极化1型细胞因子在支气管肺泡灌洗过敏性肺炎患者的T细胞gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba

过敏性肺炎(HP)gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba是一种肺部疾病引起的敏感和各种有机Ags的重复吸入。它的特点是淋巴球增多球流体中发现,炎症淋巴细胞牙槽炎,肺和松散形成肉芽肿(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。重复暴露会导致炎症的进展和最终终末期肺病严重纤维化。几项研究已经表明,免疫complex-mediated免疫和细胞介导免疫顺序参与惠普的发病机理(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。用动物模型研究表明后者过程更重要(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba);然而,惠普的发病机制的确切机制仍未阐明。gydF4y2Ba

如前所述,最引人注目的惠普的病理特征之一是一个了不起的淋巴球增多BAL流体,通常由CD8为主gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,因此,CD4 / CD8比值通常低于1.0 (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。然而,有总T细胞的绝对数量的增加,不仅CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba但CD4 T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba惠普患者T细胞也明显高于与控制或其他间质性肺疾病(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。这些发现表明,CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞中发现的肺可能导致惠普的发病机制。gydF4y2Ba

CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞可以通过限制细胞因子分泌特征子集的概要文件(Ref。22;综述了gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),1型(例如,CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTh1细胞)是由一个优惠分泌IFN-γ和2和2型(例如,Th2)细胞是由优惠的分泌il - 4, IL-5, il - 10。某些疾病也为特征,基于细胞因子的性质和比例,Th1——或th2型疾病。一般来说,Th1细胞因子似乎存在细胞介导免疫反应和参与慢性炎症性疾病,而Th2细胞因子调控的IgE生产和在过敏性疾病的发病机理是突出的。体内CD4的cross-regulation和意义gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTh1、Th2子集在多种疾病模型和临床状态了gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)记录即使在肺结节病等疾病,特点是一个Th1-type cytokine-dominant概要文件(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),支气管哮喘,th2型(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba细胞因子)。gydF4y2Ba

惠普最近的数据使用动物模型已经吸引了越来越多的关注Th1-type细胞因子特别是IFN-γ的重要性。斯凯勒et al。(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)报道,Th1 CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞系可以过继转移实验惠普在老鼠身上,和Cudmundsson et al。(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)报道,使用IFN-γ基因敲除小鼠,IFN-γHP-like疾病的表达至关重要。而动物模型有明确惠普Th1程控疾病,临床研究调查患者细胞因子的惠普并没有被报道。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们确定一个优势IFN-γ-producing T细胞获得的支气管肺泡灌洗液(BAL T),但不是从外围血液T细胞(PB T),在惠普的病人。Th1概要文件的潜在机制的发展在惠普调查解决内生代细胞因子il - 10、il - 12的影响以及外源性il - 10和il - 12在IFN-γ生产。血液单核细胞和肺泡巨噬细胞的贡献,这一过程也被调查。这些研究显示,第一次,偏振相关细胞因子1型BAL患者T细胞从惠普和识别因素可能导致这种情况的发展。gydF4y2Ba

6个病人,所有非吸烟者,被诊断为惠普根据临床症状,积极的环境挑衅测试,具体的Abs的存在,特点表现在高分辨率计算图形(HRCT)发现,典型BAL的发现,典型的临床过程。三个患者分为有夏过敏性肺炎引起的gydF4y2Ba毛孢子菌属cutaneum,gydF4y2Ba而其余三名患者被诊断为农民的肺。这些患者接受类固醇治疗的时候检查。gydF4y2Ba

在所有情况下矿山进行正确的中部叶之前报道(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),使用三个整除(每50毫升)无菌生理盐水。后立即洗胃,洗胃液体通过纱布过滤到50毫升锥形管。管离心机在150×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C,和剩余颗粒resuspended洗了三次RPMI 1640介质(生活技术,大岛,纽约)。细胞终于悬浮在RPMI 1640补充10%的边后卫,5×10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}我,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。细胞的差异是由cytocentrifugation和染色使用Diff快速染色(Hareco Gibbstone,新泽西)。gydF4y2Ba

准备的T细胞,他们放置在37°C 5%的玻璃餐具有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1 h。轻轻不依从细胞收集和用作BAL T细胞和贴壁细胞收集广泛的移液和后用作aveleolar巨噬细胞(AM)。超过95%的不依从细胞CD3阳性由FACScan(正欲,山景,CA)和> 97%的贴壁细胞是肺泡巨噬细胞由形态学和酯酶染色法。总回收BAL细胞分别为2.9±1.2×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞对惠普的病人相比,0.3±0.1×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞获得健康控制。淋巴细胞百分比与球在惠普85.7 [pusmn] 5.2病人和正常对照组11.5±3.8,平均CD4 / CD8比值为0.72 1.85夏惠普和农民的肺。gydF4y2Ba

肝素化外周血之前获得每一个主题的过程。准备PB T细胞,获得的PBMC Ficoll-Hypaque密度离心悬浮在RPMI 1640中有10% FCS和培养在5%的玻璃餐具有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在37°C 1 h。轻轻glass-nonadherent细胞收集并进一步枯竭的单核细胞和B细胞通过nylon-wool列通过它们。最后,细胞被消极的选择使用丰富的混合物马伯反抗细胞特定类型标记B细胞(CD19)和NK细胞(CD16),其次是immunomagnetic珠子涂有羊anti-mouse免疫球蛋白(M450 Dyna-Beads;Dynal,挪威奥斯陆)。这个协议经常导致CD3 > 98%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba落下帷幕T细胞或T细胞纯化从外周T细胞通过负选择使用anti-CD4 anti-CD8 Abs和磁珠的选择。这些净化T细胞或T细胞在培养基resuspended子集(RPMI 1640含10% FCS, 2我(10gydF4y2Ba^{−5gydF4y2Ba}米)、100 U /毫升青霉素和链霉素100μg /毫升)。CD3的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba流式细胞仪细胞人口超过95%,评估。Glass-adherent单核细胞被密集的移液使用冷介质(4°C)和在培养基resuspended之前使用。gydF4y2Ba

落下帷幕的T细胞和PB T细胞的细胞密度停牌2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba/毫升培养基然后乘24-well培养板(配角、剑桥、马)。每个也包含2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaT细胞和2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaAMs或单核细胞1毫升的培养基。这些细胞被刺激与可溶性OKT3马伯(10 ng / ml)落下帷幕的T细胞和PB T细胞,存在或缺乏的最佳剂量的人类rIL-10 (10 ng / ml;圣地亚哥PharMingen CA),人类rIL-12 (5 ng / ml;礼物m .小林遗传学研究所、剑桥、MA)、il - 10 + il - 12 24或48小时在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。在某些情况下细胞刺激也进行了使用固定化anti-CD3和anti-CD28 Ab。对于那些文化1μg Ab被添加到每个在室温下对2 h。井与介质洗之前添加细胞。结果使用固定化Ab与获得可溶性Ab刺激完全相同,因此只显示可溶性Ab的实验的数据。细胞培养上清液被储存在前20°C−评估。gydF4y2Ba

细胞因子在每个细胞培养上清液和BAL流体通过ELISA测定。分析之前,BAL液集中10倍使用超速离心法通过Centricon-3(分子量截止3000 Da)膜。IFN-γELISA试剂盒为- 2,il - 12、il - 4、il - 10和购买从R & D系统(明尼阿波利斯,明尼苏达州)和PharMingen,分别。较低的酶联免疫试剂盒的检测限制每个细胞因子如下:- 2,6.0 pg / ml;il - 4、10 ng / ml;il - 10, 14 pg / ml;IFN-γ10 pg / ml;和白介素5 pg / ml。gydF4y2Ba

纯化BAL T细胞(1×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)、PB T细胞、单核细胞和AMs孵化在50μl染色缓冲区包含2% BSA和0.05%叠氮化钠(PBS) 15分钟在4°C 1毫克/毫升的存在正常的人类免疫球蛋白减少背景绑定通过Fc受体表达在细胞表面。细胞培养与特异性mAbs-FITC: CD3、CD4、CD8 T细胞和单核细胞CD14 (PharMingen)和我。评估CD80和CD86 Ag)表情单核细胞和,一个间接染色法进行了使用无标号anti-CD80或anti-CD86马伯(PharMingen)和FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g -特定的F (ab′)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaAb (PharMingen)。流仪分析细胞表面标记进行使用FACScan (Becton Dickinson) CellQuest软件。至少10000个事件为每个样本收集。在所有的实验中,消极的控制由老鼠免疫球蛋白g isotype-matched Abs。gydF4y2Ba

胞内细胞因子通过流式细胞仪检测使用一个修改的方法由荣格et al。(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。简单地说,对于每一个样品,2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaBAL T细胞或PB T细胞,1毫升的RPMI 1640有10%的边后卫,与12 -刺激gydF4y2BaOgydF4y2Ba-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) (10 ng / ml)gydF4y2BaA23187gydF4y2Ba(250 ng / ml)的brefeldin(2μM)。6 - 8 h后激活,细胞在PBS洗,细胞表面与anti-CD4染色gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba或anti-CD8-Quantum Red-conjugated Ab,然后细胞为20分钟2%甲醛固定,与PBS洗两次,和permeabilized PBS补充2% FCS,南2毫米gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba,0.5%的皂苷。在每个案例中,孵化是在室温下进行的。Permeabilized细胞孵化与anti-IL-4-PE马伯或anti-IL-2-PE马伯anti-hIFN-γ-FITC马伯在PBS / FCS /南gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba/皂素。孵化30分钟后在室温下,细胞被洗了两次相同的缓冲区,resuspended染色缓冲区(PBS补充南FCS为2%和0.05%gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba),并通过流式细胞术分析。这些研究的6 - 8 h点被选为避免任何副作用,由于长期暴露在莫能菌素,这通常发生在12 h。虽然这个时间点可能不代表最大生产的细胞因子,它足以确定相对生产外围vs lung-derived细胞。gydF4y2Ba

落下帷幕的T细胞和PB T细胞(2×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba24小时之前和之后)获得与TPA和刺激gydF4y2BaA23187。gydF4y2Ba细胞被洗,总RNA提取使用RNA STAT (Promega,麦迪逊,WI)推荐的制造商。逆转录酶反应生成cDNA进行用lamv逆转录酶(Promega)。PCR进行使用1μg cDNA、0.5μM寡核苷酸引物(每个),2毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,0.2毫米国家结核控制规划在最后50μl反应体积。三十放大周期进行(在94°C 1分钟;1分钟55°C;在72°C 1.5分钟)。下面列出了本研究中使用的PCR引物。放大后,一部分PCR反应在1%琼脂糖凝胶电泳和可视化使用溴化乙锭:β-actin: 5′底漆,5′-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT;3′底漆、5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG;IFN-γ:5′引物5′-GCTCTGCATCGTTTTTGGGTTCTCTTGGCTG;3′底漆、5′-CCTTTTTCGCTTCCCTGTTTTAGCTGCTGG;2:5′引物5′-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT; 3′ primer, 5′-GTCAGTTGTTGAGATGCTTTTGAC; IL-4: 5′ primer, 5′-ATGGGTCTCACCTCCCAACTG; 3′ primer, 5′-TCAGCTCGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCAT; IL-10: 5′ primer, 5′-AAGCTGCGAACCAAGACAGACA T; 3′ primer, 5′-AGCTATCCCAGAGCCCCAGATCCGG; and IL-12 RB2: 5′ primer, 5′-AGACACCCACTT ATACACTGAGTA; 3′ primer, 5′-AGAGGCACAAACACCAGAAGAAGAG.

表中的数据和数据表示为均值±SD。使用学生的统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试和信心的gydF4y2BapgydF4y2Ba使用< 0.05。gydF4y2Ba

探讨细胞因子的T细胞从惠普获得病人,BAL和PB T细胞在细胞培养中被激活的TPA和钙离子载体24 h .信使rna被收集并进行rt - pcr分析Th1、Th2细胞因子。如无花果所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,Th2细胞因子il - 4和il - 10的表达和Th1细胞因子IFN-γ和2可以发现BAL T细胞和PB T细胞。gydF4y2Ba

进一步确认是否有定量蛋白质差异特别是Th1、Th2细胞因子,单细胞胞内细胞因子进行了分析。孤立BAL和PB T细胞刺激TPA和钙离子载体A23187,为6 - 8 h brefeldin的存在。胞内细胞因子生产BAL T细胞在单个细胞水平进行了分析,从而允许使用新鲜细胞也进一步分类和CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba。如无花果所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,IFN-γ-producing BAL中CD4细胞的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞明显高于PB CD4之一gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。这一比例的IFN-γ-producing细胞CD4大约是相同的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。相反,IL-4-producing BAL中CD4细胞的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba明显低于PB CD4 T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。再次,同样的比率CD4的观察gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。相对定量的单个细胞产生的细胞因子表明没有明显差异之间BAL CD4细胞内细胞因子il - 4和IFN-γ强度gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4 T细胞和铅gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(数据没有显示)。这些结果证实了rt - pcr结果,数据明显表明一种1-dominant概要文件中落下帷幕,但不是PB T细胞惠普的个人。gydF4y2Ba

除了IFN-γ之外,另一种类型1-defining细胞因子- 2。相比我们的下一个细胞内刺激BAL和PB - 2生产T细胞。如无花果所示。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,有两个细胞群之间的显著差异。IL-2-producing BAL中CD4细胞的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba惠普患者的T细胞明显低于PB CD4的观察gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。此外,BAL CD4细胞内强度- 2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba明显低于PB CD4 T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。统一所有个人观察测试,很大比例的是包含在CD4细胞内IL-2-positive细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT人口只有CD8中包含几个百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞群BAL和外围细胞(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)。这些细胞在IFN-γ生产的背景下进行分析。有趣的是,大多数IL-2-producing CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba拜尔与IFN-γ-producing T细胞与细胞(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba和表gydF4y2Ba我gydF4y2Ba),而大多数IL-2-producing CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPB T细胞集群优先与T细胞不表达IFN-γ蛋白质,列为Th0细胞(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba和表gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)。这表明,主要的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba惠普BAL细胞中T细胞类型可分为高度极化效应Th1细胞。gydF4y2Ba

接下来我们研究什么因素(s)可能会影响发展的观察1型细胞因子的平衡惠普患者的T细胞。我们推测细胞因子1型可能开发的结果少BAL T细胞生产内在il - 10和/或更多的il - 12的刺激而刺激血液T细胞。确定这是一个因素,我们测量了内在的细胞培养上清液中il - 10水平BAL T细胞或PB T细胞刺激与可溶性OKT3 Ab (sOKT3)和cocultured和单核细胞,分别。如无花果所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bacocultured sOKT3-stimulated BAL T细胞,是产生明显不如PB内在il - 10 T细胞和单核细胞cocultured。这种较低的内在以平衡细胞分泌il - 10可能倾向于开发或偏振的1型剖面BAL惠普患者的T细胞。没有进一步增加il - 10生产球T细胞刺激时TPA和离子载体(数据未显示),表明这些细胞不能产生尽可能多的il - 10 PB T细胞即使在最大刺激条件。此外,我们测量细胞培养上清液中il - 12水平sOKT-3-stimulated BAL细胞和PB T细胞。两种细胞类型产生可检测的白介素10 (10 - 20 pg / ml /gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞)和两种文化之间没有显著差异(数据没有显示)。gydF4y2Ba

我们下一个决定是否加入il - 10或白介素可能影响IFN-γ生产。BAL T细胞或PB T细胞刺激与可溶性anti-CD3 Ab(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在自体或血液单核细胞,分别或il - 10 (10 ng / ml)、白介素(10 ng / ml),或两者的结合细胞因子24 h(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。在图确认。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2BaIFN-γ生产由PB BAL T细胞几乎是两倍的T细胞。的il - 10的相对比例显著降低IFN-γPB T细胞(图生产。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba),类似于以前的报告(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。il - 10的影响不大,尽管仍然重要,IFN-γBAL T细胞(图生产。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。的il - 12在IFN-γBAL T细胞诱导显著增加产量,BAL T细胞,但对PB T细胞没有明显影响。il - 10、il - 12的结合没有影响BAL T细胞代IFN-γ而PB与il - 10 T细胞减少类似于证明单(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。抑制il - 10对IFN-γ生产活动是具体的,是聚集有关的中和anti-IL-10 Abs废除il - 10的效果。因此,PB和BAL T细胞对il - 10,尽管PB细胞在更大程度上比落下帷幕。此外,只有BAL T细胞对il - 12的刺激。我们也调查了这些细胞因子il - 4的影响生产和确定il - 4是由拜尔和PB T细胞相对,和任何一种情况il - 4生产影响的il - 10(数据没有显示)。总的来说,这些结果说明BAL惠普患者的T细胞优先生产IFN-γ刺激时sOKT3 cocultured我即使在il - 10的存在。相反,il - 10显著抑制生产的IFN-γcocultured sOKT3-stimulated PBT细胞和单核细胞。gydF4y2Ba

前文化用于生成数据包含我和血液单核细胞。这些辅助细胞已被证明可以扮演一个角色在il - 10的影响il - 12生产因此IFN-γ生产(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)。落下帷幕的反应的差异和PB T细胞il - 10可能表明,驻留在辅助细胞的区别。调查这种可能性我们首先确定是否存在表型差异的表达或者B7-1 (CD80)或B7-2 (CD 86),膜蛋白可以影响T细胞的细胞因子的开发(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。肺泡巨噬细胞和血液单核细胞与惠普患者隔离,并评估了B7-1或B7-2的表面表达。如无花果所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,70 - 80%的细胞来源于肺或外围B7-2是积极的。我同样没有区别或单核细胞B7-1表达式,虽然只有20 - 30%的细胞阳性B7-1表达式(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。B7-1或没有区别B7-2表情是惠普之间的病人和正常对照组(数据没有显示)。这些数据表明,B7-1或B7-2表达式可能不参与优惠Th1细胞发展在惠普的病人。gydF4y2Ba

没有差异的表达B7-1 AMs和单核细胞和B7-2分子,我们下一个调查是否存在功能差异和评估潜在的影响由PB IFN-γ生产T细胞。在这些实验中PB T细胞被负选择净化> 97%。塑料附着浓缩自体或外周血单核细胞(2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba/)被添加到PB T细胞培养和刺激sOKT3 Ab 24 h。我和单核细胞被添加的比例9:1 T细胞是复制的平均比例在外周血。文化收到了il - 10 (10 ng / ml)或il - 10 + il - 12 (10 ng / ml)。如无花果所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,IFN-γ生产sOKT3-stimulated PBT cocultured与AMs是抑制il - 10类似程度cocultured PB T细胞和单核细胞。il - 12的存在无法扭转IL-10-induced抑制IFN-γ生产(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这些结果表明,在这个文化系统是惠普患者血液单核细胞在功能上没有什么不同的来自同一个人,而且缺乏反应BAL T细胞il - 10的刺激并不是因为表型差异。gydF4y2Ba

监管IFN-γ生产部分由T细胞促进il - 10、il - 12的相对量。到目前为止我们发现,BAL T细胞产生il - 10比PB T细胞在相同的刺激条件下。我们也观察到,PB T和BAL T细胞产生类似水平的il - 12。有趣的是,IFN-γ生产PB T细胞不受外部刺激与il - 12,并且影响而BAL T细胞表明显著增加。探讨这种差异我们下个决心IL-12R的表达水平。最优的il - 12的绑定需要表达β,亲和力高,组件的IL-12R (IL-12Rβ2)。IL-12Rβ2水平检查如果PB, rt - pcr BAL T细胞。如无花果所示。gydF4y2Ba8gydF4y2BaIL-12Rβ2,BAL T细胞包含消息,而PB T细胞没有检测到消息。这一发现将支持PB vs BAL T细胞的观察差异生成IFN-γ白介素刺激和后,结合发现BAL T细胞产生il - 10,可以提供一种机制,通过这种机制BAL T细胞在惠普开发Th1剖面的影响。gydF4y2Ba

有越来越多的证据表明,惠普主要是由Th1细胞因子(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。使用动物模型的惠普,Hunninghake et al。(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)报道,IFN-γ需要惠普的发展,作为IFN-γ基因敲除小鼠对疾病的发展。体外研究表明完成IFN-γ的调制主要由il - 10、il - 12的比率的变化出现在文化系统。刺激了il - 10,通过几种不同机制(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba减少生产IFN-γ)行为。相反,刺激IFN-γ生产的il - 12的结果增强T细胞(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。与这些研究结果一致,惠普动物模型表明,il - 12的增加导致惠普的严重程度的放大,而il - 10的存在改善了疾病(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。目前尚不清楚是否存在同样的模式在人类和机制(s)有助于发展主要Th1概要文件。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们调查了Th1、Th2细胞因子的生产BAL T细胞和PB惠普患者的T细胞。胞内细胞因子检测的结果在单细胞水平产生了一些有趣的发现。胞内细胞因子分析流式细胞术清楚地演示了BAL CD4 Th1-dominant概要文件gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞、CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。虽然Th1细胞因子(IFN-γ)出现在PB T细胞阳性细胞的比例仅为30%,在落下帷幕的细胞。当IFN-γ-producing细胞和细胞间的相关性- 2生产检查,这是确定落下帷幕CD4的比例显著降低gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba生产与PB - 2 CD4 T细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞。我们的数据表明,在惠普的发展似乎依赖于IFN-γTh1细胞因子,它不与另一个Th1细胞因子的生产,2。这些发现符合Semenzato和同事的研究(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)报道,没有- 2 mRNA表达休息BAL患者T细胞从惠普,此外,与以前的工作从这个实验室(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),这表明BAL CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞下降- 2 mRNA的表达和产生显著的低- 2当这些细胞与TPA和刺激gydF4y2BaA23187gydF4y2Ba相比之下,PB T细胞。有人建议,更视为适当的标志- 2前兆Th细胞而不是Th1细胞,细胞,主要生产IFN-γ或由前体Th CD4的il - 4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞应该指定效应Th1、Th2细胞,分别为(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。因此,我们的数据表明,PB惠普患者的T细胞是由Th0, Th1、Th2细胞类型,但主要是Th2-like虽然BAL同一病人Th1-like T细胞,此外,Th1-like CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaBAL惠普患者的T细胞可以被认为是极化效应Th1细胞。gydF4y2Ba

对il - 4生产、IL-4-producing CD4的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞明显低于在PB T细胞;然而,在绝对数字,大量IL-4-producing T细胞在惠普患者的肺部被发现。如果IL-4-producing T细胞,除了其他IL-4-producing细胞如肥大细胞(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba的肺),坚持足够的时间,他们可能有助于惠普患者的肺纤维化瘢痕。gydF4y2Ba

一个主要因素,通常影响要么Th1、Th2细胞因子的发展当地的细胞因子环境、特别是白介素il - 10的比例。il - 10支持Th2发展的优势,而il - 12喜欢Th1扩张(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。与anti-CD3 Ab BAL细胞刺激,我们观察到显著降低il - 10与刺激PMBCs相比生产。il - 10的产量下降可能是多种因素造成的。单核细胞的细胞不能仅仅作为il - 10的主要来源(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba),但是他们可以刺激生产的il - 10 T细胞。单核细胞的细胞在文化中,他们的贡献研究il - 10生产。没有差异表达的costimulatory CD80分子(B7-1)或CD86 (B7-2) AMs惠普患者与血液单核细胞相比,表明生产的差异并不是由于单核细胞的细胞刺激T细胞il - 10的能力生产。单核细胞的细胞似乎也没有il - 10的来源,为培养AMs PB T细胞导致类似的il - 10水平与单核细胞和PB T细胞。因此,似乎缺乏il - 10在球细胞培养生产不能归因于不同单核细胞的细胞,但是,相反,是由于不同T细胞产生细胞因子的能力。这些细胞表现出无法生成尽可能多的il - 10 PB T细胞即使刺激TPA和ionomycin。缺乏il - 10的生产不是广义抑制的结果,作为生产的il - 12相媲美,在PB T细胞。gydF4y2Ba

增加肺的T细胞的来源,一般来说,是由于招聘外周T细胞在肺而不是克隆扩张(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。然而,这并没有解决特别是HP-related炎症,尽管它提高的可能性,一旦招募到肺外周T细胞,与惠普相关监管机制存在于招募的肺容量减少细胞产生il - 10。il - 10的降低矿山生产的T细胞可能导致Th1-dominant细胞因子的发展概况。不幸的是,直接ELISA测定il - 10中包含BAL流体已经难以实现对正常人和惠普的病人。gydF4y2Ba

另一个因素的发展Th1概要文件il - 12的影响。发现了类似水平的il - 12在球和PB T细胞培养;然而,添加白介素BAL T细胞导致显著增加IFN-γ生产,而没有生产PB T细胞的变化。刺激的il - 12可以由il - 12的含量或IL-12R的状态。高亲和力il - 12的绑定和信号只能通过表达il - 12的β-chain R,这创造了一个高亲和力复杂。没有β-chain消息可以检测到在PB T细胞,而这是很容易检测到BAL T细胞。有趣的是,il - 12高亲和力受体已被证明是优先Th1细胞表达(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。高亲和力受体的存在复杂的Th1子集可以解释后的微分响应由两个T细胞组il - 12和可能导致的整体发展和扩张Th1细胞与惠普。gydF4y2Ba

总的来说,这些研究首次表明,CD4细胞的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞进入肺部的个体与惠普主要Th1细胞因子。有一个显著增加IFN-γ生产;然而,这是不同于生产- 2。符合这个Th1概要,BAL T细胞不能产生类似的il - 10水平与PB T细胞相同的患者,和BAL IL-12R T细胞检测和功能性高亲和力,而PB T细胞缺乏β-chain高亲和力的消息。在人类,我们的研究表明,惠普已经在动物模型,是一种Th1-mediated疾病,这种疾病的发展类似于结节病,可能与il - 10的变化有关生产和IL-12R表达式通过T细胞的招募到肺。虽然我们的数据展示Th1-type响应明显所有惠普患者研究,我们我们可以招募的患者数量有限,因此,还需要进一步的研究来证实我们的发现。gydF4y2Ba