子的快速但自限性释放,随后是中性粒细胞的短暂内流和单个核细胞的继发性积累。该模型旨在研究肺部炎症的关键早期阶段,其中中性粒细胞募集是一个中心特征。通过限制初始损伤的程度,避免了许多导致严重炎症长期存在的特征,包括细胞因子的持续释放、白细胞的持续募集、实质的严重损伤以及最终的显著死亡率。gydF4y2Ba
通过对多种细胞系和原代细胞的体外研究,p38 MAPK与多种炎症反应有关。随着最近有效和特异性抑制剂的发展,p38 MAPK在体外系统和复杂的体内炎症模型中的作用可以被研究。小鼠中性粒细胞在LPS刺激下具有与人类中性粒细胞几乎相同的p38α MAPK激活。用新型p38 MAPK抑制剂M39处理小鼠中性粒细胞可显著抑制p38α MAPK活性。p38 MAPK抑制对小鼠中性粒细胞的重要功能影响是对MIP-2和KC的趋化性丧失,以及对LPS的反应中TNF-α和MIP-2释放的丧失。出乎意料的是,对小鼠AM的平行研究表明,阻断TNF-α、MIP-2或KC的释放需要1000倍的M39浓度。在体内也观察到中性粒细胞对p38 MAPK级联抑制的更大敏感性。在全身性p38 MAPK抑制的情况下,气管内注射LPS后,中性粒细胞(而非单个核细胞)的内流显著减少。对全肺中性粒细胞积累的定量分析表明,在所研究的条件下,只有空气空间的中性粒细胞内流减少,这支持了中性粒细胞趋化性对p38 MAPK激活依赖性的体外分析。通过抑制p38 MAPK,空气中TNF-α的恢复减少,但MIP-2和KC的数量不受影响。当KC作为主要的中性粒细胞趋化剂时,不会引起TNF-α和MIP-2的二次释放,但中性粒细胞内流被全身p38 MAPK抑制显著阻断。gydF4y2Ba
尽管MAPK级联反应是高度保守的,但现在已经了解到,中性粒细胞、巨噬细胞和其他细胞对MAPK级联反应的特异性利用是不同的。在单核细胞或巨噬细胞系中,有报道称LPS可以激活p42/44 (ERK) MAPK和JNK以及p38 MAPK级联(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba).单核细胞或巨噬细胞释放TNF-α可通过选择性抑制JNK (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)、p38 MAPK (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),或p42/44 (ERK) MAPK级联(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba).p38 MAPK级联的一个组成部分的破坏gydF4y2BaMKK3gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠腹腔巨噬细胞对LPS (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba).在T细胞中,抑制p38 MAPK对TNF-α释放的影响小于抑制p42/44 (ERK)级联(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba).相反,LPS刺激中性粒细胞不会导致p42/44 (ERK) MAPKs或JNKs的激活(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba).中性粒细胞作为一种寿命短、终末分化的原代细胞,其合成能力较有限,在LPS的作用下,使用较少的细胞内信号转导机制。因此,在系统性p38 MAPK抑制的情况下,中性粒细胞功能的选择性丧失表明,中性粒细胞相对于AM更依赖于p38 MAPK级联的信号转导。gydF4y2Ba
尽管最近人们对p38 MAPK的激活和功能非常感兴趣,但很少有关于该信号通路在体内被抑制的报道。pyridinyl imadazole化合物,包括SB203580和SK&F86002,是研究最广泛的p38 MAPK抑制剂,在动物模型中显示出具有抗炎特性。这些早期p38 MAPK抑制剂可减少中性粒细胞内流,以应对尿酸钠或卡拉胶引起的腹膜炎(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)及胶原性关节炎(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba).在腹腔注射LPS后,这些化合物的施用导致通过腹膜冲洗减少TNF-α的恢复(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba内毒素休克模型小鼠血清TNF-α降低,死亡率降低(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba).这些p38 MAPK抑制剂的抗炎作用发生在没有全身性免疫抑制的情况下(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba).系统性p38 MAPK抑制对肺部炎症的影响尚未被描述。迄今为止,几乎所有关于p38 MAPK功能作用的研究都使用了具有IC的化合物SB203580gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 39±11 nM,对c-Raf (IC)有明显的抑制作用gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 330±155 nM)和JNK2α1 (ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 290±110 nM)。相比之下,M39有一个集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.11±0.046 nM,对c-Raf (IC)的活性显著降低gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= >1000 nM)或JNK2α1 (ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 675 nMgydF4y2Ba25gydF4y2Ba).作为一种更有效和选择性的p38 MAPK抑制剂,M39比以前可用的化合物更适合体内研究。gydF4y2Ba
在lps诱导的轻度肺部炎症小鼠模型中,体内p38 MAPK抑制的主要作用是减少中性粒细胞的募集。基于对MIP-2和KC的体外趋化试验,这种效应可能是中性粒细胞反应减少的结果。BAL测量趋化因子水平支持这一结论,因为在M39处理的动物中,KC和MIP-2的释放均未减少。此外,p38 MAPK的体内抑制可阻断中性粒细胞的积累,以响应气管内给药KC,不依赖于LPS或TNF-α。虽然在M39治疗的动物中检测到LPS刺激后TNF-α释放减少,但在研究条件下,这种影响似乎是次要的。与肺常驻细胞相比,中性粒细胞对p38 MAPK信号的依赖性明显更大,这表明在肺部炎症中有可能选择性分析和调节中性粒细胞内流。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项工作得到了美国国立卫生研究院赠款K08 HL03657、HL-40784、HL-34303、HL-09640和GM-30324的支持。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba请将通信和转载请求发送给Jerry A. Nick博士,地址是国家犹太医学和研究中心,地址是D403, 1400 Jackson Street, Denver, CO 80206。电子邮件地址:gydF4y2Banickj在}{njc.orggydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba本文所用缩写:AM,肺泡巨噬细胞;活化转录因子-2;BAL,支气管肺泡灌洗;ERK,细胞外信号调节激酶;王志强,张志军gydF4y2Ba2gydF4y2Ba终端激酶;MAPK,丝裂原活化蛋白激酶;巨噬细胞炎症蛋白-2;MPO、髓过氧物酶。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba1999年6月11日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba1999年12月9日。gydF4y2Ba
- 版权所有©2000由美国免疫学家协会gydF4y2Ba
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