文摘
因为朗格汉斯细胞(LC)外围lymphostimulatory差的组织通常是“不成熟”的细胞活动,免疫反应的贡献由LC肺LC组织细胞增生症的发病机理(禄)已经被确定。在这项研究中我们证明了LC积累在禄肉芽肿表型相似lymphostimulatory成熟树突状细胞在淋巴器官。信用证在禄肉芽肿强烈表示B7-1和B7-2分子,而正常肺信用证和信用证积累在其他肺部疾病病理没有表达这些costimulatory分子。B7的存在+LC在禄肉芽肿在这些病变与表达相关,但不是在肺的其他网站,一个独特的细胞因子(gm - csf, TNF-α,IL-1β和il - 10)的缺失,是促进LC进入细胞的体外分化表达lymphostimulatory表现型。最后,禄肉芽肿是唯一地方CD154-positive T细胞可以识别与LC强烈表达CD40 Ags密切接触。综上所述,这些研究结果强烈支持的异常免疫反应由LC可能参与肺禄的发病机制,并建议治疗策略旨在修改LC的lymphostimulatory表型可能是有用的治疗这种疾病。
肺朗格汉斯细胞(LC)3组织细胞增生症(LCH),也称为组织细胞增生症,是一种罕见的来历不明的疾病,其特征是存在破坏性的肺肉芽肿包含大量的LC (1,2)。引人注目的是,华尔街日报的肉芽肿病变以细支气管,唯一的网站正常的人类肺LC,树突细胞(DC)家族的成员,被发现(1,2,3,4)。
华尔街日报的发病机制还不了解。几个参数,然而,这种障碍是支持假设的结果异常免疫反应由LC (2)。首先,信用证的主要功能在肺癌和其他组织样本Ags的当地环境,处理蛋白质,和现在产生的抗原肽与MHC分子T细胞,从而激发免疫反应(5)。第二,LC和T淋巴细胞的主要细胞类型出现在早期病变肺禄(2),两种细胞类型之间的密切接触者,所观察到的相同的皮肤过敏反应过程中经常观察到肺禄肉芽肿(6,7)。第三,如预期的T细胞应对外在Ags LC, T淋巴细胞浸润早期肺禄病变主要是CD4细胞+T细胞表达α/β细胞(7),并依据当地提供了活化的淋巴细胞(8)。
然而,相当多的证据表明,普通LC外围组织,包括肺LC、激活T细胞原位(能力有限5,9,10)。相反,组织信用证被认为Ags作为哨兵,贪婪地内化过程,但只有随后迁移到区域淋巴结和进一步分化他们获得能力刺激T细胞(5)。这个时空分离的功能能力LC在外围组织和淋巴器官被认为是一个重要的机制不当对无害的吸入Ags肺免疫反应是可以避免的。因此,免疫反应的发展由LC在肺禄意味着因素的存在,不仅增加他们在疾病的网站,而且还增强本地激活T细胞的能力。
在这方面,B7分子的相互作用(B7-1 B7-2) DC / LC与CD28表达的受体表达的T细胞是至关重要的优化T细胞激活(引用文献综述。11)。肺LC的表达B7分子的人尚未评估,但预计将为细胞lymphostimulatory活动较弱,LC中正常的人类皮肤和肺直流新鲜隔绝啮齿动物已被证明是B7 - (10,12,13)。相比之下,这些细胞在体外培养时,调控的表达B7分子的表面,获得强劲lymphostimulatory活动(12,13,14)。一些细胞因子已确定调节表面表达B7分子的DC / LC体外,可能参与收购lymphostimulatory活动由DC / LC在淋巴组织(11,13,15,16,17)。此外,细胞因子也可以调节细胞的表达CD40 DC / LC血统,和结扎CD40配体的CD154表达的T细胞也能导致B7的表达,从而提高这些细胞的lymphostimulatory能力(18,19,20.)。
如果信用证中出现大量禄病变负责启动肉芽肿原位免疫反应异常,这些细胞,但不正常的信用证,将有一个immunophenotype兼容的表达强烈lymphostimulatory活动。在这项研究中我们证明这是事实。信用证在禄肉芽肿强烈表达B7-1和B7-2,而正常肺LC和肺在其他病理情况是B7 - LC积累。进一步评估允许几个因素的识别独特的禄肉芽肿可能促进这种lymphostimulatory LC的发展。
材料和方法
组织标本
肺禄。患者肺组织获得五肺禄(三男两女,34±11年;所有吸烟者)的时候打开胸廓切开术。特性包含众多CD1a肉芽肿+信用证是出现在所有样本。信用证被明确识别在电子显微镜级别的存在许多Birbeck颗粒。
正常肺组织、瘤旁肺组织和肺癌症。
肺组织当时获得10个病人胸廓切开术的本地化肺部病理。五个病人(四个男人和一个女人,60±13年;所有不吸烟者)良性病理。5个患者原发性肺癌(四个男人和一个女人;60±14年;所有吸烟者)。肿瘤的组织学类型如下:腺癌(n= 3)和鳞状细胞癌(n= 2),肿瘤组织,组织立即毗邻癌,极不正常的肺组织(在一个网站远离病变或从不同的叶)分别进行评估。不吸烟患者肺组织是正常的。从吸烟者的肺组织和瘤旁组织显示肺泡壁轻度弥漫性或局灶性纤维变化,积累pigment-laden巨噬细胞、肺泡上皮增生。所有肿瘤和瘤旁组织包含在本研究被CD1a严重渗透+信用证如前所述(4)。
小鼠组织。
C57BL / 6转基因雌性老鼠的基因编码il - 10中断(il - 10淘汰赛(KO)小鼠),和C57BL / 6野生雌性老鼠从杰克逊实验室获得(巴尔港,MA)。老鼠牺牲由戊巴比妥钠注射后,肺,脾,舌头,和耳朵被移除。点头小鼠的胰腺,慷慨地提供的c . Boitard博士(国家卫生研究所́et de la矫揉造作的我́dicale U342,巴黎,法国),这曾被DC-expressing渗透B7分子,也被评为积极控制(21)。
免疫组织化学技术
马伯用于人体组织如下:anti-CD1a (BL6 Immunotech,马赛,法国);anti-CD80 (anti-B7-1 MAB104 Immunotech);anti-CD86 (anti-B7-2 B70 PharMingen,圣地亚哥,CA);anti-CD40 (MAB89 Immunotech);anti-CD154 (Genzyme、剑桥、马);,正欲anti-CD3 (Leu-4圣何塞,CA);anti-CD4 (Leu-3a + b Multiclone Becton Dickinson);正欲anti-CD8 (Leu-2);正欲anti-CD28 (CD28.2);反IL-1β(Genzyme); anti-human GM-CSF (Genzyme); anti-human TNF-α (Serotec, Oxford, U.K.); and anti-human IL-10 (JES3–12G8, PharMingen). Isotype-matched Abs (MOPC 21, anti-IgG1; MOPC 141, anti-IgG2, Sigma, Saint Louis, MO) were used as controls. Rat mAbs used for murine tissues were as follows: anti-CD80 (anti-B7-1, 1G10, PharMingen); anti-CD86 (anti-B7-2, GL1, Serotec); and anti-MHC class II (NIMR4, Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). An isotype-matched Ab (R35-95, PharMingen) was used as a control.
免疫组织化学染色,立即组织碎片被冻结在液体N2并存储在−80°C到使用。低温恒温器部分,4 - 6毫米厚,被固定在丙酮和适当稀释的Ab反应。对人体组织,积极的细胞被发现使用Vectastain ABC-alkaline磷酸酶装备系统(向量实验室,伯林盖姆,CA)和快红底物。鼠标组织样本的反应顺序与二级生物素化的兔子anti-rat免疫球蛋白Abs以前吸附对老鼠Igs(向量实验室),avidin-alkaline磷酸酶复合物(向量实验室),和快红底物。测试免疫染色的特异性,Abs被忽略或被isotype-matched控制Ab取代。在这些情况下没有发现阳性细胞。免疫染色强度的等级从0(缺席)+ +(强阳性);之间的完整协议获得了两个独立的观察者。
结果与讨论
B7的表达由肺信用证和信用证在禄肉芽肿
LC强烈表达CD1a Ags观察正常的肺细支气管上皮在所有样本内获得不吸烟者,和展出特色长胞质过程之间插入上皮细胞(图1,一个)。串行部分,没有表达B7-1或B7-2这些细胞可以发现(图。1,B)。如前所述(4),没有出现在正常的肺泡LC实质,但地区从吸烟者的肺组织肺泡上皮增生被CD1a渗透+LC(数据没有显示)。尽管信用证在这些网站大量积累,没有细胞表达B7分子能被识别。同样,肺部癌包括在这项研究被CD1a严重渗透+细胞树突形态特征和长胞质过程之间的夹层的恶性肿瘤细胞(图1,C)。在所有情况下,串行部分B7-1和组织化学染色B7-2没能证明任何阳性细胞(无花果。1D)。
局部细胞因子概况与肺LC B7分子的表达
如上所示,LC在禄肉芽肿强烈表达B7-1 B7-2,但在同一切片,LC冷漠细支气管和肺泡的领域从肉芽肿增生遥远的过程没有表达B7分子。因此,B7的表达并没有从这些病人和LC的固有属性表明肉芽肿病变的局部环境的差异导致了这些costimulatory分子的诱导表达。因此,我们评估的存在已知细胞因子调节B7的表达在LC肉芽肿和地点LC不表达B7分子被发现。
正如我们以前所示(4),gm - csf表达被发现在所有网站LC肺在场,无论B7分子表达的LC(数据没有显示)。同样,TNF-α大量表达了正常的细支气管上皮细胞,增生的肺泡上皮细胞,如前所述,(22),所有的肺部癌。在禄肉芽肿,信用证本身的主要细胞类型表达gm - csf和TNF-α,虽然少量巨噬细胞浸润病变,如肺泡巨噬细胞在正常的肺,还强烈表达这两种细胞因子。因此,尽管这些细胞因子可能是重要的在招聘LC肺上皮细胞和维持细胞生存能力,他们的存在并不足以诱导的表达B7分子肺LC体内。
相反,细胞因子il - 10的存在,校长能够显示的表达B7分子由DC / LC体外(13,15,16,17)强烈与没有这些costimulatory分子在LC标本的表达进行了研究。il - 10表达的强烈正常细支气管上皮细胞,增生的肺泡上皮和肺癌(无花果。2,得了),地点B7 - LC被发现。相反,il - 10中没有检测到禄肉芽肿(无花果。2D)。
B7分子的表达之间的相关性肺LC和微环境的这些细胞产生的细胞因子。细支气管上皮细胞(一个)、增生性肺泡上皮细胞(B)和肺癌(C),网站缺乏积极的LC,产生il - 10,而肺LC肉芽肿(D),它包含强烈B7积极的LC,经常-细胞因子。所有网站IL-1β正il - 10的负(E,F,G),而LC肉芽肿是强烈的阳性细胞因子(H)。原始的放大,×250。
的表达IL-1β的镜像,观察il - 10,即。,this cytokine could not be detected in normal bronchiolar epithelium, hyperplastic alveolar epithelium or lung carcinomas (Figs.2,eg),但所表达的强烈LC肉芽肿(无花果。2H)。未能检测在肺癌IL-1β或正常,增生的上皮细胞并不是一个技术工件由于肺泡巨噬细胞和肺内皮细胞,细胞群的分布是不同的LC,阳性的细胞因子在所有活检(数据没有显示)。
评估il - 10的缺席是否足以允许B7分子表达的LC的外围组织,我们比较B7-1和B7-2上皮内LC的表达在正常和转基因小鼠il - 10 K / O。直流表达II级分子很容易确定气道上皮的表皮和野生型小鼠和il - 10 K / O(无花果。3,一个),但是串行部分的评估表明,这些细胞被B7-1 B7-2负(图。3,B和C)。这些结果不可能简单地归咎于无法识别B7分子,因为野生型和il - 10 K / O小鼠的脾脏和胰腺的点头老鼠都渗透了大量的直流,强阳性B7-1和B7-2分子(数据没有显示)。因此,这些结果表明,il - 10的缺席,尽管可能有必要,是不够的,允许的表达B7分子costimulatory LC的外围组织。
表达CD40和CD40配体(CD154的)
因为CD154-positive T细胞之间的交互和DC / LC表达CD40 Ags可以调控的表达B7分子由DC / LC (18,19,20.),我们也评估这些分子的表达。所有信用证出现在华尔街日报病变强烈表达CD40;染色强度和阳性细胞的分布非常相似,观察B7-1和B7-2(无花果。4一个)。T细胞肉芽肿内目前没有表达CD40(数据未显示)。的表达CD40 LC在正常细支气管上皮和浸润的肺泡上皮增生不能评估,因为肺上皮细胞强烈表达这种Ag)。然而,有趣的是,CD40无法检测到许多LC肺浸润癌。
T淋巴细胞中大量数字LCH肉芽肿,LC之间点缀和周围的病变。大多数的CD4 T淋巴细胞+,尽管CD8 T细胞+T淋巴细胞也在场,优先在肉芽肿的外围。在所有患者中,大多数的这些T细胞CD28+。引人注目的是,∼30%的淋巴细胞与禄肉芽肿CD154表达(无花果。4B)。值得注意的是T细胞存在于正常的人类肺的航空和实质是统一对CD154不利,而T细胞存在于地区患者的活检禄无关的肉芽肿性过程也CD154为阴性。同样,尽管许多CD3+/ CD28+T淋巴细胞渗透到肺部癌,有时在令人印象深刻的数字,没有观察到细胞CD154表达。
Lymphostimulatory LC和肺禄
我们的研究结果表明,在正常的人类支气管上皮内LC和LC渗透网站肺肺泡增生和癌不表达B7 costimulatory分子原位,发现所观察到的类似人类表皮LC和啮齿动物的肺上皮内直流(10,12,13)。这些发现符合肺LC的想法是不成熟的细胞,可以捕获和外生Ags过程,但无法在本地产生免疫反应。形成鲜明对比,LC禄肉芽肿强烈表达B7-1 B7-2,和CD40因此表型的典型“成熟”DC / LC中发现淋巴器官,细胞表达强烈lymphostimulatory活动(5)。
正如前面所讨论的,各种参数支持这个想法,LCH结果从一个由LC控制免疫反应(2)。我们的发现添加额外的支持这一假设,因为他们解释这些LC,尽管他们的位置在一个组织中不成熟的LC通常存在,能够提供必要的costimulatory信号对T细胞活化。我们的结果也给洞察为什么LC禄肉芽肿可能发展自己的不寻常的lymphostimulatory表型。我们发现细胞因子环境在华尔街日报的网站肉芽肿具有独特的特点,特别是存在IL-1β和il - 10的缺席,吉祥的LC的成熟人群表达B7分子CD40的高水平。这些病变的存在大量的T细胞表达CD154的配体表达只有短暂激活后,支持这个想法,LC确实是激活T细胞原位。
这些研究,评估建立LCH肉芽肿,不提供洞察机制负责流程的起始。在这方面,它最近表明,LC患者的病变扩散禄和本地化形式的克隆起源的疾病(24,25)。然而,一些证据强烈反驳认为成人肺禄是一种恶性疾病,包括高比例的自发缓解肺禄,LC的增殖率非常低肺LCH肉芽肿,和虚拟缺乏LC年末病变(2,26)。然而,克隆LC可能异常,使的起始过程,如细胞因子引起的灵敏度增加成熟或缺陷干扰LC对区域淋巴组织的动员。肺禄也与吸烟密切相关,和吸烟引起的免疫/炎症反应在外围航空公司可能需要启动异常分化的LC (27)。这些最初的事件后,几个途径,忙禄的持久性包含lymphostimulatory LC的肉芽肿在这些研究确定。首先,LC肉芽肿破坏细支气管上皮细胞,从而消除唯一il - 10的当地来源。第二,LC禄肉芽肿自己被证明产生gm - csf, TNF-αIL-1β,细胞因子,能促进新到达的LC的成熟。最后,强烈的表达CD40的LC禄肉芽肿,T细胞表达CD154的存在将推动CD40 - CD154的交互B7-1和B7-2 LC的表达增加,诱导细胞因子的生产,提高LC的lymphostimulatory活动。
总之,本研究进一步支持,免疫反应由LC参与成人肺禄的发病机理和提供证据,LC内病变的异常激活状态受细胞因子产生的影响当地的环境。这些发现表明,基于细胞因子生产的调制治疗策略可能是有用的在这个经常致残疾病,目前没有有效的治疗。同样,治疗由LC设计诱导costimulatory分子的表达可能有助于对肺部癌诱导免疫反应。
脚注
这项工作是支持的部分资金来自la Martine Midy基金会。
略语摘要:LC,朗格汉斯细胞;华尔街日报,LC组织细胞增生症;直流,树突细胞;KO,淘汰赛。