摘要gydF4y2Ba
有丝分裂原活化蛋白激酶介导的信号转导途径将细胞外刺激转化为多种细胞功能。然而,MAP激酶在中性粒细胞中的作用尚不清楚。细胞MAP激酶的蛋白磷酸化分析表明,人中性粒细胞暴露于趋化因子FMLP以及粒细胞-巨噬细胞CSF、PMA或离子霉素后,可迅速诱导p38和p44/42 MAP激酶的激活,但炎症细胞因子TNF-α的刺激仅触发p38 MAP激酶的激活。为了研究这些MAP激酶的细胞功能,我们利用特异性抑制细胞p38 MAP激酶酶活性的抑制剂SB20358和特异性阻断完整中性粒细胞中p44/42 MAP激酶诱导的蛋白磷酸化和激活的抑制剂PD98059。抑制细胞p38 MAP激酶激活几乎完全消除了TNF-α-刺激的IL-8产生和人中性粒细胞超氧化物的产生。此外,fmlp通过抑制细胞p38 MAP激酶的激活而非p44/42 MAP激酶的激活,显著抑制了中性粒细胞趋化和超氧化物的产生。此外,RIA表明,粒细胞-巨噬细胞CSF或LPS以及TNF-α刺激中性粒细胞IL-8的产生需要细胞p38 MAP激酶的激活,而PMA或离子霉素诱导的中性粒细胞IL-8的产生则不需要。这些结果表明,细胞p38 MAP激酶的激活对于TNF-α-或fmlp介导的人中性粒细胞的细胞功能是必不可少的,并提示p38 MAP激酶可能在不同刺激的反应中发挥不同的作用。gydF4y2Ba
人体中性粒细胞是抵御微生物入侵的第一道防线,也是急性炎症反应的主要细胞成分(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).在趋化因子、细胞因子或免疫复合物的刺激下,人体中性粒细胞迅速被激活(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).在中性粒细胞活化过程中发生的早期细胞内事件之一是蛋白质磷酸化的快速诱导,这在中性粒细胞许多功能的调节中起着至关重要的作用(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),在其他细胞类型中也很重要。地图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba激酶已被证明在介导细胞内信号转导和调节细胞对各种细胞外刺激的功能方面发挥核心作用(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).最近,已经确定了三种不同的哺乳动物MAP激酶,包括细胞外信号调节激酶(ERKs或p44/42 MAP激酶),应激激活蛋白激酶或c-Jun激酶,以及p38 MAP激酶(HOG1的哺乳动物同源物,也称为CSBP, RK或RK)gydF4y2Bampk2gydF4y2Ba),每一种都有明显独特的信号通路(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
研究表明p38 MAP激酶参与调控应激激活信号转导的细胞内激酶级联反应。在某些环境应激或促炎细胞因子的作用下,p38 MAP激酶迅速被激活,随后刺激MAP激酶活化蛋白(MAPKAP)激酶2和/或MAPKAP激酶3,进而诱导小热休克蛋白(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).此外,激活的p38 MAP激酶已被证明在体外和完整细胞中磷酸化特定的转录因子,从而可能调节基因表达(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).对人中性粒细胞的研究表明,在某些细胞外刺激的作用下,p38 MAP激酶(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)和MAPKAP激酶2 (gydF4y2Ba31gydF4y2Ba)迅速增加,提示该激酶级联可能在调节中性粒细胞功能中起关键作用。在本研究中,为了了解MAP激酶在人中性粒细胞中的潜在生理功能,我们使用特异性激酶抑制剂(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba).检测细胞p38 MAP激酶或p44/42 MAP激酶对TNF-α或FMLP诱导的中性粒细胞IL-8生成、超氧化物生成或趋化性的影响。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
细胞的准备gydF4y2Ba
用Ficoll-Hypaque梯度法从人全血中分离中性粒细胞,并用低渗休克法裂解污染的红细胞(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).产生的中性粒细胞至少占细胞的97%。台盼蓝排除法估计细胞存活率为98%。分离的中性粒细胞在含有10 mM HEPES (pH 7.5)和1 mM钙的HBSS (Life Technologies, Gaithersburg, MD)中重悬。为了修饰细胞MAP激酶活性,化合物SB20358 (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Bap38 MAP激酶特异性抑制剂(ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.6 μM),由SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, PA)或化合物PD 98059获得,该化合物通过IC抑制c-Raf对MAP激酶激酶1的激活间接阻断p44/42 MAP激酶的激活gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 4 μM (gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),购自New England Biolabs (Beverly, MA)。此外,化合物H7 (Seikagaku Corp., Tokyo, Japan),一种蛋白激酶C抑制剂gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba= 6 μm (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),作为对照。如图所示,将中性粒细胞与激酶抑制剂或不加激酶抑制剂在4°C下预孵育40分钟。然后用25 ng/ml TNF-α (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 10刺激细胞gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba
细胞MAP激酶的Western blot分析gydF4y2Ba
有充分的证据表明,三组MAP激酶被不同的上游激酶激活,通过在每个激酶上的一个调节位点上的苏氨酸和酪氨酸磷酸化。这些激酶的蛋白质磷酸化已被证明是其激活的准确指标(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba).定量MAP激酶蛋白磷酸化,每次刺激后,4 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba收集中性粒细胞,在140 μl样品缓冲液(1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris, (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5% Nonidet P-40, 0.2 mM PMSF, 20 mM正钒酸钠,10 μM)中重悬gydF4y2BapgydF4y2Ba-硝基苯基磷酸,1 mM氟磷酸二异丙基,0.7 mg/ml胃抑素A, 10 mg/ml胰蛋白酶和2 mg/ml抑蛋白),并加入140 μl 2xlaemmli溶液(9% (w/v) SDS, 6% (v/v) β-巯基乙醇,10% (v/v)甘油和微量溴酚蓝染料在0.196 M Tris/HCl (pH 6.7)中溶解。细胞蛋白(50 μl样品)通过10% SDS-PAGE电泳,然后使用半干转移系统(Bio-Rad, Hercules, CA)转移到Immobilon-P膜(Millipore Corp., Bedford, MA)。在每个凝胶中运行预染色蛋白标准品(Bio-Rad)。印迹在添加5% BSA的Tris缓冲盐水/Tween-20 (TBS-T含有20 mM Tris碱基,pH 7.6, 137 mM NaC1和0.1% Tween-20)中阻断1小时,用1/1000稀释的特异性抗tyr183磷酸化p38 MAP激酶(NEB)或酪氨酸磷酸化p44/42 MAP激酶(NEB)的兔抗体孵育2小时,然后用1/5000稀释的辣根过氧化酶偶联抗兔IgG (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis)次级抗体孵育2小时。IN)在室温下放置30分钟。经过三次洗涤,每次洗涤7分钟后,用增强化学发光(来自Amersham, Arlington Heights, IL)试剂对印迹进行处理,并用柯达X-Omat胶片在不同时间(15 s至3 min)内通过放射自显影检测磷酸化的MAP激酶。gydF4y2Ba
为了确认每条通道上装载了相同数量的细胞蛋白,将印迹在剥离缓冲液(100 mM β-巯基乙醇,2% SDS, 62.5 mM Tris/HCl, pH 6.7)中50°C孵育30分钟,去除初级Ab/次级Ab复合物。然后对印迹进行放射自显影以确认Ab信号已被去除。在此过程中,用含有5% BSA的缓冲液阻断印迹,并用Santa Cruz Biotech公司抗p38 MAP激酶的兔抗体进行标记。(Santa Cruz, CA),然后用上文所述的辣根过氧化物酶偶联抗体孵育。用ECL法检测蛋白。gydF4y2Ba
蛋白磷酸化测定gydF4y2Ba
为了评估细胞MAPKAP激酶2的酶活性,中性粒细胞(1 × 10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)在200 μl的冷样缓冲液中收获,温和超声处理10 s。在3000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟后,用市购的人rhsp27 (stresgen Biotechnologies Corp., Victoria, British Columbia, Canada)作为MAPKAP激酶2 (MAPKAP kinase 2)的特异性底物,通过体外蛋白磷酸化实验检测上清中的激酶活性。gydF4y2Ba39gydF4y2Ba).加入等体积(30 μl)的新制备的磷酸化反应混合物,其中含有:30 mM HEPES (pH 7.3), 20 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 2 mM EGTA, 10 μM正钒酸钠,5 μM冈田酸,4 mM DTT, 30 μM H-7, 0.4 mM [γ-]gydF4y2Ba32gydF4y2BaP] ATP (10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCpm /pmol), 0.5 μg hsp27,至30 μl细胞上清。体外磷酸化反应在30℃下进行10 min,加入60 μl 2× Laemmli溶液停止。然后在11% SDS-PAGE上分离蛋白,用放射自显影法检测诱导的hsp27蛋白磷酸化。gydF4y2Ba
引发未及gydF4y2Ba
为了检测细胞IL-8的产生,中性粒细胞(5 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/ml)悬浮在含有10% FCS (Sigma Chemical Co.)的RPMI 1640 (Life Technologies)中,与蛋白激酶抑制剂在4°C下预孵育40分钟。然后用TNF-α、FMLP、GM-CSF、离子霉素、PMA或LPS刺激细胞,如上所述,在37°C下5% Co下培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba条件。如图所示,在不同时间收获培养基,在2000 ×离心下从细胞中分离gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,用RIA分析IL-8的产生,如前所述,稍加修改(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba).简单地说,将100 μl中性粒细胞条件培养基与100 μl鸡抗人IL-8 Ab (gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)在含有1% BSA的PBS中稀释1/2000。人类gydF4y2Ba125gydF4y2Ba在PBS (100 μl)中加入7万~ 8万cpm/ml的I-labeled IL-8 (DuPont NEN, Boston, MA),在25℃下孵育1h。加入含有10 mg/ml BSA的500 μl冷PBS停止反应,用50%终浓度的饱和硫酸铵沉淀免疫复合物。样品在5000 ×下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下放置20分钟,并计算所得球团中的放射性量。采用il -8标准品(0.03 ~ 10 ng/ml)构建标准曲线,定量。gydF4y2Ba
氧化爆发试验gydF4y2Ba
为了确定MAP激酶在中性粒细胞超氧化物产生中的作用,将细胞悬浮在含有10 mM HEPES (pH 7.5)和1 mM钙的HBSS中,并与MAP激酶抑制剂一起预孵育,如上所述。为了测量呼吸爆发反应,预先培养细胞(1 × 10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞/ml)重悬于含有145 mM细胞色素的HBSS中gydF4y2BacgydF4y2Ba,叠氮化钠2mm,氯化钙2mmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 2.4 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba将细胞(100 μl)分装于预热过的微滴板中,用25 ng/ml TNF-α, 5 × 10刺激中性粒细胞产生超氧阴离子gydF4y2Ba−8gydF4y2BaM FMLP,或20 ng/ml PMA。如图所示,通过细胞色素的还原,在37°C的不同时间内动态测量超氧化物的产生gydF4y2BacgydF4y2Ba在550nm (OD550)下使用THERMOgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba动态微孔板读取器(分子装置,门洛帕克,加州)。使用软件分析数据gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba程序。gydF4y2Ba
趋化现象的分析gydF4y2Ba
采用改良Boyden技术检测FMLP诱导的中性粒细胞趋化性(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),如前所述(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba).简单地说,将分离的人中性粒细胞与MAP激酶抑制剂或不含MAP激酶抑制剂进行预孵育,如图所示,在含1% BSA的Modified Dulbecco培养基中,在4°C下孵育40分钟,并将其装载到Boyden室的上孔中,通过3 μm硝酸纤维素过滤器(Millipore)将其与下孔分离。诱导趋化性gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba将含有1% BSA的改性Dulbecco培养基中的M FMLP加入Boyden室的下孔中。中性粒细胞在加湿的5% CO中迁移gydF4y2Ba2gydF4y2Ba37℃培养60 min,取下滤网,固定,染色,风干。通过显微切片技术定量细胞迁移(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),使用图像分析仪(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba).在每个样品的三个字段中确定通过过滤器迁移的细胞数量,重复运行。中性粒细胞迁移表达为趋化/迁移指数(细胞数×通过过滤器迁移的距离)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
人中性粒细胞细胞MAP激酶的活化gydF4y2Ba
为了更好地了解MAP激酶在中性粒细胞活化中的调控作用,我们将新分离的细胞暴露于不同的刺激下,包括细胞因子(TNF-α和GM-CSF)、趋化因子(FMLP)、蛋白激酶C激活剂(PMA)或钙离子载体(离子霉素)。刺激后,通过Western blot检测诱导的蛋白磷酸化来评估细胞MAP激酶的激活,如下所述gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba。如图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba结果显示,细胞p38 MAP激酶在TNF-α、GM-CSF、FMLP、PMA或离子霉素的刺激下被磷酸化,因此在人中性粒细胞中被激活(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).中性粒细胞暴露于GM-CSF、FMLP、PMA和离子霉素也能激活细胞p44/42 MAP激酶,但TNF-α不能激活(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).通过检测总细胞p38 MAP激酶和图1证实了这一发现gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba表明,观察到的细胞MAP激酶诱导蛋白磷酸化的差异不是由于负载的差异或细胞蛋白质消化的差异。gydF4y2Ba
激酶抑制剂SB20358抑制TNF-α刺激的中性粒细胞p38 MAP激酶活化gydF4y2Ba
发现TNF-α可以特异性激活p38 MAP激酶,但不能特异性激活p44/42 MAP激酶(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba),导致我们使用这种细胞因子来研究p38 MAP激酶在人中性粒细胞活化中的作用。此外,最近发现的化合物SB20358是一种具有IC的p38 MAP激酶特异性激酶抑制剂gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.6 μM,对其他蛋白激酶(包括p44/42 MAP激酶或应激激活蛋白激酶/c-Jun激酶)无明显影响(36和37),为实现这一目的提供了有力的工具。为了调节细胞p38 MAP激酶,将中性粒细胞与0.6 μM SB20358在4°C下预孵育40 min,以抑制后续刺激引发的激酶激活。SB20358对细胞p38 MAP激酶的抑制作用是通过评估细胞MAPKAP激酶2的激活来检测的,MAPKAP激酶2已被证明是p38 MAP激酶的特异性细胞底物(22和23),并负责小热休克蛋白(hsp25/27)的磷酸化(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba).细胞MAPKAP激酶2的酶活性通过体外蛋白磷酸化实验检测,使用人rhsp27作为特定底物,如下所述gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba生成的放射自显像如图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba。TNF-α刺激中性粒细胞诱导细胞MAPKAP激酶2活化(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba),这是由p38 MAP激酶激活引起的(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba).用SB20358预处理中性粒细胞下调细胞p38 MAP激酶,完全抑制TNF-α刺激的MAPKAP激酶2活化(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba),并对基底细胞MAPKAP激酶2活性有抑制作用(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba).上述结果证实,SB20358预处理中性粒细胞可抑制细胞p38 MAP激酶的活化,阻断该激酶级联的下游信号通路。gydF4y2Ba
SB20358抑制细胞p38 MAP激酶特异性降低TNF-α刺激的中性粒细胞IL-8的产生gydF4y2Ba
为了研究p38 MAP激酶的生理功能,嗜中性粒细胞与SB20358预孵育,然后暴露于25 ng/ml TNF-α中。通过RIA评估细胞p38 MAP激酶对诱导IL-8产生的影响,如下所述gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba,结果以图形形式显示。未受刺激的人中性粒细胞产生非常低但可检测的IL-8水平(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(−)/(−))和SB20358预处理对细胞的基础IL-8生成没有影响(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2BaSB20358 /(−))。用TNF-α刺激中性粒细胞在16小时诱导IL-8产量增加27倍(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(−)/ TNF -α)。用p38 MAP激酶抑制剂SB20358预处理中性粒细胞后,TNF-α-介导的IL-8生成的增加几乎完全被消除(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2BaSB20358 / TNF -α)。此外,剂量分析表明,SB20358对TNF-α-诱导的IL-8产生的抑制作用呈浓度依赖性,在0.15 μM时达到最大抑制作用(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba),该浓度也抑制TNF-α-诱导的人中性粒细胞p38 MAP激酶活化(数据未显示)。gydF4y2Ba
为了检测SB20358、化合物PD98059在完整细胞中间接阻断p44/42 MAP激酶活化的特异性(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),以及蛋白激酶C抑制剂化合物H7 (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),作为类似实验的对照。图3gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba结果表明,用4 μM化合物PD98059预处理人中性粒细胞,完全抑制fmlp刺激的细胞p44/42 MAP激酶的磷酸化和活化(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),对TNF-α-诱导的IL-8产生无影响。同样,6 μM化合物H7对pma刺激的IL-8产生的抑制作用约为75%(我们未发表的观察结果),却不能抑制TNF-α-诱导的人中性粒细胞IL-8的产生(图3)gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaCgydF4y2Ba).此外,0.6 μM SB20358对PMA或离子霉素诱导的IL-8产生没有抑制作用(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),表明SB20358对细胞p38 MAP激酶具有特异性,对人中性粒细胞没有细胞毒性,至少在本研究中使用的浓度是这样。综上所述,这些结果表明p38 MAP激酶在介导TNF-α-诱导的人中性粒细胞产生IL-8中起关键作用。gydF4y2Ba
SB20358抑制TNF-α-诱导的人中性粒细胞超氧化物的产生gydF4y2Ba
除了产生IL-8外,活化的中性粒细胞的另一个重要细胞功能是产生超氧阴离子。为了研究p38 MAP激酶介导的信号通路是否参与呼吸爆发反应,如上所述,用SB20358预处理中性粒细胞,下调细胞p38 MAP激酶。然后用25 ng/ml TNF-α或20 ng/ml PMA刺激激活细胞,并动态测量诱导的超氧化物生成。在人中性粒细胞中,超氧化物含量相对较低(0.714±0.096 nmol /10 min/10)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞)的自发超氧化物生成检测(图4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(2.381±0.274 nmol超氧化物/10 min/10)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞)产生超氧化物(图4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba).SB20358下调细胞p38 MAP激酶可显著抑制TNF-α-诱导的超氧化物生成(0.476±0.038 nmol超氧化物/10 min/10)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞,图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba基础水平(0.238±0.031 nmol超氧化物/10 min/10)略有下降gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞,图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba).然而,SB20358预处理细胞对pma诱导的呼吸爆发反应没有影响(图4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba).此外,与预期一样,PD98059抑制细胞p44/42 MAP激酶对TNF-α-诱导的超氧化物生成没有影响(数据未显示)。这些结果表明,细胞p38 MAP激酶的激活对于TNF-α刺激的中性粒细胞呼吸爆发是必需的,而对于PMA触发的呼吸爆发则不是必需的。gydF4y2Ba
FMLP对细胞MAP激酶活化的抑制作用gydF4y2Ba
人中性粒细胞暴露于FMLP激活的p38和p44/42 MAP激酶(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).因此,了解每种激酶的细胞功能是很有趣的。为了下调细胞激酶活性,分别用蛋白激酶抑制剂SB20358或PD98059预处理中性粒细胞,如上所述。蛋白激酶抑制剂对fmlp刺激的细胞p44/42 MAP激酶激活的影响通过评估该激酶诱导的蛋白磷酸化来检测,见下文gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba。如图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaBgydF4y2Ba, fmlp刺激p44/42 MAP激酶激活(gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba用PD98059预处理中性粒细胞(gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba),但不受SB20358 (gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba).如上所述,由于SB20358特异性结合并抑制p38 MAP激酶活性,因此通过体外蛋白磷酸化试验评估细胞MAPKAP激酶2的酶活性间接检测细胞p38 MAP激酶的活性(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),但对p38 MAP激酶诱导的蛋白磷酸化没有影响(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba).放射自显影分析显示中性粒细胞暴露于FMLP诱导细胞MAPKAP激酶2活性增加(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷2gydF4y2Ba),这种诱导的激酶激活被p38 MAP激酶抑制剂SB20358完全抑制(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷3gydF4y2Ba),而不是PD98059(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2Ba巷4gydF4y2Ba).结果表明,用SB20358或PD98059预处理人中性粒细胞可以分别特异性阻断fmlp刺激的p38或p44/42 MAP激酶的激活。gydF4y2Ba
SB20358下调细胞p38 MAP激酶抑制fmlp诱导的中性粒细胞趋化gydF4y2Ba
为了研究p38和p44/42 MAP激酶在fmlp活化的中性粒细胞中的作用,如上所述,用每种激酶特异性的激酶抑制剂预处理细胞,下调细胞激酶。FMLP刺激后,观察了人中性粒细胞诱导趋化性的变化。为此,通过改进的Boyden室试验评估细胞迁移活性,并在趋化指数图中显示,如下所述gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba。趋化性实验表明,中性粒细胞暴露于FMLP诱导了显著的趋化性(趋化指数比未刺激对照细胞高17倍),用p38 MAP激酶抑制剂SB20358预处理中性粒细胞可显著抑制FMLP诱导的趋化性,但不受p44/42 MAP激酶抑制剂PD98059的影响(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).这些发现表明,细胞p38 MAP激酶的激活对于fmlp诱导的中性粒细胞趋化是必不可少的。gydF4y2Ba
SB20358抑制细胞p38 MAP激酶可抑制fmlp刺激的人中性粒细胞超氧化物的产生gydF4y2Ba
为了研究每种MAP激酶对中性粒细胞呼吸爆发的影响,我们分别用激酶抑制剂SB20358或PD98059预处理细胞,下调细胞p38或p44/42 MAP激酶。然后中性粒细胞暴露于FMLP,并动力学测量诱导的超氧化物生成,如下所述gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba。如图7所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba结果表明,FMLP刺激人中性粒细胞在3 min(9.285±1.538 nmol超氧化物/3 min/10)下快速诱导超氧化物生成增加8.2倍gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞(−)/ FMLP)。SB20358下调细胞p38 MAP激酶完全抑制fmlp诱导的超氧化物生成(0.762±0.104 nmol超氧化物/3 min/10)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞,SB20358 / FMLP)。然而,PD98059抑制细胞p44/42 MAP激酶对fmlp诱导的呼吸爆发(11.904±1.538 nmol超氧化物/3 min/10)无抑制作用gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞,PD98059 / FMLP)。这些结果表明,在人中性粒细胞中,细胞p38 MAP激酶的激活对FMLP刺激的呼吸爆发反应至关重要。gydF4y2Ba
细胞p38 MAP激酶对中性粒细胞IL-8产生的不同影响gydF4y2Ba
该研究如图3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2BaTNF-α诱导的中性粒细胞IL-8的产生需要p38 MAP激酶的激活,TNF-α仅刺激细胞p38 MAP激酶,而对p44/42 MAP激酶没有影响(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).在p38和p44/42 MAP激酶都被激活的中性粒细胞中,为了了解p38 MAP激酶在IL-8产生中的作用,用p38 MAP激酶抑制剂SB20358预处理细胞,并用FMLP、GM-CSF、PMA或离子霉素刺激细胞。用RIA检测中性粒细胞IL-8产生的变化,结果如图所示gydF4y2Ba材料与方法gydF4y2Ba。GM-CSF是一种造血生长因子,据报道可以增强中性粒细胞的功能(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),强烈诱导IL-8生成(3.414 ng/10)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba细胞vs基础水平0.162 ng/10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而SB20358下调细胞p38 MAP激酶可消除gm - csf刺激的IL-8产生(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).出乎意料的是,FMLP几乎没有诱导人中性粒细胞产生IL-8的能力(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),尽管它同时刺激了p38和p44/42 MAP激酶的激活(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).PMA是一种潜在的蛋白激酶C激活剂,而离子霉素是一种钙离子载体,可以激活细胞p38和p44/42 MAP激酶(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)和显著刺激中性粒细胞IL-8的产生,分别为6.552和13.11 ng/10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).然而,用SB20358预处理细胞,下调细胞p38 MAP激酶,对PMA或离子霉素诱导的IL-8产生几乎没有抑制作用(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).H7抑制细胞蛋白激酶C激活导致pma刺激的IL-8产生抑制约75%(数据未显示)。此外,中性粒细胞暴露于LPS(一种细菌产物,引发人类中性粒细胞并刺激细胞p38 MAP激酶,但不刺激p44/42 MAP激酶,如先前报道(28和29)),显著诱导IL-8的产生(7.686 ng/10)gydF4y2Ba7gydF4y2BaSB20358抑制细胞p38 MAP激酶几乎完全减少了lps诱导的IL-8产生(图8)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).这些结果表明,中性粒细胞IL-8的产生参与多种信号通路的调节,p38 MAP激酶可能在不同刺激下对中性粒细胞功能的调节中发挥不同的作用。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
据报道,FMLP刺激中性粒细胞通过Ras-和raf介导的途径激活细胞p44/42 MAP激酶(46和47)。用染料木素(一种普通的酪氨酸激酶抑制剂)处理中性粒细胞,可以降低细胞蛋白的酪氨酸磷酸化,包括p44/42 MAP激酶,并抑制中性粒细胞对FMLP的功能反应(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba).在本研究中,对细胞MAP激酶的详细分析表明,中性粒细胞暴露于FMLP诱导酪氨酸磷酸化和p38 MAP激酶以及p44/42 MAP激酶的激活(图5)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).使用特异性MAP激酶抑制剂进行的细胞功能分析表明,细胞p38 MAP激酶的激活,而不是p44/42 MAP激酶的激活,对于fmlp诱导的人中性粒细胞趋化和超氧化物生成是必不可少的(图6)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和7gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).此外,我们之前的研究表明,抑制中性粒细胞MAPKAP激酶2 (p38 MAP激酶特异性的细胞底物)可以减少fmlp诱导的超氧化物生成(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).这些观察结果强烈提示p38 MAP激酶介导的信号通路在调节FMLP刺激的中性粒细胞趋化性和超氧化物生成中起核心作用。此外,p38 MAP激酶的下调抑制了TNF-α、GM-CSF或LPS刺激的IL-8产生,而对PMA或离子霉素诱导的IL-8产生没有影响(图8)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),提示p38 MAP激酶可能与p44/22 MAP激酶一样,在人中性粒细胞对不同刺激的反应中发挥不同的作用(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba).我们之前的研究表明,在人类中性粒细胞中,一种60kda的细胞质蛋白是MAPKAP激酶2 (gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).这种60 kda的细胞质蛋白已被证明是淋巴细胞特异性蛋白1 (gydF4y2Ba50gydF4y2Ba),一种f -肌动蛋白结合蛋白。淋巴细胞特异性蛋白1是否参与p38 MAP激酶/MAPKAP激酶2调节的中性粒细胞对TNF-α或FMLP的功能反应仍有待确定。gydF4y2Ba
在本研究中,我们首次证明p38 MAP激酶信号通路参与调节人中性粒细胞IL-8的产生(图3)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和8gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).然而,p38 MAP激酶介导的IL-8产生的机制尚不清楚。最近的研究表明,TNF-α刺激人中性粒细胞可诱导转录因子NF-κB的活化和核易位(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba).基因转录研究表明,位于IL-8基因5 '侧的NF-κ b样结合位点对于TNF-α刺激下的转录激活反应至关重要(52和53)。考虑到这些发现,似乎在人中性粒细胞中,TNF-α刺激细胞p38 MAP激酶的激活,进而直接或间接激活NF-κB,并导致IL-8基因的转录/表达。因此,p38 MAP激酶是否调节细胞i -κB α的蛋白磷酸化和活性将是一个有趣的问题,细胞i -κB α是一种控制NF-κB核易位和活化的细胞质蛋白(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢John Lee博士(SmithKline Beecham)提供p38 MAP激酶抑制剂SB20358, Lawrence Rothfield博士(University of Connecticut Health Center, UCHC)微生物学系)提供设备,Elmer L. Becker博士(University of Connecticut Health Center, UCHC)病理学系)审阅论文。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba这项工作得到了Patrick and Catherine Weldon Donaghue医学研究基金会(赠款DF95-053), ucchc的RICE和ACSIR资助,以及美国国立卫生研究院赠款HL53786和AI20943的支持。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba2gydF4y2Ba请联系康涅狄格大学健康中心生理学系祖友利博士,邮编:06030-3505。电子邮件地址:gydF4y2Bayoulizu在}{panda.uchc.edugydF4y2Ba
3.gydF4y2Ba本文使用的缩写:MAP,丝裂原活化蛋白;ECL:增强化学发光;GM-CSF,粒细胞-巨噬细胞CSF;MAPKAP,丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白;NF-κB核因子-κBgydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba1997年8月18日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba1997年11月3日。gydF4y2Ba
- 美国免疫学家协会版权所有©1998gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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