氧化剂应激煽动蔓延的巨噬细胞通过细胞外Signal-Regulated激酶和p38增殖蛋白激酶¹

单核细胞/巨噬细胞被视为重要的宿主防御玩家保持完整性。巨噬细胞参与Ag)表示,吞噬病原体,和生产保护分子,包括细胞因子和反应性氧/氮物种(1)。侮辱后,循环单核细胞被吸引,遵守当地的内皮,迁移到血管外的组织和功能分化的巨噬细胞。在这个过程中,单核细胞/巨噬细胞改变其形态特性从圆形到“传播形式”(1)。体外,据报道,一些药物刺激诱导巨噬细胞的扩散。其中包括佛波醇酯、钙离子载体和甾体/非甾体类抗炎药物(2,3,4)。然而,目前,很少了解病理生理相关的触发器,煽动蔓延的巨噬细胞在当地组织。

细胞氧化还原状态是一个关键因素,控制各种细胞功能(5)。这主要是由于这样的事实,各种信号分子氧化还原敏感。例如,活性氧引发各种激酶的磷酸化,激活转录因子,包括激活蛋白1和核factor-κB (6)。我们最近发现,氧化剂,著名的组织损伤和炎症介质,诱导巨噬细胞在文化的传播。病理环境下,氧化剂压力可能是一个重要的触发体内巨噬细胞的过渡形式传播。

以前的报告(7)提出了传播的Egr-1巨噬细胞的作用。的表达egr-1基因是由血清反应元素(sr)³在其启动子区域(8)。的活动都是由三元复杂因素上调磷酸化的增殖作用(MAP)激酶家族的分子(9)。它已经表明,MAP激酶和行为和被激活,以应对氧化剂氧化还原敏感压力在某些细胞类型(10,11)。在此基础上,本研究进行了识别oxidant-initiated传播所需的巨噬细胞细胞内事件,特别是突出角色的细胞外signal-regulated激酶(erk) c-Jun n端激酶(物),和p38激酶地图。

正常的鼠肺泡巨噬细胞NR8383 (12)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。这些细胞被维护在DMEM /火腿F-12 (DMEM-F12;生活技术,马里兰州)补充100 U /毫升青霉素G, 100μg /毫升的链霉素,两性霉素B 0.25μg /毫升、FCS和10到15%。

传播的感应,在24-well NR8383巨噬细胞的组织培养板(Becton Dickinson,林肯公园,新泽西)刺激甲萘醌(2-methyl-1 4-naphthoquinone;25 - 100μM;σ,圣路易斯,密苏里州)或300μM过氧化氢(σ)。甲萘醌是一种醌化合物,生成过氧化物(O₂⁻通过one-electron-transfer反应并产生H)₂O₂和羟基自由基(哦^•)(13)。甲萘醌,50到100μM,通常被作为诱导物蔓延。形态学检查后进行1 h使用相差显微镜检查。蔓延在每个细胞数的百分比,和四个井的平均值是用来比较不同组中的数据。每口井的60多个细胞被随机的检查评估。在一些实验中,巨噬细胞和抗氧化剂进行预处理N乙酰-l半胱氨酸(10毫米;σ)2 h,然后刺激甲萘醌。

检查角色的erk和p38 MAP激酶oxidant-triggered蔓延,NR8383巨噬细胞是用PD098059预处理(10 - 75μM;博士的礼物a . r . Saltiel Parke-Davis制药研究,安阿伯市MI) (14)或SB203580(10μM;Calbiochem-Novabiochem,诺丁汉,英国)2 h,然后刺激甲萘醌。所有实验一式四份。

兵的角色在oxidant-triggered由瞬时转染细胞蔓延了。使用修改后的磷酸钙共沉淀法(15),NR8383巨噬细胞转染pCI-βGal(礼物Promega,麦迪逊,WI)一起pCEP4Erk1 + pCEP4Erk2或pCEP4Erk1 (K71R) + pCEP4Erk2 (K52R),如下所述。pCI-βGal介绍β-galactosidase基因的控制下即早期增强器/人类巨细胞病毒的启动子。pCEP4Erk1 wt ERK1 pCEP4Erk2代码和ERK2。pCEP4Erk1 (K71R)和pCEP4Erk2 (K52R)编码显性负突变体ERK1 ERK2,分别。当过表达,这些突变体有效地抑制内源性ERK1和ERK2的函数(16)。NR8383细胞(2 - 6×10⁶)停牌1毫升的钙phosphate-DNA复杂包含2μg pCI-βGal + 3μg pCEP4Erk1 + 3μg pCEP4Erk2,或2μg pCI-βGal + 3μg pCEP4Erk1 (K71R) + 3μg pCEP4Erk2 (K52R)。孵化后20分钟,生长介质(10 - 15% FCS / DMEM-F12;9毫升)补充说,孵化额外2 h,与氯喹治疗50μg /毫升的浓度。2 h孵化后,细胞被洗和暴露于90年代15%的甘油在PBS。然后,细胞被洗和播种12-well盘子。孵化后48 h,细胞受移植者6-well盘子或10厘米组织培养板,刺激到100年μM甲萘醌1 h,并受5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside(半乳糖苷)测定。测试的贡献p38激酶地图,NR8383巨噬细胞转染了pCI-βGal(2μg)一起空向量pcDNA3(6μg)或pcDNA3-p38 (TY)(6μg)编码p38的显性负突变(17)。

检查一个oxidant-triggered传播行为的巨噬细胞的作用,使用Elk-1的显性负突变(18)。Elk-1形成复合物与血清反应因子(SRF),和绑定Elk-1-SRF复合物的行为会导致目标基因的诱导。如果Elk-1的dominant-interfering形式中,活动行为的抑制(18)。NR8383巨噬细胞是暂时性的转染pCI-βGal(3μg)一起空质粒pCMV5(6μg)或pDN-Elk(6μg)编码羧基末端的变异与删除Elk-1激活域。48小时后,细胞暴露于甲萘醌和半乳糖苷测定。一式四份的转染实验。

半乳糖苷测定进行描述之前19)。总之,细胞被固定在0.5%戊二醛、2毫米MgCl₂,1.25毫米EGTA PBS 10分钟在室温和孵化37°C 2 h半乳糖苷溶液中含有1毫克/毫升半乳糖苷(σ),20毫米K₃铁(CN)₆,20毫米K₄铁(CN)₆h·3₂MgCl O 2毫米₂在PBS, 0.01%钠脱氧胆酸盐和0.02%诺乃清洁剂p 40 (pH值7.4)。比例的蓝色细胞总数的蓝色细胞扩散计算在每一个,和四个井的平均值被用来比较不同组数据。

erk的磷酸化形式和p38检测到免疫印迹分析。NR8383巨噬细胞(1 - 2×10⁶/)培养six-well盘子被刺激到75年μM甲萘醌15到60分钟。曝光后,细胞被PBS冲洗,细胞溶解300μl示例缓冲区(4% SDS、10%甘油、0.006%溴酚蓝和250毫米Tris-HClβ-mercaptoethanol 2%;pH值为6.8),煮5分钟。样本通过几次通过23-gauge针。离心后,上清液在10%的丙烯酰胺凝胶电泳和转移到硝化纤维膜。分析使用PhosphoPlus MAPK Ab装备和PhosphoPlus p38 MAP激酶Ab工具包(新英格兰生物学实验室,英国)协议后由制造商提供。

活动物被磷酸化的c-Jun评估,使用SAPK /物分析工具包(新英格兰生物学实验室)。简而言之,在暴露于甲萘醌,细胞与300μl裂解缓冲和细胞溶解通道通过针几次。离心后,每个上层清液包含50μg总蛋白质的孵化与1μg c-Jun融合蛋白珠在一夜之间在4°C。离心后,球被洗,悬浮在50μl激酶缓冲补充100μM ATP,孵化,30分钟30°C。然后,50μl样本添加到每个缓冲区,煮5分钟,和离心机。浮在表面的接受了电泳和免疫印迹分析后提供的协议套件。

NR8383巨噬细胞暴露在50μM甲萘醌为0.5,1和2 h。由一个单步总RNA提取方法(20.)和北部遭受污点分析,所述前(21)。总之,RNA样本1.2%琼脂糖凝胶上电泳含有10%甲醛和转移到硝化纤维膜。一只老鼠egr-1互补脱氧核糖核酸(22),一个人类的c -”丛书互补脱氧核糖核酸(23),一只老鼠glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)互补脱氧核糖核酸被贴上³²P] dCTP使用随机启动的方法。细胞膜与探针杂交在65°C在一夜之间解决方案包含4×SSC(600毫米氯化钠,60毫米柠檬酸钠),5×Denhardt的解决方案,10%的硫酸葡聚糖,50μg /毫升鲱鱼精DNA,保利(a)和50μg /毫升、洗50°C,暴露于柯达西电影−80°C。

数据表示为±SE。使用非参数Mann-Whitney执行统计分析U测试比较不同组数据。我们使用的值p< 0.05,表明一个统计上的显著差异。

探讨氧化剂对巨噬细胞的影响蔓延,镀NR8383细胞组织培养塑料和没有孵化或甲萘醌,而产生活性氧中间体。在1 h,大多数的细胞粘在塑料和显示圆形外观,明亮的细胞质和清晰的边缘(图。1,一个,左)。甲萘醌,后30分钟内巨噬细胞改变其形状,表现出“传播形式”的特点是平面和变形形状和黑暗细胞质空泡状态(1,24)(图。1,一个,正确的)。1小时后,大约有60%的刺激巨噬细胞显示蔓延。甲萘醌的作用是剂量依赖性;即。,percentages of spreading cells were 9.6% by 25 μM, 25.5% by 50 μM, 45.9% by 75 μM, and 55.5% by 100 μM, compared with untreated control (4.8%) (Fig.1,B)。这种效果是完全废除的抗氧化剂N乙酰-l半胱氨酸(无花果。1,C)。氧化剂压力对细胞的刺激效应传播进一步证实使用H₂O₂。如图1D300μM H₂O₂巨噬细胞诱导扩散(53.5±4.1%,意味着±SE,p< 0.05)类似于维生素k的影响。

识别信号通路参与oxidant-initiated巨噬细胞扩散,erk的角色了。NR8383巨噬细胞甲萘醌治疗,疗程15分钟,和磷酸化ERK1 ERK2使用phospho-specific Abs检测。免疫印迹分析表明,与甲萘醌迅速刺激巨噬细胞诱导的磷酸化ERK1和ERK2(无花果。2一个)。

检查是否激活erk oxidant-induced细胞传播至关重要,NR8383巨噬细胞是使用串行MAP激酶激酶抑制剂的浓度PD098059然后刺激甲萘醌。微观分析表明,PD098059抑制细胞传播方式存在剂量依赖的相关性(图2B)。显著抑制观察到浓度高于50μM。与控制(42.7±2.8%)相比,细胞传播的比例减少到28.6±1.6%(50μM)和26.0±3.0%(75μM)。

erk的关键作用是进一步证实了瞬时转染实验。与一位记者NR8383细胞转染质粒一起pCI-βGal pCEP4Erk1 + pCEP4Erk2编码wt erk或pCEP4Erk1 (K71R) + pCEP4Erk2 (K52R)编码dominant-interfering erk的形式。孵化后48 h,细胞被刺激甲萘醌和半乳糖苷测定。使用X-gal-positive细胞扩散细胞的百分比进行评估。如图2C与显性负突变体显著地抑制巨噬细胞,转染蔓延。与控制(100%)相比,细胞传播的相对比例减少到60.8±9.4% (p抑制erk < 0.05)。

药物和基因失活的erk只是部分抑制oxidant-induced巨噬细胞扩散。进一步识别分子与erk合作,参与p38 MAP激酶和物进行了测试。NR8383巨噬细胞甲萘醌治疗,疗程15到60分钟,磷酸化p38和c-Jun检查。免疫印迹分析表明,与甲萘醌治疗巨噬细胞迅速p38的磷酸化,在30分钟(图峰值。3,一个)。相比之下,物在NR8383持续活跃的细胞,其激活状态并没有影响对氧化剂压力(图。3B)。

需要检查是否激活p38 oxidant-induced细胞传播,NR8383细胞使用p38的药理抑制剂,SB203580,然后刺激甲萘醌。形态分析表明,SB203580部分抑制细胞传播(无花果。3C)。与控制(40.9±3.3%)相比,细胞扩散的比例减少到24.6±2.1%。预处理的细胞一起SB203580 PD098059导致戏剧性的抑制巨噬细胞传播(6.8±0.9%)。

p38的角色被一个瞬时转染试验进一步证实。与一位记者NR8383细胞转染质粒pCI-βGal连同空质粒pcDNA3或pcDNA3-p38 (TY)编码p38的显性负突变。孵化后48 h,细胞被刺激甲萘醌和半乳糖苷测定。如图3D,转染p38 (TY)显著地抑制巨噬细胞扩散。与控制(100%)相比,细胞传播的相对比例减少到57.9±7.5% p38的抑制。

通过磷酸化erk和p38激活行为Elk-1三元复杂的因素(9)。进一步确定下游MAP激酶激活的分子事件,我们检查的参与行为。的表达egr-1和c -”丛书受老位于他们的5′侧翼区域(8,25)。使用这些基因作为指标,活动都是由北部污点分析测试。与甲萘醌刺激巨噬细胞后,两者的表达egr-1和c -”丛书30分钟内被迅速诱导,达到1 h(无花果。4,一个)。检查是否需要激活行为oxidant-triggered蔓延,Elk-1的显性负突变体使用。与SRF Elk-1形成复合物,绑定Elk-1-SRF复合物的行为会导致目标基因的诱导。如果dominant-interfering Elk-1形式中,活动的行为是废除(18)。NR8383巨噬细胞是瞬变与空质粒转染一起pCI-βGal pCMV5或pDN-Elk。48小时后,细胞暴露在甲萘醌,半乳糖苷测定。如图4B,引入Elk-1变异显著抑制巨噬细胞扩散。传播细胞的相对比例减少到29.0±10.7%的价值控制(100%)。

传播的巨噬细胞被认为是细胞激活和分化的标志(1,24)。它已经表明,一些药物诱导巨噬细胞扩散。例如,佛波醇酯、蛋白激酶C的激活,诱导细胞的扩散形成monocyte-macrophage血统(2,26,27)。钙离子载体、博来霉素、糖皮质激素、非甾体类抗炎药物,和某些免疫抑制剂也可能诱发巨噬细胞体外传播(3,4,28)。然而,目前对病理生理相关因素引起巨噬细胞的扩散。在本报告中,我们描述了一个新颖的机制,调节这一过程。氧自由基代谢产物,至关重要的介质在各种病理生理的情况下,被确认为触发巨噬细胞扩散。

氧化应激参与各种疾病,包括炎症(29日),单核细胞/巨噬细胞发挥着重要的作用。众所周知,氧自由基刺激生产的单核细胞化学引诱物蛋白1和白细胞粘附受体的表达,导致积累循环单核细胞在受影响的网站(30.,31日)。我们目前的结果,与先前的报道,表明氧自由基中间体为当地的潜在角色巨噬细胞的功能。在炎症、氧化剂压力可能吸引单核细胞和促进他们的外渗,迁移,分化组织巨噬细胞。值得注意的是,在病理环境,单核细胞/巨噬细胞是当地氧化剂生产的一个重要来源。当地产生的氧自由基中间体巨噬细胞可能会进一步促进巨噬细胞的聚集和激活。

细胞内信号通路参与巨噬细胞传播知之甚少。先前的报道暗示可能某些信号分子的作用,包括蛋白激酶C、胞质自由钙、磷脂酶A₂和花生四烯酸(2,3,32,33)。然而,迄今为止,连续参与巨噬细胞信号级联传播并不确定。在目前的调查中,我们突出显示的地图kinase-SRE通路的作用。兵、物和p38激酶被映射到被氧化剂氧化还原敏感和激活在特定的细胞类型(10,34)。行为也被认为是一个oxidant-responsive监管元素(11,35)。与这些相一致,我们的研究结果表明,甲萘醌磷酸化erk和p38,导致激活的行为。抑制一步部分抑制巨噬细胞的oxidant-mediated蔓延。当两种途径都与此同时封锁,显著抑制巨噬细胞观察蔓延。类似的,大量的抑制也通过失活行为。这些结果表明,氧化剂反应压力、ERK通路和p38通路合作煽动通过激活巨噬细胞传播行为。

ρ的家人GTP-binding蛋白(ρ,Rac, Cdc42)扮演一个角色在细胞骨架组织变更,能动性,细胞形状(36,37)。据报道,这些GTP-binding蛋白可以被激活,以应对氧化剂压力(38巨噬细胞)和参与佛波醇ester-induced传播(39)。ρ家族分子的活化导致磷酸化物(40),这可能使磷酸化Elk-1并激活行为(41)。,尽管NR8383细胞的活性物不受氧化剂压力,Rho-JNK-SRE通路,在某种程度上,参与oxidant-induced蔓延在其他细胞单核细胞/巨噬细胞谱系。

分子事件的下游是目前待定。自巨噬细胞传播迅速,一些即早期基因可能参与。以前的报告表明,表达egr-1对佛波醇至关重要ester-induced传播骨髓白血病细胞和正常的成髓细胞(7)。众所周知,的表达egr-1由氧化剂诱导,由老的5′侧翼区域(8,42)。我们观察到甲萘醌是暂时性的诱导的表达egr-1在巨噬细胞前蔓延。然而,我们的初步结果表明,1)抑制egr-1表达式由反义oligodeoxynucleotides没有抑制巨噬细胞的oxidant-induced蔓延,和2)瞬时转染全身egr-1互补脱氧核糖核酸未能诱导巨噬细胞扩散。类似地,c -转染”丛书cDNA、另一个氧化剂诱导即早期基因控制的行为(25),并没有导致巨噬细胞传播(我们的未发表的观察)。这些数据意味着以外的下游分子(s)的可能性egr-1和c -”丛书可能参与了oxidant-initiated巨噬细胞扩散。

我们感谢Drs。r·j·戴维斯·m·科布j .汉博士和h·d·Rupprecht表达质粒,a . r . Saltiel PD098059。