总结
Tbx4属于T-box家族的转录因子基因,它已被证明在发展发挥着重要作用。我们有伤口Tbx4函数在鼠标使用有针对性的突变。无效等位基因的纯合子胚胎未能接受绒毛膜尿囊的融合和性交后死于10.5天。的尿囊Tbx4突变体胚胎发育不良、凋亡和显示不正常分化。内皮细胞突变尿囊内不进行血管重建。杂合的胚胎表现出温和、瞬态增长尿囊的缺陷。感应通常发生在下肢的字段Tbx4突变体和初始后肢芽出现正常的模式。然而,后肢芽Tbx4突变体不能开发体内或体外,不维护Fgf10间质表达。的表达另一个密切相关的T-box基因,Tbx2在下肢和减少尿囊Tbx4突变体胚胎之前公开的发展形态异常,这表明Tbx4调节Tbx2在这些组织。
介绍
T-box基因编码转录因子家族的一员,它们含有一种守恒的dna结合主题称为T-box域(Papaioannou, 2001)。这个家庭的成员表达动态在开发期间,和T-box突变基因对生物体从发展产生深远的影响秀丽隐杆线虫给人类。在脊椎动物中,Tbx2亚科T-box基因由四个成员,Tbx2、Tbx3 Tbx4和Tbx5(Ruvinsky et al ., 2000在脊椎动物),所有成员已经克隆(鼠标、小鸡和人类)他们是高度保守的。的Tbx2亚科由两对相关基因,被认为是祖先的串联重复的产品,其次是重复和分散的二基因集群(Agulnik et al ., 1996)。一个集群的基因,Tbx3和Tbx5导致人类主导发展综合征,称为ulnar-mammary (Bamshad et al ., 1997)和Holt-Oram (森et al ., 1997;李et al ., 1997分别)症状。在鼠标,突变Tbx3和Tbx5也引起发育异常(Bruneau et al ., 2001;达文波特et al ., 2003)。没有其他集群的突变基因,Tbx2和Tbx4,已报告。
第一个表达式的Tbx4老鼠胚胎中观察到7.5天邮报性交(dpc)在发展中尿囊。这个表达式保持至少9.5 dpc (查普曼et al ., 1996)。尿囊是一个胚外中胚层结构形式之间的连接后胚胎在发育的早期阶段和绒毛膜。这个结构后来发展成脐,哺乳动物的营养至关重要,浪费和母亲和胚胎之间的气体交换。尿囊的分子途径参与发展不是很透彻了。然而,一些有针对性的突变小鼠指出,骨形成蛋白(BMP)信号为尿囊发展是至关重要的。胚胎基因突变为Bmp4缺乏一个尿膜(劳森et al ., 1999),胚胎嵌合缺乏Bmp4具体的外胚层血统形式只有一小绒毛膜尿囊,无法融合(藤原et al ., 2001)。尽管Bmp5——也Bmp7突变的老鼠尿膜缺陷,胚胎的尿囊双重的纯合子突变不能接受绒毛膜尿囊的融合(Solloway和罗伯逊,1999)。Bmp8b突变体也有缩短尿囊,和减少数量的原始生殖细胞(应et al ., 2000)。此外,突变的下游效应器BMP信号,Smad1(Madh1-老鼠基因组信息学)和Smad5(Madh5-老鼠基因组信息学),产生异常的尿囊形态,虽然不是那么严重的骨形态发生蛋白突变(Chang et al ., 1999;Lechleider et al ., 2001;Tremblay et al ., 2001)。
几个基因的过程中绒毛膜尿囊的融合已确定。粘附分子VCAM1,表达的远端提示尿囊,及其受体,α4整合素,蛋壳中表达,都是成功所需绒毛膜尿囊的融合(Gurtner et al ., 1995;Kwee et al ., 1995;杨et al ., 1995)。此外,一些转录因子,需要适当的绒毛膜尿囊的融合已确定有针对性的突变,包括forkhead转录因子Foxf1(Mahlapuu et al ., 2001),抑制器的无毛同族体RBP-Jκ(Rbpsuh老鼠基因组信息学)(奥卡河et al ., 1995)。这些不同的信号之间的连接(s)因素,粘附分子和转录因子尚未阐明,以前没有在这个过程中的作用已被确认Tbx4。
在器官形成过程中,Tbx4表达在不同的组织,包括下肢、肛道,下颌间质,肺间质,心房和体壁(查普曼et al ., 1996)。下肢的表达Tbx4启动9.5 dpc后侧面地区称为下肢,前后肢芽形成。Tbx5,另一个Tbx2亚科成员,镜子这个表达式模式与forelimb-specific表达式从8.5 dpc,当前肢字段中指定的前侧面。这种互惠的表达Tbx4和Tbx5分别在下肢和前肢,维护整个开发(查普曼et al ., 1996;Gibson-Brown et al ., 1996)。
以前的工作建议Tbx4扮演一个角色在决定下肢的身份。移植肢体间质和异位诱导四肢的小鸡显示比例之间的对应关系Tbx4和Tbx5表情,和程度的前肢和后肢的命运(Gibson-Brown et al ., 1998;艾萨克et al ., 1998;Ohuchi et al ., 1998)。异位表达Tbx4和Tbx5在发展中小鸡四肢导致肢体异常,可能代表肢体身份转换(Rodriguez-Esteban et al ., 1999;竹内et al ., 1999)。证据与homeodomain实验提供的蛋白质Ptx1(Pitx1——老鼠基因组信息学)表示特别的下肢(Lanctot et al ., 1997;商et al ., 1997),也建议后肢规范中扮演一个角色。定向诱变Ptx1生产与缩短小鼠后肢骨骼特征的前肢(Lanctot et al ., 1999;Szeto et al ., 1999)和异位表达Ptx1在小鸡前肢导致的upregulationTbx4的感应,hindlimb-specific Hox基因Hoxc10和Hoxc11(洛根和Tabin, 1999年)。
解释功能的实验Tbx4, Tbx5和Ptx1在小鸡是由内生的存在困惑Tbx4和Tbx5在实验的四肢,肢体异常引起的过度Tbx4和Tbx5,即使在他们的内生域(Rodriguez-Esteban et al ., 1999;竹内et al ., 1999)。我们因此使用定向诱变调查的作用Tbx4在下肢和其他地区的发展Tbx4表达式,包括尿囊。
材料和方法
一代的Tbx4突变小鼠
创建一个目标向量使用总共7.3 kb 129 sv / J噬菌体的基因组DNA库(Stratagene、目录编号946309)。一个欣dIII /生态包含外显子4和5是subcloned房车片段,和一个loxP在PGK -neoPGK -胸苷激酶双重选择磁带是插入到第一Spe我的基因内区5 (图1一个),同源性3 kb上游和下游5.3 kb,分别。包含第三个寡核苷酸loxP网站,以及Kpn我,新人道我和Xho我网站,结扎了Xho我网站1.5 kb 5′选择磁带的基因内区4。Theβ肌动蛋白白喉毒素基因(麦克斯韦et al ., 1987)插入到目标的远端5′末端盒式对随机整合消极的选择。这个目标构造线性化和electroporated R1胚胎干细胞(Nagy et al ., 1993)。G418抗性殖民地为同源重组事件被南部杂交筛选,使用5′和3′基因组探针(图1 b,C)。大约三分之二的包含目标的克隆neo-tk磁带也包含了5′loxP网站。
嵌合体生成目标ES细胞注射到C57BL / 6 j胚泡。ES细胞衍生嵌合体后代,后代经常被使用引物PCR基因分型(a) 5′-GAGGATGTTCCCCAGCTAC-3′和(b) 5′-CAGTCTGAGAGGGTCAGACTC-3′(图1一个,D),检测内生带500个基点和550个基点的插入突变带包含工程loxP网站。老鼠的杂合的Tbx4tm1Pa等位基因被交配老鼠携带cre转基因β-actin启动子的控制(Lewandoski和马丁,1997年),生成Tbx4tm1.1Pa等位基因的切除选择磁带和一个1.5 kb基因组区域(图1一个)。确认的cre -介导的切除loxP在序列和基因的老鼠Tbx4tm1.1Pa与引物进行等位基因(a)和(b),和(c) 5′-TCATCTAGGCTTCACAGCC-3′,产生250个基点乐队(图1一个,D)。
收藏的胚胎
这两个Tbx4tm1Pa和Tbx4tm1.1Pa等位基因是维持复杂的遗传背景。老鼠杂合的intercrossed生成每个等位基因纯合突变体胚胎。那天中午dpc交配塞被认为是0.5。胚胎切割在磷酸缓冲盐(PBS)牛白蛋白(V)比例为0.2%。所有胚胎都得分为卵黄囊切除前绒毛膜尿囊的融合。PCR基因分型和胚胎卵黄囊被固定在4%多聚甲醛在PBS 4°C两小时或过夜,然后在甲醇脱水和存储。
胚胎切割得分在8.0 dpc体节数和尿囊伸长的程度到卵黄囊腔。因为整个胚胎大小相当发展变量在这一点上,尿囊伸长测量之间的距离的比例后的胚胎和绒毛膜板的边缘。尿囊得分为:“早期”如果他们覆盖三分之二或小于这个距离;“晚”如果他们覆盖超过三分之二的距离或如果他们进入穹顶由绒毛膜板;或“融合”如果他们形成蛋壳的连接。
原位杂交和免疫组织化学
包埋原位杂交进行根据先前描述的协议(1993年威尔金森和分担)。免疫组织化学是根据标准执行协议(戴维斯,1993),除了VCAM1免疫组织化学,DMSO省略了漂白剂,PBSMT洗都换成PBSBT (4% BSA, 0.1% Triton x - 100在PBS)和初级抗体稀释1:15 0。胚胎用于双重磷酸化ERK蛋白(dp-ERK;EPHB2——老鼠基因组信息学)免疫染色的肢芽前漂白促进抗体渗透。主要的抗体使用包括:anti-VCAM1 (PharMingen目录号55333 o), anti-phospho-Histone H3(北部生物技术、产品目录号06570),anti-PECAM (PharMingen、目录号01951 d)和anti-phospho-p44/42 (anti-dp-ERK;细胞信号传导,目录编号9101)。二次抗体都是peroxidase-conjugated山羊从杰克逊免疫化学免疫球蛋白。
热解色谱检测
胚胎切割8.0 dpc,得分高于和基因分型。后半固定在4%多聚甲醛在PBS 1小时在4°C,和70%的乙醇脱水3 - 6小时。胚胎在NTMT水化,然后沾电视台/ BCIP颜色反应3分钟(1993年威尔金森和分担)和拍照。
TUNEL分析
末端转移酶biotin-dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色进行使用细胞死亡检测设备(罗氏公司,产品目录号1684817)。胚胎孵化10μg /毫升蛋白酶K 8 - 10分钟根据阶段,和修复的在4%多聚甲醛,0.1%戊二醛在室温下20分钟。胚胎孵化在TUNEL反应混合物在37°C 1小时,封锁与10%的羊血清PBT 1小时和孵化converter-POD混合相同(工具包)30分钟37°。显色反应是发达NiCl为0.08%2250μg /毫升diaminobenzidine PBT大约30秒。
组织学
同时在8.25 dpc和9.5 dpc,组织学和基因分型是不可能的,胚胎被归类为突变或正常尿囊外观和融合的基础上。从分析三个胚胎被丢弃,因为他们非常迟钝而同窝出生的。胚胎9.5 8.25 dpc和dpc被完好无损的子宫角和固定在Bouin在一夜之间解决。胚胎在10.5 dpc解剖蜕膜,基础的卵黄囊切除之前类似的固定。在乙醇脱水后,胚胎是嵌入在石蜡切片8μm厚度和苏木精和伊红染色。
肢芽文化
肢芽在10.5 dpc解剖与10毫米玫瑰和5% FCS DMEM补充。外植体来自胚胎只有胚胎还活着,强劲跳动的心脏。胚胎是切断立即吻侧和尾肢芽(见图4,F)。组织的腹侧肢芽,包括心脏和尿囊,修剪,外植体被腹朝下Transwell清晰(配角)膜。外植体培养4 - 7天在DMEM / F-12 (Gibco BRL)与10% FCS (Hyclone), 5×水户+血清Extender(355006号,正欲目录)37°C公司5%2在空气中。
结果
一代和继承的Tbx4突变的等位基因
的Tbx4通过同源重组基因被插入中断,在胚胎干细胞,loxP网站和一个loxP在neomycin-thymidine激酶选择磁带到周围外显子内含子5 (图1一个,Tbx4tm1Pa等位基因)。正确的目标确定了胚胎干细胞线印迹南部(图1 b,C)。有针对性的ES细胞被注入C57BL / 6 j囊胚创建嵌合体,交配的确定生殖系突变等位基因的传播Tbx4tm1Pa。的两个ES细胞系的传播Tbx4tm1Pa等位基因产生的独立目标的事件。老鼠来自两个细胞系有相同的表型,结果结合在这份报告。老鼠的杂合的Tbx4tm1Pa等位基因小鼠无所不在地表达β-actin——交配cre转基因(Lewandoski和马丁,1997年)切除选择磁带和液氧外显子5,从而创建Tbx4tm1.1Pa等位基因(图1一个)。
等位基因的杂合的老鼠显然是正常和肥沃。杂合子是intercrossed生成胚胎为每个等位基因纯合子。这两个Tbx4tm1Pa等位基因和Cre-recombinedTbx4tm1.1Pa等位基因在孟德尔遗传的比率,但所有纯合突变体解剖后10.5 dpc都死了(表1)。在窝被允许去,没有观察到在刚断奶的纯合突变体(n= 397,n= 108,Tbx4tm1Pa和Tbx4tm1.1Pa等位基因,分别)。所有的分析,包括原位杂交过程的肢体标记基因,进行胚胎为每个等位基因纯合子。结果都是相同的,所以已经结合在这个报告。
发展和形态的缺陷Tbx4纯合突变体
Tbx4-homozygous-mutant胚胎显示没有明显形态异常,直到8.0 dpc,当一个尿膜缺陷变得明显。在这个年龄段,正常的胚胎有格式良好的尿囊,拉长后的胚胎和保险丝绒毛膜板6 - 8-somite阶段(图2一个)。Tbx4同龄的突变体胚胎显示尿囊扩展只有经过卵黄囊腔的中途,和6 - 8-somite阶段突变体胚胎未经绒毛膜尿囊的融合(图2 b)。Homozygous-mutant胚胎在同一阶段正常的同胞。9.5 dpc,正常胚胎形成一个厚,血管脐(图2 c)连接胎盘的胚胎,而突变体胚胎卵黄囊保持宽松,未婚胎盘(图2 c)。没有其他异常被认为在9.5 dpc。
10.5 dpc,Tbx4突变体胚胎卵黄囊松:一些显示心包囊肿胀和/或出血(图2 d),许多人死亡,根据没有心跳。所有纯合突变体解剖后10.5 dpc都死了(表1)。而不是野性的脐船只类型(图2 e),10.5 dpc突变体胚胎的尿囊周围形成一个紧凑的非晶质干脆烧掉囊泡(图2 f)。没有明显泄漏残余尿囊的血液进入卵黄囊腔。在最新的阶段达成的纯合突变体在他们死之前(∼29 - 32体节),突变体胚胎形态明显的后肢芽(图2 d)。后肢芽在27 - 29-somite突变体胚胎somite-matched正常大小的同胞很相似,但规模适度减少30 - 32-somite突变体胚胎相比,somite-matched控制。
两个10.5 dpcTbx4突变体胚胎(代表不到1%)曾被观察到在发展中尿囊与浆膜的连接。这两种胚尿囊是小而不规则,多个干脆烧掉室组成。在每种情况下,尿囊依附于绒毛膜是只有一个点,而且没有绒毛膜表面传播。没有明显的连续船之间形成胚胎、胎盘和血液流动可被检测到。
组织学检查Tbx4突变体胚胎
8.25 dpc胚胎的组织学检查显示多个异常的尿囊Tbx4突变体胚胎。这个阶段的野生型尿膜(n= 10)是一个漏斗形状的结构紧密反对绒毛膜宽端和逐渐减少对胚胎的后端(图2 g)。胚胎附近的间质致密均匀,而附近的绒毛膜松散,形成空洞。在突变体胚胎(n= 2),尿囊并不是反对绒毛膜板,没有证据表明allantois-derived绒毛膜细胞附着(图2 h),尽管绒毛膜本身出现正常。突变尿囊显示密度,不规则细胞尿囊的基地,与多个被称作囊泡(图2我)和大量致密的原子核,这是象征死亡的细胞。
9.5 dpc,野生型胚胎的尿囊(n= 4)由中等密度间质与浆膜附近一个更加开放的结构。血管运行通过尿囊是可见的(图2 k)。相比之下,突变的尿囊在此阶段(n= 1)小而致密,有很多浓缩细胞(图2 j,l)。10.5 dpc,部分通过一个野生型胚胎显示发展中后肢芽和脐船(图2米)。部分通过Tbx4突变出现水肿,但原本正常的胚胎组织的发展,包括肺芽,心,在前部和后肢(图2 n,O)。然而,尿囊在这个阶段没有进一步发展,与多个形状不规则,由不规则的间质,浓密的冷凝和偶尔的细胞空泡(图2 o)。
生长和细胞增殖Tbx4突变体尿囊
胚胎切割8.0 dpc打进了尿囊表型和体节数(图3)。野生型和突变体胚胎之间的差异变得明显早在4 - 5-somite阶段,当野生型胚胎大多是在尿囊后期阶段或绒毛膜板但大多数融合Tbx4突变体仍处于早期萌芽阶段。杂合的胚胎在4 - 5-somite展览尿囊的滞后发展阶段与somite-matched相比野生型控制。在6至8-somite阶段,几乎所有的野生型、杂合的胚胎绒毛膜尿囊的融合,而大多数突变体胚胎在早期尿囊阶段。所有的野生型和杂合的胚胎绒毛膜尿囊的融合过去8-somite阶段完成。
进一步探讨尿膜生长缺陷,我们对细胞增殖和细胞死亡的速度在这个组织。在突变尿囊细胞增殖(图3 c)是与野生型相同的胚胎阶段(图3 b),和有丝分裂细胞尿囊的各级,包括远端提示。TUNEL染色显示很少或没有凋亡细胞死亡野生型胚胎(尿囊的图3 d),而homozygous-mutant胚胎表现出广泛的细胞死亡在整个尿囊的远端提示(图3 e)。
尿囊内异常分化Tbx4突变体
尿囊的细胞分化能力的缺失Tbx4评估通过分析一系列基因的表达特征表达模式在正常尿囊的发展。Bmp4表达式,它需要适当的尿囊发展,是明显的野生型(图3 f)和突变(图3 g尿囊。Tbx2表达野生型尿膜(图3 h)从其早期形态出现,直到9.5 dpc (Chang et al ., 1999;Mahlapuu et al ., 2001)(L.A.N. V.E.P.,未发表)。在Tbx4纯合突变体,Tbx2表达缺失或大幅减少的尿囊2-somite胚胎(图3我),完全缺席的尿囊后胚胎(数据未显示)。
与以前的工作发表的这个实验室(查普曼et al ., 1996),我们无法检测Tbx5表达在尿囊包埋原位杂交。没有Tbx5表达式的尿囊突变体和野生型的胚胎从7.5到8.5 (dpc) dpc,虽然表达心中的新月是可见按预期从7.5 dpc末开始(数据没有显示)。brachyury基因(T),这标志着原条,脊索和尿囊的基础,通常表达的Tbx4突变体尿囊(数据没有显示)。VCAM1,尿囊融合所需的细胞粘附分子,被抗体染色的极端末端融合8-somite野生型胚尿囊(图3 j),但未溶化的远端提示的缺席Tbx4突变体尿膜(图3 k)。
原始生殖细胞碱性phosphotase-positive细胞(包括)形成一个组底部的尿囊8.0 dpc,前不久他们沿着背肠系膜迁移到未来的性腺。他们的形成是受损的BMP路径突变影响尿囊发育(劳森et al ., 1999;Tremblay et al ., 2001;应et al ., 2000)。在野生型(图3 l)和Tbx4-mutant (图3米似乎)胚胎,包括类似的数量和位置。
评估血管化的尿囊,我们检查了外观PECAM-1 (PECAM -老鼠基因组信息学),晚期内皮细胞发展的标志。在野生型胚胎在0 - 2-somite阶段,anti-PECAM-1抗体标记小尿囊的内皮细胞团(图3 n)。在3 - 4-somite阶段,这些PECAM-positive细胞形成多个小型船舶(图3 o)。由6 - 8-somite阶段,这些血管在很大程度上收集到中央船(s)尿囊的底部,与非公司船只仍然明显远侧地(图3 p)。在Tbx4突变体,表达PECAM-1正常启动(图3 l),但很快就获得一个截然不同的外观。许多小块PECAM-positive细胞出现尿囊的长度,但是这些不能拉长到血管和没有中央血管形成(图3 o,P)。
体外培养的Tbx4突变突起物
调查的作用Tbx4在下肢发展超越死亡的时间Tbx4突变体胚胎,从10.5 dpc胚胎肢芽生长在文化。前肢和后肢芽都从活10.5 dpc突变体胚胎切割,同窝出生仔畜控件,并移植到膜悬浮在增长媒体(图4 b,C,G,H)检查他们的发展潜力。经过3天的增长,前肢味蕾的正常(图4 d)和纯合子Tbx4突变体胚胎(图4 e)表现出的增加之间的距离左右远端肢体利润率,对应中线四肢的产物。培养肢芽也认为桨状形态的四肢handplate阶段。在同一文化时期,野生型后肢芽也远侧地扩大和开发了一个可辨认的桨状handplate (图4我,n= 23),但突变后肢外植体未能开发任何明显的肢体结构(图4 j,n= 11)。来验证这些肢体结构的身份,原位杂交过程进行培养的外植体使用Tbx4探测器删除地区以外的后肢标记(图1一个)。纯合突变体的突变转录表达正常阶段检查。Tbx4显然是表达野生型handplate桨的胚胎(图4 k),但它是表示只在一些分散的细胞,且没有明显的肢体形态,在突变体胚胎(图4 l)。
后肢芽开始在Tbx4突变体
解释的缺乏增长Tbx4突变突起物文化尽管存在形态明显的后肢芽,我们对基因的表达被认为与肢体形成的启动和维护(马丁,2001)前突变表型的发展。肢体产物是由mesenchymal-ectodermal反馈循环。从肢体间质场信号覆盖外胚层Fgf10诱导顶端外胚层的脊(AER)。肢体外胚层然后信号间质通过一些分子,包括fgf。这种互惠的信号是必要的维护许多肢体间质基因,包括Fgf10。
Fgf8是一个爱尔兰的早期标志,表示通常在一个狭长的野生型和背腹侧的边缘Tbx4突变后肢芽(图5,B),这表明成功的爱尔兰发生的初始感应。Msx1位于下游的肢体外胚层的信号(小王和沙逊,1995),也表示正常Tbx4突变突起物(图5度,D)。扭曲的基因,这是需要在肢体间质FGF-mediated反馈回路和适当的FGF受体表达肢体间质(O’rourke et al ., 2002;祖尼加et al ., 2002),也表示正常Tbx4突变体(图5 e,F)。
确认Tbx4突变体肢体间质接收来自外胚层FGF信号,我们检查了双重磷酸化ERK蛋白的分布(dp-ERK)时存在激活FGF受体激活增殖激酶(MAPK级联)。在这个早期阶段,四肢感应,dp-ERK染色发现不对称的突起物染色首先出现在右后肢(图5克),尽管它横置在发展先进的四肢(数据未显示)。dp-ERK中观察到的Tbx4突变后肢芽在相同的不对称模式,展示间充质接待外胚层的FGF信号(图5克,H)。然而,尽管一个明显肢体感应和FGF-feedback信号正常,Fgf10不维护Tbx4后肢间质和只看到侧面的后肢芽(图5我,J)。作为Fgf10肢体需要结果,这个缺陷可以解释的缺失Tbx4突变体下肢开发体外。
下肢的模式Tbx4突变体
作为Tbx4表达式是特定于下肢,假设有一个角色指定后肢身份,我们检查了其他基因前,后肢骨骼之间的微分表达式。的领域Tbx5,通常表示特别的前肢,一成不变的在吗Tbx4突变体胚胎(图6,B),这表明Tbx4没有作用在维护这个微分表达式。同样,Tbx4表达域(用一个探测器删除地区)以外的后肢被保留Tbx4突变体(数据没有显示)。Ptx1,这是发生在下肢领域Tbx4,也没有改变Tbx4突变体下肢字段(图6 c,D)。不幸的是死亡Tbx4突变体胚胎体内和体外没有下肢增长,排除之后的研究前后肢特定的基因,如limb-specific Hoxc基因。
我们还研究了早期标志物的背腹侧的后肢和轴前/后形成。Msx2表示,这标志着腹肢外胚层,罕见Tbx4突变后肢芽(图6 e,F)。我们无法观察的表达嘘的明确的标记后偏振带活动(ZPA)功能,这个基因不表达的后肢直到10.5 dpc,之后Tbx4突变体都死了(数据没有显示)。然而,我们做了检查dHand(Hand2-老鼠基因组信息学),位于上游的嘘也通常局限于肢芽的后边缘。在Tbx4突变后肢芽,dHand表示在整个的远端边缘花蕾,表明缺陷模式(前/后图6克,H)。dHand通常是排除在前肢芽激活表达在前,这是正常的Tbx4突变体(数据没有显示)。Tbx3下肢所需,也是形成(Bamshad et al ., 1997;达文波特et al ., 2003),是正确表达的后缘Tbx4突变后肢芽(图6我,J)。
Tbx2也通常表达后下肢保证金在这个阶段,虽然肢体发展功能尚未分配给它。Tbx2是缺席Tbx4突变后肢芽(图6 k,l)。这表明Tbx4位于上游的Tbx2至少在两个组织,尿囊和下肢。
讨论
的函数Tbx4突变的等位基因
我们的工作描述的两个突变等位基因Tbx4基因在表型上难以区分。的Tbx4tm1.1Pa等位基因将第5外显子,编码的大部分5′T-box域的一半Tbx4。因为用非单位外显子,外显子5是切除还创建了一个转移在随后的外显子。的Tbx4tm1.1Pa成绩单,如果翻译,只会产生n端138个氨基酸的蛋白质。这个假设的截短蛋白dna结合蛋白T-box域和缺乏大型c端域,因此预测功能无效。
的Tbx4tm1Pa等位基因的插入lox网站和液氧选择磁带到周围外显子内含子5,这将创建不中断Tbx4外显子序列或接头地点。然而,这种等位基因的表型是不可区分的null,这表明这些intronic插入导致深刻的基因中断。这一中断可能是由于外生启动子和神秘的拼接网站中发现的neo选择磁带,这两个基因已被证明破坏函数当插入一个非编码区(麦克德维特et al ., 1997;迈耶斯et al ., 1998;Nagy et al ., 1998)。这些报告只显示部分基因中断;然而,他们只涉及neo盒,而我们使用neo-tk录音带。附加的tk导致额外的外源基因启动子和一个聚腺苷酸化的网站,这可能加剧的干涉neo-tk录音带。或者,Tbx4轨迹可能尤其容易拼接中断,或Tbx4剂量敏感性可能是这样的,即使部分中断Tbx4低于最低阈值限制。
尿囊的发展Tbx4突变体
Tbx4突变体的第一个展览一个缺陷在8.0 dpc,当他们证明短尿囊和绒毛膜尿囊的融合的失败。在这个年纪,homozygous-mutant、杂合的和野生型胚胎显示相当大的重叠,表型(图3)。这个阶段是唯一出现的杂合的效果Tbx4在绒毛膜尿囊的融合,导致延迟,尽管所有的杂合的胚胎最终接受绒毛膜尿囊的融合,成为区别野生型的同胞。然而,纯合子Tbx4突变体很容易区别同窝出生的绒毛膜尿囊的融合的失败。
我们认为的死亡Tbx4纯合突变体在10.5 dpc绒毛膜尿囊的融合的失败。在缺乏一个脐,胚胎不能交换气体、营养或浪费与母体血液供应。缺乏脐也改变正常的血液流动模式,很可能占观察出血和心包水肿。其他几个突变导致失败的绒毛膜尿囊的融合产生相似的表型(Gurtner et al ., 1995;Kwee et al ., 1995;Tremblay et al ., 2001;杨et al ., 1995)。
扩展后的尿囊轴的胚胎绒毛膜结果的过程,从原条包括大量细胞,细胞增殖和空化的远端组织(Bertler起伏,2000年)。胚胎基因突变为Tbx4一个正常的原条,这点可以从正常的表达吗T尿囊也正常,扩散(图2 b,C)。然而,细胞的顶端附近Tbx4突变体尿囊凋亡(图2 d,E)。尿囊细胞存活所需的因素是未知的。然而,有趣的是,Tbx2中表达下调Tbx4突变体尿囊,以前的工作有隐含的要求Tbx2防止细胞周期阻滞在快速增生组织(雅各布斯et al ., 2000)。因此,所扮演的角色Tbx4在尿囊可能的维护Tbx2介导的细胞凋亡的抑制。
同时,与正常发展,尿囊Tbx4突变体胚胎没有空化远端附近的小费。尽管这一缺陷的分子本质是未知的,我们发现,有关T-box基因已经与粘附分子在几个系统的监管。在斑马鱼和非洲爪蟾蜍T-box基因已被证明调节近轴protocadherin (金正日et al ., 1998;山本et al ., 1998),在小鼠中,Tbr1是直接激活reelin细胞外基质糖蛋白。鼠标的突变T产生原条细胞substrate-dependent迁移缺陷(桥本et al ., 1987),和工作Fgfr1突变小鼠显示之间的联系T和钙粘蛋白调节(Ciruna和罗森特,2001年)。这些数据表明,尿囊空化的失败,可能是由于misregulation粘附基因Tbx4突变体。
尽管各种缺陷抑制尿囊增长,多达15%的Tbx4突变体观察到尿囊已经扩展到浆膜圆顶在4 - 5-somite阶段(图1一个;L.A.N.和V.E.P.,未发表)。然而,绒毛膜尿囊的融合很少发生Tbx4突变体。超过250突变体胚胎观察,只有两个建立了尿囊和绒毛膜之间的任何联系。缺乏的表达Vcam1影响这个过程,一个关键的粘附分子(Gurtner et al ., 1995;Kwee et al ., 1995),在Tbx4突变体显然是一个促进因素。然而,Vcam1homozygous-null接受胚胎绒毛膜尿囊的融合在20 - 50%的情况下,这个缺陷本身不足以解释Tbx4表现型。可能缺乏VCAM1的结合蛋白和尿囊的广泛的细胞凋亡在产生协同绒毛膜尿囊的融合的潜在损失。
除了绒毛膜尿囊的融合的失败Tbx4突变体,还有一块在尿囊血管重建。内皮细胞,可以通过为PECAM阳性染色,成功地从尿囊间质区分,但他们仍然谨慎的细胞碎片和无法改造成主要血管。这些块体可能对应于双层囊泡看到组织学检查,也可能干脆烧掉的祖细胞囊泡形态在10.5 dpc的残余尿囊。目前尚不清楚失败的合并成血管内皮细胞Tbx4突变体是细胞自治,或代表一个缺陷信号或尿囊周围细胞的粘附特性。
Bmp4曾被认定为一个重要的尿膜发展的调节器。应在尿膜诱导的胚外胚层,后来尿膜本身的正常发展和绒毛膜尿囊的融合。产生的表型的缺失Bmp4在尿囊分享了很多的相似点Tbx4表现型。都表现出一种缩短,未溶化的尿囊没有明显增殖缺陷,无论是表达VCAM1尿囊的尖端和尿囊的形成血管都有缺陷。之前的研究工作表明,T-box基因可以由BMP信号(Koshiba-Takeuchi et al ., 2000;史密斯et al ., 1991;山田et al ., 2000),观察Bmp4尿囊表达是受损失的影响Tbx4一个上游的角色是一致的吗Bmp4关于Tbx4。然而,缺乏Bmp4也严重扰乱了包括位置和形成,而这个过程是受缺乏影响Tbx4。这可能是因为Tbx4的下游效应Bmp4在尿囊,而其他分子充当了中介Bmp4包括信号。
一个模型Tbx4下肢的功能
多少人知道这些肢体形态发生的初始化(逗和Munsterberg, 2001)。前/后,背腹侧和远/近端轴都是建立在肢芽的形成。Fgf10信号从肢体间质诱发的顶端外胚层的脊(AER)覆盖外胚层。回到爱尔兰,反过来,信号间质Fgf8和Fgf4维护Fgf10在该地区的爱尔兰被称为进步区。Fgf10需要保持进步的扩散区,使肢体产物。这代表一个FGF-mediated积极的反馈循环,为肢体发展是必需的。第二个反馈回路和爱尔兰之间设置一个区域后间质称为极化区活动(ZPA)。肢体ZPA指导后模式,主要表现为分泌信号分子的表达嘘。失败的这两种反馈循环导致的缺席或显著减少肢体增长和模式。
在早期10.5 dpc,Tbx4突变体胚胎形态明显后肢芽类似stage-matched野生型控制。在许多方面,这些后肢芽的起始是正常的。下肢的特异性Tbx4突变体出现改变,暗示的存在Ptx1和Tbx4表达式,以及缺乏Tbx5表达式。罕见的限制表达Msx2和正确的定位Fgf8表达式都表明,背腹侧的模式缺乏的影响Tbx4(Pizette et al ., 2001)。多个基因被认为与肢体结果和/或FGF互惠信号正确激活,包括Msx1和基因编码区dp-ERK的进展,Fgf8在假定爱尔兰扭在整个下肢间质。
然而,消融的Tbx4确实导致一些缺陷前/后下肢的模式。在正常的四肢,dHand限制的后肢芽的作用激活在前肢芽(te Welscher et al ., 2002)。dHand诱发嘘在后肢芽嘘信号是ZPA的活动的关键。Tbx4突变体胚胎死亡之前的表达嘘,但是,在突变体胚胎,dHand从posterior-specific表达转向表达整个突变后肢芽虽然正常的表达激活。相反,Tbx3,这是众所周知的,在老鼠和人类影响下肢发育(Bamshad et al ., 1997;达文波特et al ., 2003),是正确表达的后缘Tbx4突变体下肢。Tbx2,这也是通常表示在后肢芽的后缘,在缺席Tbx4突变的突起物。没有功能已被确认Tbx2在肢体开发中,这主要是因为它表明引人注目Tbx2表达式是熔化的Tbx4突变体在两种组织的两个基因中的突变体胚胎的死亡之前,从而揭示T-box基因的作用在调节另一个T-box基因。
尽管成功的后肢芽的诱导,许多结果和模式的基因在其中,两后肢和产物Fgf10表达式中维护Tbx4突变的突起物。初始FGF信号显然是正常的Tbx4突变的突起物,如可视化的感应Fgf8外胚层和间质中ERK的磷酸化。然而,通过10.5 dpc,Fgf10从远端没有突变后肢芽,只有残余旁边表情可以看到。的缺席Fgf10已经被证明可以切除肢体形成(分钟et al ., 1998;关根身上et al ., 1999),就不足为奇了Tbx4当生长在文化变异突起物无法进步。
类似的角色Tbx4前翼和Tbx5在先前的研究提出了下肢(Gibson-Brown et al ., 1998;洛根和Tabin, 1999年;Ohuchi et al ., 1998;Rodriguez-Esteban et al ., 1999;Ruvinsky Gibson-Brown, 2000;齐藤et al ., 2002;田中et al ., 2002)。这项研究中,最近发表的研究Tbx5前肢(阿加瓦尔et al ., 2003),显示的角色Tbx4和Tbx5微妙的不同。在每种情况下,相关的规范收入尽管缺乏肢体字段Tbx4或Tbx5。然而,的情况Tbx4开始消融,FGF信号但不维护,而Tbx5消融排除了任何的表情Fgf10或Fgf8。
通过标记分析Tbx4突变相似基因操作,扰乱互惠FGF信号从爱尔兰到肢体间质,如突变扭,一个上游的监管机构Fgfr1在肢体间质(O’rourke et al ., 2002;祖尼加et al ., 2002),AER-specific消融Fgf8和Fgf4(太阳et al ., 2002)。所有这些中断展览成功诱导AER-specific fgf,中断的前/后轴标记,但并不是所有的正常感应FGF-independent肢体标记,如Msx1的差别,并迅速对这些Fgf10。特别是,突变扭导致的扩张嘘和Hoxd11前的肢芽,而在缺乏Fgf8和Fgf4前的表达Alx4是扩大后方。前的扩张嘘和Hoxd11尽管发生的正常表达激活前这些四肢,展示中FGF信号的重要性激活前/后轴端依赖维护的肢芽。
我们的数据表明,FGF信号在倒数Tbx4突变后肢间质是成功的ERK的磷酸化FGF-activated MAPK级联。然而,我们观察到的故障的维修Fgf10和一个下肢域的扩张,就是明证dHand表达式,这两个是一致的FGF信号失败。这说明的作用Tbx4在早期肢体发展的信号转导MAPK级联到最终肢体目标(图7),包括前dHand压迫和Fgf10upregulation。除了激活转录辅因子参与dHand压抑是未知的,但它是可能的Tbx4是一个FGF-sensitive,直接抑制因子基因;另外,除抑制的dHand在Tbx4突变突起物FGF信号中断的次要结果。Fgf10可能是一种直接的目标吗Tbx4,因为T-box结合位点已被观察到的Fgf10启动子和Fgf10能够T-box依赖报告基因在体外激活(阿加瓦尔et al ., 2003;Ng et al ., 2002)。似乎因此Tbx4是一个MAPK-sensitive,直接监管机构的dHand和Fgf10。
确认
感谢实验室的成员,特别是Kat Hadjantonakis和有益的讨论,莎拉·戈尔丁g·沙克尔福德,a . Joyner a·麦克马洪慷慨地提供探针和g·马丁,和彼得Mombaerts液氧PGK -neoPGK -胸苷激酶选择磁带的两倍。这项工作是由国家卫生研究院的资助(HD33082) (V.E.P.)和国家科学基金会博士奖学金(L.A.N.)。
脚注
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- 接受2003年3月14日。
- ©2003。