干扰素诱导蛋白-10 (CXCL-10)和其他趋化因子的早期增强表达预测严重急性呼吸综合征的不良结局

摘要

背景:过度激活细胞因子/趋化因子已被认为是严重急性呼吸综合征(SARS)不良结局的一个因素。既往对趋化因子的研究仅包括少数患者，血浆趋化因子作为预后指标的应用尚不清楚。

方法:我们研究了255份在疾病发病后第1或2周收集的血浆样本。采用4色FACSCalibur流式细胞仪流式细胞球阵列检测干扰素诱导蛋白-10 (IP-10)、干扰素-γ诱导的单因子(MIG)、白细胞介素-8 (IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和活化后正常T细胞表达和分泌的调控蛋白(RANTES)。采用逆转录、实时定量PCR和免疫组化染色分析尸检时肺组织中IP-10的产生情况。使用条件logistic回归确定不良疾病结局的独立预测因子。

结果：在单因素分析中，发烧后第一周IP-10、MIG和IL-8的增加与不良结局(重症监护病房住院或死亡)相关。在第二周，只有MIG浓度与预后有关。在调整其他危险因素后，第一周的血浆IP-10浓度仍然是一个独立的预后因素，与不良结局的比值比为1.52(95%可信区间，1.05-2.55)，每增加1倍的血浆IP-10浓度高于中位数。在第二周，趋化因子提供的独立预后信息很少。死于SARS患者的肺组织中IP-10增加。

结论:在SARS症状的第一周血浆IP-10增加是预后的独立预测因素。趋化因子活化可能是SARS的早期事件，而过度的宿主反应可能产生并发症。

由一种新型冠状病毒(SARS-CoV)引起的全球严重急性呼吸系统综合症暴发12002年11月和2003年7月（之间发生1）.共报告8098宗疑似病例，死亡人数为774人(2）.SARS的临床过程的特点是发热，肌痛，以及普遍提高，几天后等全身症状，并在爆发多数患者治疗好转。有些病人，但是，遭受反复发热，血氧饱和度，并进行性肺炎（3.）（4）.此外，20%-36%的患者因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)需要有创呼吸支持(1）（3.）（5)，这与高死亡率有关。SARS致死性病例肺病理表现以弥漫性肺泡损伤、上皮细胞增生、巨噬细胞浸润为主(6）（7）（8）（9)，偶尔表现为闭塞性细支气管炎组织性肺炎(10）.

几种趋化因子，例如T-辅助（Th）-1趋化因子干扰素γ-诱导蛋白-10（IP-10）和中性粒细胞趋化因子白细胞介素-8（IL-8）均涉及在SA​​R后的疾病发病机制中涉及COV感染小鼠模型（11）.组织病理学结果表明，免疫反应失调和细胞因子过度激活在肺病变的发病机制中起关键作用(6）（12）（13）.与这一假设一致的是，在免疫缺陷的宿主中发现了相对较轻的疾病，如艾滋病毒和儿童患者(14）（15）.

具体来说，我们和其他人观察到在急性发热性疾病期间从SARS患者采集的血液样本中趋化因子浓度增加(12）（16）（17）.趋化因子活化的发烧发病后第2周在第一观察报道在20例SARS患者我们研究组（12）.黄等。17)对88例SARS患者进行了相同的趋化因子面板珠阵列实验，证实了趋化因子的激活，包括IP-10、干扰素-γ (MIG)诱导的单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)。通过单因素分析，这些趋化因子的浓度与死亡结局的风险相关。另一项对23名“沙士”病人(16）.然而，在这些研究的样本量小，样本采集的时间并没有明确记载。

只有少数的独立预测因子已经建立了非典疾病的结果。晚年，较高的中性粒细胞计数，低CD4和CD8计数，并增加血清乳酸脱氢酶（LD）的浓度是已与随后进入ICU相关的唯一标记成立（1）（5）（18）.然而，这些可能是它们自己的替代标记;身体免疫反应和疾病结果的潜在生物决定因素仍然不明确。早期标记物，特别是在发烧开始的第一周内可用的标记物，对患者分层和治疗决定很重要。此外，临床明显恶化通常发生在发热后2周。因此，我们研究了临床变量和疾病早期获得的趋化因子浓度是否会预测随后的恶化导致不良结果。

材料和方法

病人和血液样本

我们在香港威尔士王子医院微生物学和化学病理学部门从2003年3月到2003年3月，我们对SARS爆发期间储存的血液样本进行了回顾性分析。根据谁标准，所有患者均初步诊断可能的SARS。随后通过实验证据对病毒转化为SARS-COV，阳性病毒培养和/或正SARS-COV检测通过实时PCR来确认病毒。因为我们正在寻找早期预后因素，所以在发烧后的前2周内只收集的档案样本。共有255个归档血浆样品可获得（在第一周收集126个，其余129个是二期样品）。不良疾病结果被定义为来自SARS-COV感染的ICU入院或死亡（1）（19）.所有血浆样品在分析前保存在−70°C。详细的病程、生化和血液学检查结果以及共病(包括糖尿病史、慢性肺病、高血压、脑血管意外、癌症、缺血性心脏病、慢性肾衰竭和慢性肝病)从患者的临床记录中检索。所有患者均根据别处详细的标准方案进行了治疗(4）（20.）.本研究经本机构和医院研究伦理委员会批准。

血浆趋化因子的测定

我们通过使用4色FACSCALIBUR流动仪（Becton Dickinson）通过细胞计数珠阵测量炎性细胞因子和趋化因子的面板。在生物安全2级实验室内进行所有样品处理和测定。Cytrical胎圈阵列在1个测定中允许测量最多6分析物。在每个测定中，用不同的捕获抗体涂覆6个具有不同荧光性质的珠粒，用于特异性细胞因子或趋化因子。与患者样品一起孵育后，使用植物系三缀合的检测抗体形成夹心复合物，并用流动筛分表获得荧光数据。趋化因子IP-10（CXCL10），MIG（CXCL9），IL-8，MCP-1（CCL2）的浓度，并在激活正常T细胞上进行调节，表达和分泌（RANTES; CCL5）。之前描述了测定和参考间隔的分析性能（12）.

在死后的肺组织中发现Ip-10

我们研究了13例在SARS爆发时采集的死后肺组织标本，其中7例是死于SARS感染的患者，另外6例是死于与SARS感染或其他肺部病理无关的患者，以作比较。采用逆转录和实时荧光定量PCR检测IP-10的表达。用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)提取13个肺组织的RNA样本。然后用SuperScript™III逆转录酶(Invitrogen)对RNA样本进行逆转录。使用SYBR®系统(Applied Biosystems)定量PCR检测肺样本中IP-10基因的相对表达，并与管家基因β-actin的表达相对表达。IP-10和β-actin引物序列如下。IP-10转发，5 ' -TCG AAG GCC ATC AAG AAT TT-3 ';IP-10反向，5 ' -GCT CCC CTC TGG TTT TAA GG-3 ';β-actin forward, 5 ' -TAA GGA GAA GCT GTG CTA CGT C-3 ';β-actin反向，5 ' -GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG G-3 '。

免疫组化检测IP-10 (R&D Systems)。石蜡切片脱蜡后，在EDTA缓冲液中微波加热提取抗原;30毫升/ L H₂O₂然后施加以阻断内源性过氧化物酶，然后漂洗，并用CAS-块（Zymed公司）非特异性阻断孵育。与IP-10的抗体（1:20稀释）温育过夜后，将切片洗涤，SuperPicture™加入辣根过氧化物酶聚合物缀合物。用液体DAB底物试剂盒（Zymed公司）检测信号。

统计分析

因为分析物的血浆浓度不遵循高斯分布，我们使用非参数Mann-WhitneyU-test比较两组患者(预后好的和预后不良的)中分析物的浓度。分类变量之间的关联采用Fisher精确检验。使用条件logistic回归确定不良疾病结局的独立预测因素，并确定这些危险因素的调整优势比。在进行logistic回归分析之前，我们将趋化因子血浆浓度转换为中位数(MoM)的倍数，将其归一化。MoM的使用使这些分析物在其他实验室使用不同的分析方法的未来应用成为可能。为了反映临床情况，我们开发了2个logistic回归模型，用于发热发病后第一周和第二周可用的变量。具体来说，只有在特定时间点可用的变量被输入到多变量logistic模型中，以确定独立的预后特征。采用SPSS (SPSS Inc)进行统计学和ROC分析。

结果

病人和血液样本

收集了183例患者的血液样本，中位(范围)年龄为35.5岁(15-100岁)。其中63%是女性。41例(22%;20名男性和21名女性)有如上定义的不良结局。有不良结局的患者年龄[中位数(四分位数范围，IQR)， 49(40-72)岁]比其他患者年龄[33(26-44)岁]大。

前2周循环趋化因子浓度变化

大多数第一周样本(126个样本中的82%)是在发烧发作后3至6天收集的。IP-10、MCP-1、MIG、IL-8和RANTES的中位血药浓度分别为4020、48.8、540、11.7和29 800 ng/L(表1)¹）.IP-10(88%的患者)最常出现血药浓度升高，其次是RANTES(78%)和IL-8(58%)。

大多数第二周样本(129份样本中的70%)是在发烧发生后的第9至12天收集的。第2周IP-10和MCP-1的血药浓度显著低于第1周(P< 0.05, Mann-WhitneyU-test)， 65%和28%的患者这些趋化因子浓度增加。大多数患者(87%)RANTES浓度升高。

其他生化和血液学指标的改变

大多数患者入院时血浆LD活性增加[中位数(IQR)， 215 (178-296) U/L;参考上限，213 U/L;图1¹］.两组患者(预后好和不良)发病后2周内LD均呈上升趋势。然而，有不良结局的患者LD浓度要高得多。

总淋巴细胞计数和绝对中性粒细胞计数均在第二周内显着增加的类似趋势。同样，患有不良结果的患者在所有3个时间点都有显着更高的计数。绝对淋巴细胞计数显示出疾病进展的下降趋势。患有不良结果的患者在第5天和第12天具有显着较低;然而，2组的淋巴细胞计数在入院时没有差异。

SARS患者的预后标志物

单因素分析显示，两组患者在大多数常规临床实验室值上存在显著差异(图1)¹）.调查的9项既往病史中，只有脑血管意外史与疾病转归差相关(P<0.05, Fisher精确检验)。既往脑卒中发生率在病情较重的患者中为12%，在预后良好的患者中仅为2%。

循环趋化因子浓度作为独立的预后指标

在发烧后的第一周，3种趋化因子(IP-10、IL-8和MIG)的浓度在有利和不利结局组患者之间存在差异;因此，这些趋化因子是潜在的预后标志物(表2)²）.在第一周，IP-10浓度比中值(≥5250 ng/L)高出1.5倍，优势比为3.7(95%置信区间，1.5 - 9.2;P<0.005）用于随后的恶化导致不利后果。然而，在第二个星期，只有一个趋化因子，MIG，浓度增加与单因素分析疾病预后不良。

为了确定不良疾病转归的独立预测因子，我们开发了2个logistic回归模型用于第一周和第二周的生化指标。由于趋化因子和LD浓度不服从高斯分布，它们分别归一化为MoM和上参考值的倍数。第5天和第12天的常规实验室结果也输入相应的logistic回归模型。

两种logistic回归模型的结果如表3所示^3.．在第一周可获得结果的变量中，确定了4个不良结局的危险因素。分别为患者年龄、入院时血浆LD浓度、入院时中性粒细胞绝对计数和第一周血浆IP-10浓度。有趣的是，当第12天的实验室调查结果出来时，这些变量并不是疾病后期有用的预测因子。当时，只有血浆LD浓度(第12天)和绝对中性粒细胞计数(第12天)是不良疾病结局的重要预测因素(表3)^3.）.

第一周血浆IP-10浓度的ROC分析证实了该标志物在预测疾病结局方面的临床应用价值。曲线下面积为0.74，显著值>0.5 (P<0.001;图2²）.在特异性为50%的情况下，第一周血浆IP-10浓度的敏感性为75%，可用于识别随后出现不良临床结局的患者，这一结果表明，IP-10浓度可用于临床对患者进行更积极的干预。

SARS-C患者死后肺组织的研究 oV感染

呼吸衰竭是致命SARS感染的一个重要特征。7例病人的尸检结果已被描述过(10）.简言之，肺显示弥漫性肺泡损伤，肺水肿和透明膜形成。局部出血。

IP-10基因表达显著增加(P<0.05)，与6例非典型肺炎患者的肺组织标本相比。在SARS致死患者的尸检肺组织中，β-actin mRNA归一化后IP-10的相对表达指数为7.1 ~ 352倍，而非SARS患者肺组织中IP-10的相对表达指数为0.6 ~ 1.5倍。免疫组化IP-10染色也证实了SARS患者肺组织中肺细胞和肺泡巨噬细胞的蛋白生产增强(图3)^3.）.

讨论

SARS感染的挑战引起了全世界的医疗反应。该病毒已被很好地描述到基因组规模(21)，并简化了实验室诊断(22）.通过血液逆转录- pcr检测可在发热后48小时内实现快速诊断(23）.器官损伤和疾病结果的因素的发病机制，但是，仍然没有很好的理解。

虽然大部分沙士病人经治疗后痊愈(20.)， 20%以上发生ARDS，需要有创机械通气。SARS患者肺组织病理检查显示弥漫性肺泡损伤，肺水肿明显，肺透明膜形成。晚期表现为肺泡内组织和间质增厚，并伴有轻至中度纤维化。一些患者也有闭塞性细支气管炎组织型肺炎样病变(9）（10）（24）.这些组织学发现表明免疫反应异常是sars引起的肺部病变的关键组成部分。

细胞因子，特别是趋化因子，是白细胞和其他炎症细胞募集的关键介质，导致肺损伤，并与ARDS/弥漫性肺泡损伤的发病机制有关(25）.在之前的一项研究中，我们发现几种趋化因子，包括IP-10、MCP-1和IL-8的血浆浓度在SARS感染后显著升高，而其他细胞因子，如肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ (IFN-γ)只在一小部分患者中升高(26）.在其他原因继发的ARDS中，已经研究了趋化因子的产生。IL-8，一种α-趋化因子，是研究中最常见的趋化因子，在ARDS发病前后支气管肺泡灌洗液和体循环中均发现IL-8升高(27）.有报道提示支气管肺泡灌洗液和/或血液中的趋化因子浓度可预测ARDS的预后(27）（28）.

一些研究对SARS感染中的细胞因子趋化因子反应进行了研究。Zhang et al. (29)对60例SARS患者在症状期(第3-7天)的血清细胞因子浓度进行了研究。他们证实，许多“经典”细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、IFN-γ和IL-1α，在SARS感染期间没有增加。血清细胞因子浓度的变化发生在咽部SARS-CoV病毒载量达到峰值后，提示细胞因子是诱发肺部和全身炎症的介质(30.）.在一项23例患者的研究中，Jiang等人(16）SARS患者肺组织中IP-10表达证实发现显着增加的IP-10。在最近的一项研究由黄等人。（17）试图关联通过单变量分析的临床结果与趋化因子的浓度的88名患者于样品中。虽然IP-10，MIG，MCP-1和IL-18的高浓度与不良临床过程相关联的，它们不调整其它已建立的临床变量，包括年龄和血浆浓度LD，这是重要的预后因素。

在这项研究中，我们已经表明，IP-10（CXCL10），MIG（CXCL9）和MCP-1（CCL2）在SARS感染的早期阶段均显著上升。此外，在发烧发病的第一周增加了两个IP-10和MIG的血浆浓度与临床预后较差（表2²）.同样，第一周高浓度的IL-8也与不良结局相关。有趣的是，单因素分析显示，MIG增加是第二周临床预后差的唯一相关趋化因子。在控制其他预后因素后，第一周的IP-10是不良结局的独立预测因素。

IP-10和MIG都是淋巴细胞靶向CXC趋化因子，作用于共同受体CXCR3，它们是由激活的支气管上皮细胞在应对感染时高浓度产生的(31）.CXC趋化因子- cxcr3级联的激活与肺移植后闭塞性细支气管炎综合征的病因有关(32)、爱滋病的淋巴细胞性肺泡炎(33)及肺纤维化(16）.易感小鼠感染SARS-CoV也诱导产生IP-10和MIG及其受体CXCR3，表明这一级联反应在小鼠感染SARS-CoV中起关键作用(11）.我们还证实了在SARS患者肺标本中IP-10 mRNA和蛋白的高浓度。

一些研究报道，一些常规实验室检查结果可预测SARS感染后的不良临床结局。我们的研究证实，年龄、入院时血浆LD浓度和绝对中性粒细胞计数是不良结局的独立预测因素。这3个预测因子已经被不同的研究不同患者队列的不同小组一致确定(1）（18）（34）.此外，我们首次注意到，发病第一周高IP-10浓度是不良结局的独立危险因素。所有这些预后指标在临床环境中都很容易适用，并且是可以在发病第一周内测量的早期标志物。另一方面，在第12天获得的LD活性和中性粒细胞计数之外，第二周的趋化因子浓度提供了信息。第一周后LD活性持续增加可能是不良预后的最佳指标，从当时的临床状态来看，这可能也是相当明显的。

在未来的应用中，特别是在使用其他检测方法的实验室中，IP-10浓度的中位数可以从整个患者组(如SARS患者)中确定，而那些比中位数高出1.5倍的患者发生不良后果的风险将增加3.7倍。

综上所述，我们确定了可以在第一周的SARS症状出现后进行检测的预后因素。高IP-10的浓度为不良预后的独立指标。趋化因子级联的表达出现在对SARS冠状病毒，并与广泛的实质损害和不良临床结果相关联的随后的强烈免疫反应的综合免疫反应中发挥着重要作用。

本项目由中国香港特别行政区研究资助局资助(项目编号:中大4507/03M)。