呼吸道合胞体病毒刺激中性粒细胞脱颗粒,释放趋化因子gydF4y2Ba

呼吸道合胞病毒(RSV)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba细支气管炎喘息儿童的一个主要原因是年龄小于2年(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这也是一个罪魁祸首4500人死亡,90000人住院每年在美国(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。气道炎症在RSV细支气管炎无疑是一个多细胞的过程中上皮细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞。释放多种细胞因子已被证明的RSV-stimulated上皮细胞il - 6等引发,IL-11, gm - csf,巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α,咆哮(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。上皮细胞一直被认为是主要的贡献者在气道的炎症过程RSV感染。gydF4y2Ba

然而,在过去的十年中,中性粒细胞和他们的产品已经在病人的航空公司和与RSV感染动物模型和毛细支气管炎(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),viral-induced哮喘(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),突然爆发致命的哮喘(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。因此,中性粒细胞炎症过程被认为是重要的RSV细支气管炎和急性哮喘。IL-1β等中性粒细胞可以释放多种细胞因子il - 6,引发,IL-11, TNF-α,TNF-γ,MIP-1α,MIP-1β,其中,IL-1β,il - 6 (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),并引发从RSV-stimulated中性粒细胞释放已经被证明。gydF4y2Ba

治疗,尽管糖皮质激素是最有效的代理在哮喘气道炎症,他们没有持续有效治疗RSV毛细支气管炎(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。它已经表明,地塞米松(dex)抑制组胺和白三烯BgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba释放嗜碱粒细胞(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),引发释放LPS-stimulated中性粒细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。然而,皮质类固醇的影响RSV-stimulated中性粒细胞激活尚未评估。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们证明了RSV刺激引发,MIP-1α,MIP-1β释放中性粒细胞,中性粒细胞脱粒。解释无效RSV的皮质类固醇治疗毛细支气管炎,我们评估了敏捷对上述细胞因子释放的影响和嗜中性粒细胞脱颗粒释放由髓过氧化酶(MPO)。gydF4y2Ba

以下试剂购买指定来源:玫瑰,淋巴细胞分离媒体,谷氨酰胺,敏捷,放线菌素d、多粘菌素B(σ,圣路易斯,密苏里州)试剂盒(生活技术,马里兰州),(gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP] UTP (Amersham,阿灵顿高地,IL), FCS, RPMI 1640(生活技术,大岛,纽约)。gydF4y2Ba

RSV的长期应变(A2)传播感染的细胞HEp-2(美式文化集合(写明ATCC),马纳萨斯,弗吉尼亚州;CCL 23)分部RPMI 1640中补充10% FCS和抗生素。当HEp-2细胞显示细胞病理学,上层清液离心机在11000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 6 h。然后病毒恢复通过离心DMEM 13500×30%的甘油gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 6 h小球病毒。RSV resuspended在包含100毫米MgSO缓冲区gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba氯化钠、50 mM玫瑰和150毫米,和整除储存在液氮直到用于实验。RSV浓度测定在HEp-2文化营养琼脂糖和空斑形成单位表示为每毫升。对所有实验中,一个新的瓶RSV迅速解冻,并立即使用。热失活的病毒(H-RSV)是通过孵化为45分钟在65°C;紫外线灭活(UV-RSV)是在一个Stratagene (CA)拉荷亚UV-stratalinker装置使用1800 mJ的紫外线辐射。模拟RSV股票(M-RSV)制备了以完全相同的方式作为RSV准备,除了HEp-2细胞没有RSV感染。gydF4y2Ba

中性粒细胞分离得到健康成人志愿者通过离心的静脉血淋巴细胞分离的媒体,如前所述(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。中性粒细胞细胞制剂通常包含> 98%,< 1血小板/ 100中性粒细胞由直接显微计数。gydF4y2Ba

中性粒细胞(10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba)是刺激与RSV莫伊(10)gydF4y2Ba,gydF4y2BaUV-RSV、H-RSV M-RSV同掺量(RSV),或100 ng / ml有限合伙人和孵化1毫升的RPMI 1640补充5% FCS和2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺在37°C公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。18 h后,细胞悬浮液离心,ELISA对趋化因子和MPO的上层清液进行了分析。细胞颗粒resuspended生理盐水和台盼蓝排斥法的可行性评估。gydF4y2Ba

引发、MIP-1αMIP-1β,MPO评估商用ELISA试剂盒(研发系统、明尼阿波利斯、MN)根据制造商的指示。gydF4y2Ba

所有解决方案用于隔离的RNA治疗0.1%焦碳酸二乙酯和丙二酸二乙酯与消毒或准备pyrocarbonate-treated HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bao .塑料吸管的技巧和管道都是处理只有手套和热压处理过的在240°C在干燥周期。gydF4y2Ba

中性粒细胞(3×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞/毫升)孵化有或没有RSV莫伊(10)RPMI 1640含5% FCS, 100μg /毫升每个青霉素和链霉素,2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,10毫米玫瑰表示*在37°C的14毫升聚丙烯圆底管振荡水浴。孵化项目被终止离心400×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为10分钟,细胞在4°C与PBS洗一次。总RNA分离试剂盒根据制造商的指示。细胞颗粒是通过22-guage针五到六次,放置到一个新的14-ml聚丙烯圆底管。氯仿(200μl / 1毫升的试剂盒)补充道,和样品在室温下混合大力和孵化2 - 3分钟。离心分离后的水相收集11000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C。RNA与相同体积的异丙醇沉淀在−1 h 70°C。gydF4y2Ba

核糖核酸酶保护试验(战)是使用从PharMingen商用工具执行(CA)圣地亚哥。总之,多功能探针(h-CK-5),其中包括趋化因子引发的模板,MIP-1α,MIP-1β,以及房子保持GAPDH基因,是贴上gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP] UTP使用T7 RNA聚合酶。标记探针(6×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Bacpm)杂化4的总RNAμg 16 h在56°C。ds信使rna探针杂交与核糖核酸酶治疗,其次是苯酚/氯仿抽提。保护杂交测序解决6%的变性聚丙烯酰胺凝胶,凝胶干燥后,被暴露在柯达(罗彻斯特,纽约)以下电影一夜−70°C。阴谋的移动探针与核苷酸长度是用来预测的迁移保护探测碎片。gydF4y2Ba

数据分析了Macintosh电脑使用Statview统计软件。数据表示为±SEM。测试之间的差异的重要性,分析了对照组使用学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试或方差分析。gydF4y2Ba

康尼锡等人证明引发释放RSV-stimulated中性粒细胞(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。然而,它还未确定是否通过noncytotoxic RSV-stimulated细胞因子释放机制。我们用台盼蓝染色法来确定隔夜孵化与RSV是中性粒细胞的细胞毒性。除了引发,中性粒细胞也表达和分泌CC-chemokines MIP-1α和MIP-1β与LPS激活(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。我们刺激中性粒细胞与RSV莫伊(10)或有限合伙人(100 ng / ml) 18 h在37°C和化验MIP-1α细胞培养上清液,MIP-1β,引发释放。我们发现,除了引发释放gydF4y2Ba,gydF4y2BaRSV也诱导MIP-1αMIP-1β释放。图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba表明RSV莫伊(10)诱导显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)MIP-1α(1153.4±384 pg / ml)和MIP-1β(2941±1213 pg / ml)版本相比,如果中性粒细胞。RSV引起的大约两倍MIP-1αMIP-1β释放作为有限合伙人。然而,差异无统计学意义。无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaBgydF4y2Ba表明RSV和LPS刺激趋化因子释放noncytotoxic的方式。gydF4y2Ba

由有限合伙人,以确定污染导致趋化因子释放RSV的刺激,我们添加了多粘菌素B(20μg /毫升)培养基。在六个实验,RSV引起的中性粒细胞趋化因子释放不受多粘菌素B的加入RSV-stimulated引发释放2459±160 pg / ml, 2549±227 pg / ml分别有和没有多粘菌素B。在同样的实验中,引发刺激由有限合伙人完全抑制多粘菌素B(483±160和30±21 pg / ml,没有多粘菌素B,分别)。类似的结果也看到MIP-1α和MIP-1β释放(数据未显示)。gydF4y2Ba

我们使用MPO的脱粒的标志主要中性粒细胞颗粒。图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表明,经过18 h的刺激,RSV引起147±29 ng / ml MPO释放而如果释放14±2 pg / ml (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。虽然LPS诱导的中性粒细胞趋化因子释放,它不刺激MPO释放。与趋化因子释放,RSV-stimulated MPO释放也是noncytotoxic(数据没有显示)。Cytochalasin-B没有增强RSV -或LPS-stimulated MPO释放(数据未显示)。gydF4y2Ba

确定HEp-2细胞组件RSV准备可能刺激中性粒细胞脱颗粒,我们比较与RSV M-RSV刺激释放MPO的另外三个实验。RSV刺激释放MPO (211±38 ng / ml)而M-RSV没有明显刺激释放MPO上面如果中性粒细胞(86±34和63±10 ng / ml,分别)。此外,M-RSV没有刺激释放MIP-1αMIP-1β或引发。gydF4y2Ba

确定可行的RSV是必要的刺激中性粒细胞脱粒和趋化因子的释放,我们与RSV刺激中性粒细胞,UV-RSV, H-RSV和测量MPO和趋化因子水平在上层的文化。无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba表明,失活的RSV紫外线辐射没有显著减少中性粒细胞释放MPO,与可行的RSV相比,但失活与热释放MPO降低了32% (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

康尼锡等人已经证明可行的RSV诱导中性粒细胞释放引发不是必需的(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。然而,我们发现,引发MIP-1α,MIP-1β释放显著减少中性粒细胞刺激与UV-RSV或H-RSV时,与可行的RSV (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2BaBgydF4y2Ba表明,紫外线和热失活减少所有三种趋化因子的释放80%以上。gydF4y2Ba

确定了皮质类固醇敏捷抑制RSV-induced中性粒细胞激活,我们评估敏捷趋化因子和MPO释放的影响。无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba表明,引发和MIP-1α释放显著抑制87% (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.03)和45% (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.05),分别由1μM敏捷。敏捷下降RSV-stimulated MIP-1β释放2941±1213 pg / ml - 1589±811 pg / ml。然而,差异没有统计学意义由于广泛的MIP-1β从五个捐助者的中性粒细胞释放测试。敏捷不显著抑制MPO释放在八个实验。RSV-stimulated MPO释放的数量是127±15.3 ng / ml,相比之下,108.8±6.4 ng / ml敏捷时补充道。gydF4y2Ba

确定趋化因子释放仍将抑制当敏捷了RSV的加入后,我们添加了敏捷在不同时间点前1 h ~ 4 h后RSV刺激。无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表明,敏捷显著地抑制引发和MIP-1α释放所有时间点添加时表示,有85%抑制引发即使敏捷增加了4 h后RSV刺激。gydF4y2Ba

确定RSV-induced趋化因子生产是依赖于转录和确定的抑制性影响敏捷的信使RNA合成,我们从中性粒细胞分离出RNA,进行区域规划评估趋化因子mRNA在1和3 h RSV刺激。图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba表明,在1和3 h与RSV刺激后,所有三个趋化因子mRNA水平高于如果中性粒细胞增加,和放线菌素d(10μg /毫升)抑制mRNA在两个时间点的增加而敏捷没有对RSV-stimulated信使rna合成的影响。无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaBgydF4y2Ba表明,当纠正GAPDH mRNA, RSV诱导增加mRNA MIP-1α和MIP-1β高于引发。gydF4y2Ba

与RSV婴儿毛细支气管炎,中性粒细胞占93%和76%的上、下呼吸道的炎症细胞,分别为(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。RSV感染期间,最初的介质(il - 6、引发和咆哮)出现在航空公司可能从上皮细胞(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。引发将导致大量中性粒细胞(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),这反过来又会进一步导致炎症的释放自己的趋化因子和细粒度的酶。我们目前的研究表明,RSV刺激的释放CC-chemokines MIP-1α和MIP-1β中性粒细胞。MIP-1α刺激嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞趋化作用和脱粒(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),导致这些细胞的招募和随后释放嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和组胺的航空公司。ECP和组胺所示RSV的呼吸道分泌物的婴儿毛细支气管炎(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

除了ECP和组胺,IgE水平也升高与RSV感染婴儿的鼻腔分泌物(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。MIP-1α增强IgE生产从人体表面IgE-positive B细胞(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。我们的研究表明,IgE生产期间RSV感染可能是由neutrophil-derived MIP-1α。gydF4y2Ba

MIP-1β是另一个CC趋化因子家族的成员。它的功能还没有被广泛地研究过了。MIP-1β不引入嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞的趋化性,也不刺激嗜碱细胞组胺和白三烯CgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba版本(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。在一项研究中,评价CC-chemokines对淋巴细胞增殖的影响,陶布说MIP-1β刺激Ag-specific Th2淋巴细胞增殖也让B7-1 apc (gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。因此,RSV-stimulated从中性粒细胞释放MIP-1β可能提高航空公司现有Th2淋巴细胞的增殖。gydF4y2Ba

中性粒细胞、引发和MPO还发现了在病毒诱导哮喘患儿的呼吸道分泌物(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。这表明嗜中性粒细胞的作用在病毒性呼吸道感染的病理生理学脱粒。我们证明了RSV刺激MPO释放,这是一个标志的脱粒中性粒细胞主要颗粒。中性粒细胞的主要颗粒也含有多种酶,包括弹性蛋白酶、胶原酶、阳离子蛋白,溶菌酶,破坏肺组织(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。特别相关的RSV-induced气道炎症是弹性蛋白酶。这种中性粒细胞颗粒酶诱发粘液分泌物杯状细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),哮喘的主要发现和RSV毛细支气管炎(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。虽然我们没有专门测量弹性蛋白酶在我们的研究中,我们发现RSV刺激释放MPO建议RSV也会刺激弹性蛋白酶释放。RSV-induced MPO释放以及趋化因子释放,从中性粒细胞noncytotoxic,台盼蓝排斥就证明了这一点。gydF4y2Ba

康尼锡等人表明RSV-induced引发生产从中性粒细胞是自然界中转录(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。我们发现增加MIP-1α和MIP-1β机制也在转录水平。RSV mRNA增加这两种细胞因子刺激后在1 h和3 h。预培养放线菌素d, RNA聚合酶抑制剂,减少RSV-stimulated MIP-1α和1βmRNA水平如果中性粒细胞。这表明RSV刺激新的信使rna,而不是稳定的生产如果中性粒细胞的基线信使rna。gydF4y2Ba

康尼锡表明可行的RSV刺激中性粒细胞释放引发不是必需的(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。然而,我们的数据没有证实这些先前的结果。我们发现可行的RSV是必要的刺激中性粒细胞趋化因子的释放。RSV的持久性刺激活动的股票与紫外线辐射和热失活后康尼锡等人的研究可能是由于有限合伙人污染,因为作者没有评估(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。与趋化因子释放,似乎可行的RSV不是绝对必要的刺激中性粒细胞脱粒。紫外线灭活并没有显著降低MPO释放,和热失活版本减少了只有32%。这些数据表明,虽然RSV感染的中性粒细胞趋化因子释放,需要交互的RSV与中性粒细胞细胞膜蛋白质或总量可能是足够的脱粒的感应。UV-RSV效力的差异和H-RSV脱粒的刺激可能解释为两种治疗方法的差异影响病毒。而紫外线治疗只影响病毒的传染性,也热失活病毒蛋白质的构象结构变化。gydF4y2Ba

敏捷已经显示出抑制引发释放LPS-stimulated中性粒细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。我们的研究表明,敏捷能够显著抑制引发释放87%和MIP-1αRSV-stimulated中性粒细胞释放45%。自趋化因子mRNA合成的量没有显著不同的敏捷的存在与否,是否抑制趋化因子蛋白释放RSV-stimulated中性粒细胞在转录后的水平值得进一步探索。gydF4y2Ba

相比之下,敏捷没有抑制中性粒细胞MPO的脱粒。之前的临床研究表明,皮质类固醇治疗无效患者在治疗RSV毛细支气管炎(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。我们发现敏捷不能抑制中性粒细胞的所有介质释放可能部分解释不一致在临床患者对皮质类固醇RSV细支气管炎。此外,在自然感染,皮质类固醇通常不是管理直到在病程后期炎症已经建立。gydF4y2Ba

气道炎症在RSV细支气管炎无疑是上皮细胞的多细胞过程中,细胞毒性T细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞参与。进一步的研究需要完全理解的炎症机制的细胞进入和机制RSV细支气管炎,从而获得洞察RSV的有效治疗毛细支气管炎。gydF4y2Ba

我们感谢拉里·l·托马斯博士对他的批评在准备这个手稿。gydF4y2Ba