文摘
在这项研究中我们解决克雷布斯循环的功能,以确定哪些酶(s)的可用性限制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)呼吸链在H2O2全身的氧化应激,完整的隔离神经终端。最容易受到抑制的酶H2O2被证明顺乌头酸酶,被完全封锁了50μ米H2O2。α-Ketoglutarate脱氢酶(α-KGDH)也被抑制,但只有在更高的H2O2浓度(≥100μ米),只有部分失活。rotenone-induced增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸()(NAD (P) H)荧光反映NADH可供呼吸链的数量也减少了H2O2,效果施加小的浓度(≤50μ米)的氧化剂完全阻止1,二(2-chloroethyl) 1-nitrosourea (BCNU)、谷胱甘肽还原酶的抑制剂。BCNU-insensitive下降H2O2rotenone-induced NAD (P) H荧光与α-ketoglutarate脱氢酶的抑制。谷氨酸含量的减少引起的神经终端H2O2在抑制顺乌头酸酶浓度。得出结论:(1)顺乌头酸酶是最敏感的酶在克雷布斯循环抑制H2O2(2)在小H2O2浓度(≤50μ米)当顺乌头酸酶灭活,谷氨酸燃料克雷布斯循环和NADH代是一成不变的,(3)在高H2O2浓度(≥100μ米)抑制α-ketoglutarate可用的NADH脱氢酶限制了呼吸链,和(4)增加消费的NADPH贡献H2O2全身的减少数量的减少吡啶核苷酸。这些结果强调的重要性在线粒体功能受损α-KGDH氧化应激,对神经退行性疾病和缺血/再灌注引起的细胞损伤。
有人认出了近年来线粒体发挥关键性的作用,涉及氧化应激条件下,例如,在神经退行性疾病(Olanow 1993;比尔,1996;吉布森et al ., 1998 a,b),会引起(王赛耶,1996;白色和雷诺,1996年)和缺血/再灌注(菲利斯,1994;Siesjo et al ., 1995;张,立顿,1999年)。
呼吸链富含活性氧(成为et al ., 1972;Loschen et al ., 1974;诺尔et al ., 1981;Cino Del大师,1989年;Dykens 1994),但是线粒体氧化应激可能也是一个脆弱的目标(Hyslop et al ., 1988;Zhang et al ., 1990)。理解的机制反应oxigen物种有短期或长期的影响细胞的功能完整性,重要的是识别特定的线粒体目标和描述过程的氧化应激线粒体损伤。
过氧化氢是一种相对温和的诱导氧化应激,因为组件的呼吸链只有轻微的影响(Zhang et al ., 1990),不引起非特异性膜的脂质过氧化反应的氧化剂(添头,Adam-Vizi 1996)。H的相关性2O2建模氧化应激所强调的是,过度生产的H2O2是在大脑老化特征(Sohal et al ., 1994;奥尔巴赫和西格尔,1997年在纹状体)和已经证明再灌注后缺氧侮辱(Hyslop et al ., 1995)。此外,一代的H2O2也被建议为神经损伤在帕金森病(Schapira 1994)。
先前的研究表明线粒体功能受损的早期发展阶段的H2O2全身的氧化压力,因为有一个ATP水平下降和神经终端(ATP / ADP比率添头et al ., 1997)和一个强glutamate-induced线粒体膜电位的损失(ΔΨm)对培养的皮层细胞(斯坎伦和雷诺,1998)。此外,我们发现,H2O2α-ketoglutarate脱氢酶的活性降低(α-KGDH)神经终端和建议ΔΨm减少由于呼吸能力受损,因为不足的NADH克雷布斯循环中生成(Chinopoulos et al ., 1999)。
本工作的目的是为了解决具体克雷布斯循环的功能,并确定酶负责NADH的可用性限制在呼吸链在急性暴露在H2O2介导的氧化应激。研究氧化应激功能的损失原位线粒体在神经终端相关的观察,在某些神经退行性疾病的进展,如阿尔茨海默病、线粒体损伤似乎从神经终端(先驱et al ., 1986;另请参阅布拉斯和吉布森,1991)。在这个准备呼吸链的有限能力的早期阶段H2O2全身休息条件下氧化压力似乎是满意的,但当结合其他侮辱(线粒体阻滞剂,[Na+]我负载),它导致了一个完整的功能崩溃(Chinopoulos et al ., 2000)。
我们在这里展示,顺乌头酸酶是最敏感的酶H2O2克雷布斯循环;然而,抑制由氧化剂α-KGDH限制了可用的NADH呼吸链。在急性暴露神经终端H2O2谷氨酸作为另一种代谢物,因此NADH生产柠檬酸循环。这项研究中,由潜在的重要作用α-KGDH氧化应激下线粒体功能受损,可能与神经退化,减少了这种酶的功能似乎发挥着至关重要的作用(布拉斯和吉布森,1991;美津浓et al ., 1994;吉布森et al ., 1998 a)。
材料和方法
突触体的制备
孤立的神经终端(突触体)准备从大脑皮层的豚鼠详细的其他地方(Chinopoulos et al ., 2000)。突触体悬浮在0.32米蔗糖(∼20毫克/毫升的蛋白质)保存在冰,和整除被用于进一步的操作。孵化项目是我们在标准中包含(m米):140氯化钠,氯化钾,2 MgCl22 CaCl2,10个管道、pH值7.38,10 m米葡萄糖在37°C如下所述。
稳态NAD (P) H量化
整除的突触体孵化标准介质(0.5毫克/毫升的蛋白质)。intrasynaptosomal NAD (P) H水平测量fluorimetrically双发射模式的PTI Deltascan荧光分光光度计使用344 nm激发和发射波长在460和550 nm波长(作为参考)。NAD (P) H浓度的变化是量化使用校准曲线的外部添加NADH (1 - 3 nmol)。
测定柠檬酸循环酶的活动
突触体在标准中孵化(0.5毫克/毫升的蛋白质)H的存在与否2O2,然后整除被转移到不同的媒体酶化验。
柠檬酸合成酶。柠檬酸合成酶和被测量Srere (1969)。整除的突触体(50μg蛋白质)被添加到包含0.1米的媒介米乙酰辅酶a, 0.2米dithionitrobenzoic酸,0.2% Triton x - 100 (v / v), 100米Tris-HCl, pH值8.0。吸光度的变化在412 nm监控GBC UV / VIS 920分光光度计。获得一个稳定的基准信号后,酶反应是始于0.2米草酰乙酸。
顺乌头酸酶。顺乌头酸酶是化验所描述的Hausladen和Fridovich (1996)。Synaptosomal整除(100μg蛋白质)被转移到一个包含50米的媒介米Tris-HCl, 0.6米MnCl2,30米米柠檬酸钠,0.2% Triton x - 100 2 U /毫升异柠檬酸脱氢酶(辅酶ii+端依赖)和过氧化氢酶(1 U /毫升)在37°C, pH值7.4。0.2米的反应是由加法米辅酶ii+。荧光监控在340 nm GBC UV / VIS 920分光光度计。结果计算与E米米NADH = 6.22。
α-Ketoglutarate脱氢酶。α-Ketoglutarate脱氢酶是化验所描述的赖和库珀(1986)。整除(75μg蛋白质)添加到包含0.2米的媒介米硫胺素焦磷酸,2 m米河畔+,1米米MgCl20.4米,米ADP, 10μ米鱼藤酮、0.1% (v / v)特里同x - 100, 50米米磷酸钾缓冲,pH值7.4和0.2米米EGTA。0.12米的反应是由加法米HS-CoA和1米米α-ketoglutarate。二硫苏糖醇是省略了从试验介质,以防止可能的酶的活化氧化物SH组。NADH荧光之后如上所述。
琥珀酸脱氢酶。这是化验所描述的Tan et al。(1993)。Synaptosomal蛋白质(50μg)被转移到一个包含60μ的试验介质米2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1 4-benzo-quinone 50μ米2,6-dichlorophenolindophenol(终端电子受体),2μ米鱼藤酮、5米米KCN 1米米EGTA,特里同x - 100 0.2% (v / v), 250米蔗糖、50米米磷酸钾缓冲,pH值7.6,在37°C。预培养后5分钟,反应是由20米米琥珀酸。吸光度变化记录在600 nm GBC UV / VIS 920分光光度计记录。酶活性与E计算米米2 = 19.1,6-dichlorophenolindophenol。
苹果酸脱氢酶。苹果酸脱氢酶测定所描述的托(1969)。整除(20μg蛋白质)转移到一个包含10μ的媒介米鱼藤酮、0.2% Triton x - 100, 0.15米NADH、100米米磷酸钾缓冲,pH值7.4,在37°C。反应是由0.33米米草酰乙酸。吸光度是监控如上所述。
测定辅酶ii++ NADPH池
一个化验所描述的Nisselbaum和绿色(1969)用于辅酶ii + NAD (P) H测量。突触体(0.5毫克/毫升)preincubated在标准中10分钟,然后H2O2是补充道。样品被视为描述(克林根贝格,1974)。蛋白质样品(50μg)被添加到6-phosphate葡萄糖脱氢酶中含有3.5 U /毫升、0.5米米噻唑基蓝色(MTT), 0.2米吩嗪ethosulfate (PES), 50米米Tris-HCl, 0.5米米EDTA, pH值7.4。吸光度的变化是在570 nm GBC UV / VIS 920双光束分光光度计在37°C。获得一个稳定的基线后,反应是由5米米glucose-6-phosphate。内部和外部校准与已知数量的辅酶ii+被用于量化的结果。
NAD的确定++ NADH池
河畔+突触体+ NADH含量测定(描述Bernofsky和天鹅,1973),使用采样方法(克林根贝格,1974)。样本突触体(20μg蛋白质)被转移到一个分析中含有0.2毫克酒精脱氢酶(σA3263,σ,圣路易斯,密苏里州),0.5米麻省理工,0.2米PES, 0.6米乙醇,50米米Tris-HCl, 0.5米米EDTA、pH值7.8和吸光度后在570海里(30°C) GBC UV / VIS 920分光光度计。内部和外部校准与已知数量的河畔+被用于量化的结果。
谷胱甘肽还原酶活动的分析
谷胱甘肽还原酶测定(他本人和Mannervik, 1985),突触体的整除(0.2毫克的蛋白质)在孵化中含有0.2% Triton x - 100, 0.1米NADPH, 100米potassum磷酸和1米米EGTA, pH值7.4,在37°C。获得一个稳定的基线后,反应是由1米米氧化谷胱甘肽。NADPH吸光度测量如上所述。
测定谷氨酸突触体内容
描述的方法何曼和布拉斯(1981)是适应测量谷氨酸。整除(200μl)突触体孵化在标准中(0.5毫克/毫升)被添加到一个分析中含有谷氨酸脱氢酶(σG7882) 7.5 U /分析,1 m米辅酶ii+,1米米MgCl20.6米,米p -iodonitrotetrazolium紫色,6.5μ米吩嗪methosulfate 2 m米ADP, 0.1% Triton x - 100, 0.2米EGTA, 50米米Tris-HCl缓冲区,pH值7.8。吸光度的变化是在500海里(30°C) GBC UV / VIS 920分光光度计。内部校准与已知的大量的谷氨酸用于量化的结果。
统计数据
统计差异与方差分析评估(Sigmastat)为多个比较。
材料
标准实验室化学物质从σ(圣路易斯,密苏里州)。特殊的过氧化,carbonyl-free Triton x - 100(σ)是在整个实验用于破坏synaptosomal膜没有进一步的氧化损伤。BCNU的礼物是Laszlo小山(布达佩斯医科大学病理学系)。
结果
H的影响2O2在三羧酸循环酶的活性
酶的活性在克雷布斯循环研究的H2O2,尤其集中在酶处理河畔+代数余子式。合成柠檬酸通常被视为“第一”的反应周期的柠檬酸合成酶催化,这被证明是对H2O2(表1)。已报道,相比之下,顺乌头酸酶抑制超氧化物阴离子(以前是敏感帕特尔et al ., 1996;加德纳et al ., 1997)和一氧化氮和peroxynitrate (Andersson et al ., 1998),抑制了H2O2浓度的方式(图1)。顺乌头酸酶的活性显著降低到75.5±4.9%的控制(n= 8,p< 0.05)后5分钟与5μ孵化米H2O2,几乎完全抑制的控制)(13.6±1.27% 25μ米H2O2,完全灭活50μ米H2O2。
异柠檬酸转化为α-ketoglutarate河畔+端依赖异柠檬酸脱氢酶,这在我们之前的研究中并没有被H2O2应用于100或500μ米浓度(Chinopoulos et al ., 1999)。
α-Ketoglutarate脱氢酶是第二个周期产生NADH脱氢酶。作为显示在图2一个的活动α-KGDH抑制了H2O2与氧化剂的浓度成比例。显著减少酶的观察到50和100μ米H2O2孵化后10到5分钟,分别,但500μ米,孵化2.5分钟是足够的酶显著抑制(图。2b)。应该注意的是,与对顺乌头酸酶的影响相比,更高浓度的H2O2酶抑制α-KGDH所需,并不是完全灭活甚至在500μ米H2O2现在10分钟(38.3±5.6%的控制)。
琥珀酸脱氢酶在大鼠肝线粒体被报道是容易受到强烈的ADP / Fe(引起的脂质过氧化的侮辱添头et al ., 1987),但心里亚线粒体粒子H2O2没有检测到影响酶(Zhang et al ., 1990)。表1表明,琥珀酸脱氢酶在突触体敏感H2O2。然而,重要的是要注意,70.8±3.7%的酶活性仍保持在孵化500μ米H2O210分钟,而活动α-KGDH下降到38.2±5.6%的控制在同等条件下(图。2b)。这些结果表明,抑制这种酶的程度小于α-KGDH在相同浓度的氧化剂。
苹果酸脱氢酶,它具有相对较高的活动(见也Yudkoff et al。(1994))是对H2O2介导的氧化应激(表1)。
这些结果表明,三种酶在克雷布斯循环抑制急性暴露神经终端H2O2:(1)顺乌头酸酶,这是最敏感的氧化剂,(2)α-KGDH,唯一的酶被H2O2直接有助于NADH的形成,和(3)琥珀酸脱氢酶,这似乎是一种不太易受攻击的目标2O2α-KGDH。
NAD (P) H荧光的变化引起的H2O2
调查是否H2O2介导的酶抑制克雷布斯循环,特别是α-KGDH,可能会限制NADH可供呼吸链的数量,我们监测荧光变化在344 nm神经终端。因为荧光NADH和NADPH由这种方法测量,本文获得的荧光信号的变化被称为NAD (P) H水平。
我们最近报道,氧化应激引起的100或500μ米H2O2降低基底荧光信号,表明减少稳态NAD (P) H水平(Chinopoulos et al ., 1999)(图。3,插图,跟踪b)。这里的影响H2O2被记录的变化进一步调查NAD (P) H水平由鱼藤酮诱导,抑制剂的复杂我(NADH /泛醌氧化还原酶)在呼吸链中。鱼藤酮(2μ米)诱导荧光突然增加的NAD (P) H(图。3,插图,跟踪一个,ΔNAD (P) H),这个信号是成正比的NADH可供呼吸链。我们发现监测rotenone-induced荧光信号,而不是基荧光,使我们获得更一致的结果和更好的解决oxidant-induced NAD (P) H水平的变化。图3(插图,跟踪b)显示了一个典型实验,暴露在H2O25分钟减少rotenone-induced荧光信号,表明减少NAD (P) H水平。H的影响2O2在100年和500年μ米浓度(无花果。3孵化后)是重要的2.5分钟(72±8.1%和47±4.9%的控制,分别),最大7.5分钟后(46.7±1.5%和31.8±2.3%的控制,分别)。
减少ΔNAD (P) H是氧化剂的浓度成正比(无花果。4,曲线一)。孵化后500μ米H2O25分钟,rotenone-induced NAD (P) H信号下降到34±0.4%,相比之下,控制,但H的效果2O2在15μ米已经显著(83±3.6%)。
H的影响2O2在NAD (P) H水平glucose-free媒介
H2O2据报道抑制gliceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (Hyslop et al ., 1988;Janero et al ., 1993);因此,我们调查是否NADH生产糖酵解的减少可能会导致结果如图3和4。为此,H的效果2O2ΔNAD (P) H研究缺乏葡萄糖,使用实验协议如图3(插图)。在缺乏葡萄糖,糖酵解是无法进行;因此NADH生成主要在克雷布斯循环从替代基质。突触体preincubated 20分钟在glucose-free标准介质在5 m的存在米2-deoxyglucose(防止糖酵解由可能的糖原存储),和rotenone-induced海拔NAD (P) H与不同浓度的荧光研究预处理后H2O2在表5分钟。2结果与glucose-containing中获得的相比,这表明,H的效果2O2rotenone-induced NAD (P) H信号在这些条件下定量相似。2-deoxyglucose没有差别的存在与否结果(数据未显示)。这些发现表明,神经终端能够生成NADH缺乏葡萄糖,这NADH代敏感H2O2全身的氧化应激。
通过H吡啶核苷酸池是不变的2O2
鉴于P388D观察治疗1细胞系(Hyslop et al ., 1988)和心肌细胞(Janero et al ., 1993与H)2O2吡啶核苷酸的丧失引起的,感兴趣的是确定这发生在神经终端为H2O2全身的减少rotenone-induced NAD (P) H荧光。因此,我们测量总河畔+/ NADH和辅酶ii+/ NADPH池没有和100或500μ的存在米H2O2。表3表明,吡啶核苷酸池总额保持不变的H2O2;小减少NAD的观察+/ NADH内容为500μ米H2O2在统计学上并不显著。
抑制谷胱甘肽还原酶在一定程度上阻止了H2O2全身的NAD (P) H下降信号
除了过氧化氢酶,谷胱甘肽过氧化物酶起着重要的作用在大脑中消除的H2O2(Desagher et al ., 1996;Dringen et al ., 1999)。因此增加消费NADPH的谷胱甘肽还原酶的H2O2可能有助于减少rotenone-induced NAD (P) H信号。为了测试这种可能性,BCNU谷胱甘肽还原酶被抑制,carbamoylates硫醇酶组(贝克尔和Schirmer, 1995年),rotenone-induced NAD (P) H荧光的变化引起的H2O2被调查。BCNU 200μ米集中在这些实验,它几乎完全抑制谷胱甘肽还原酶(86.7±1.4%抑制)(无花果。4,插图),而不影响休息NAD (P) H水平或rotenone-induced NAD (P) H信号(数据未显示)。BCNU的浓度更高,控制和rotenone-induced荧光信号也降低(数据未显示),可能反映出其他酶的抑制,尤其是lipoamide脱氢酶(艾哈迈德·弗里希,1985)。在BCNU的存在,小H浓度的影响2O2(5-50μ米)rotenone-induced NAD (P) H信号被废除(无花果。4,曲线b)。H的影响2O2在更高的浓度也降低了预处理后BCNU;然而,减少rotenone-induced NAD (P) H信号仍然显著存在的100μ米(21.2±8.4%)和500μ米H2O2(35.1±4.2%)(图。4,跟踪b)。
这些实验表明,食用NADPH通过谷胱甘肽还原酶/过氧化物酶系统占减少rotenone-induced NAD (P) H浓度信号的小H2O2(< 50μ米),而且还会导致观察到更高浓度的氧化剂。因此,减少NAD (P) H荧光诱导H2O2在100或500μ米浓度,观察到BCNU的存在,可能主要是反映了NADH水平,减少无关的消费引起的NADPH氧化剂的消除。
我们也试图阻止mercaptosuccinate谷胱甘肽过氧化物酶,但谷胱甘肽过氧化物酶的活性是一成不变的孵化后10 m米mercaptosuccinate 60分钟在37°C。这表明即使是最长潜伏期(∼60分钟)容忍突触体没有干扰的完整性没有足够的药物进入内部的神经终端。
抑制α-KGDH之间的相关性和NAD (P) H水平下降引起的H2O2
建立过程中酶(s)可能会限制NADH生产H2O2全身的氧化应激之间的关系,减少rotenone-induced NAD (P) H信号和α-KGDH和顺乌头酸酶的活性进行了分析。只有获得的数据在BCNU(无花果。4,曲线b)被认为是,因为在这些荧光变化归因于NADPH消耗增加谷胱甘肽还原酶不参与。没有考虑抑制琥珀酸脱氢酶,因为在神经终端,柠檬酸循环反应的琥珀酸与草酰乙酸之间的操作以更高的速度比α-KGDH (Yudkoff et al ., 1994);因此不太可能在三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶可能会限制流量条件下,α-KGDH大幅抑制。琥珀酸脱氢酶的活性之间缺乏相关性和通量循环一直在报道大鼠心脏(Cooney et al ., 1981)。顺乌头酸酶也不是一种病原反应的酶,但因为它是非常敏感的H2O2和更高的氧化剂浓度(50 - 500μ米)是完全灭活,我们研究的可能贡献顺乌头酸酶NADH的限制生产柠檬酸循环。图5显示减少rotenone-induced NAD (P) H信号抑制百分比的函数α-KGDH顺乌头酸酶,获得在不同浓度的H2O2(10 - 500μ米)。这个数字表明缺乏顺乌头酸酶活性之间的相关性和NAD (P) H水平;抑制酶的86.5±1.3%的25μ米H2O2没有与任何变更在NAD (P) H信号,而减少NAD (P) H水平被认为在高浓度的H2O2当顺乌头酸酶完全灭活(50 - 500μ米)。相比之下,抑制α-KGDH在50 - 500μ的存在米H2O2似乎与NAD (P) H水平下降,这表明这种酶的抑制可能是一个关键因素在克雷布斯循环限制NADH生产氧化应激引起的100 - 500μ米H2O2。
减少谷氨酸的H2O2
神经终端据报道,在缺乏葡萄糖,克雷布斯循环中的通量部分维护(Yudkoff et al ., 1994;Erecinska et al ., 1996),最有可能造成的供应α-ketoglutarate谷氨酸由天冬氨酸转氨酶(Yudkoff et al ., 1994)。
确定谷氨酸可以作为氧化应激下代谢物,我们测量了谷氨酸突触体中的内容。H的影响2O2和glucose-free条件相似:都导致减少总谷氨酸含量(表4)。H2O2在50和500μ米浓度降低谷氨酸水平,20分钟后,谷氨酸总数的50%内容丢失。较低的H2O2浓度的谷氨酸持平(5μ米)或仅略有下降(10μ米)(表4)。因为谷氨酸测定样本中含有突触体和孵化的媒介执行(见材料与方法),获得的结果反映出净亏损的谷氨酸,谷氨酸的释放神经终端无关。
这些结果表明,在H2O2,谷氨酸神经终端可以作为另一种代谢物当正常流量的克雷布斯循环受阻,因为顺乌头酸酶的失活。在这方面,在葡萄糖供应短缺的影响和H2O2全身的氧化压力似乎是相似的。
讨论
做出正确的估计H2O2NADH的形成,全身的变化是至关重要的建立的荧光变化的程度NAD (P) H代表NADH的水平的变化。在突触体NAD-NADH / NADP-NADPH比∼10:1(表3与整个大脑(数据),在协议Siesjoet。1995不同的大脑区域)和(Klaidman et al ., 1995);因此,它是合理的假设的荧光NADPH贡献不大的总荧光监控在344海里。此外,在目前研究rotenone-induced NAD (P) H增加荧光研究,可能被视为主要的NADH可供呼吸链。虽然这个推理是正确的,但可能应该考虑的一个重要部分NADH可以用于再生NADPH需求增加时由H2O2。这确实是表明谷胱甘肽还原酶的抑制的结果BCNU一定程度上阻止了H2O2全身的下降rotenone-induced NAD (P) H信号(图。4)。因此增加消费NADPH的谷胱甘肽peroxidase-reductase系统消除H2O2似乎流失NADH的一部分存在于神经终端;即。,年代ome NADPH is regenerated at the expense of NADH. We have not addressed the mechanisms by which this could occur, but the conclusion is compatible with findings that mitochondria from rat forebrain contain NADP+端依赖异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和烟酰胺核苷酸transhydrogenase,造成NADPH的再生(沃格尔et al ., 1999)。
BCNU-insensitive减少在NAD (P) H信号引起的H2O2可以作为NADH水平变化的反映与NADPH消费无关的谷胱甘肽还原酶(无花果。4,曲线b)。因为鱼藤酮应用于防止NADH氧化呼吸链,这些变化可以反映NADH形成的主要变化。目前的结果表明,代NADH可能受损的H2O2只有当出现在50μ>米浓度。减少在NAD (P) H荧光在低浓度的氧化剂(10 - 50μ米BCNU)完全避免,这可能归因于增加利用NADPH谷胱甘肽还原酶。
由此产生的问题,我们可能会限制NADH的形成在H2O2全身的氧化应激。导致遗漏的葡萄糖(2-deoxyglucose的存在与否)在中基本上没有影响减少NAD (P) H信号引起的H2O2表明,抑制糖酵解的氧化剂(表并不能促进效应2)。这表明抑制glyceraldehyde-3-phosphate此前报告的脱氢酶(Hyslop et al ., 1988;Janero et al ., 1993)毫无贡献的下降NAD (P) H信号引起的H2O2在神经终端。因为我们还发现,H2O2(50 - 500μ米)诱导在丙酮酸脱氢酶的活性没有改变(数据未显示),形成的NADH克雷布斯循环需要考虑在解释氢的影响2O2rotenone-induced NAD (P) H信号。
我们演示工作,克雷布斯循环三个酶可以抑制H2O2:α-KGDH顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶。克雷布斯循环的总体率被认为是由柠檬酸合成酶的活动,异柠檬酸脱氢酶和α-KGDH (Cooney et al ., 1981;麦科马克et al ., 1990;Moreno-Sanchez et al ., 1990)。然而,Yudkoff et al。(1994)确定在一个精心设计的研究通量克雷布斯循环的两段神经终端α-ketoglutarate与草酰乙酸之间,与草酰乙酸之间α-ketoglutarate-and证实克雷布斯循环并不总是作为一个统一的实体。他们还建议的整体反应速率控制周期包括柠檬酸合成酶或丙酮酸脱氢酶(Yudkoff et al ., 1994)。在我们的研究中,这两种酶被发现受到H2O2。在这个部分的周期(草酰乙酸和α-ketoglutarate之间),只有顺乌头酸酶被H容易受到抑制2O2(无花果。1在50μ),显示一个完整的失活米H2O2或更高版本。
段α-ketoglutarate与草酰乙酸之间,α-KGDH是最慢的酶(14±1.2 nmol·分钟−1·毫克−1在这项研究中),被认为有一个flux-controlling函数(Hansford 1980;Yudkoff et al ., 1994)。我们发现这种酶被抑制H2O2,为此,更高浓度的H2O2需要比抑制顺乌头酸酶;即。,顺乌头酸酶我年代一个米ore vulnerable target for H2O2在比α-KGDH克雷布斯循环。顺乌头酸酶灭活的报道O2−(加德纳和Fridovich, 1992年;加德纳et al ., 1995),抑制顺乌头酸酶被认为是一个敏感的标记细胞内过氧化物的生成在哺乳动物细胞(加德纳et al ., 1995;帕特尔et al ., 1996)。我们发现顺乌头酸酶抑制了H2O2尽管确凿,这种酶是一个敏感的氧化应激的标记(加德纳和Fridovich, 1992年;加德纳et al ., 1995;帕特尔et al ., 1996),表明抑制顺乌头酸酶不允许识别类型的活性氧参与氧化应激。
尽管顺乌头酸酶并不认为是速率控制酶,而不是直接参与NADH一代,当它完全灭活整个周期可能会阻塞。然而,我们发现,rotenone-induced NAD (P) H荧光,即。,NADHlevel available for the respiratory chain, was not significantly changed even when aconitase was inhibited by 100% with 50 μ米H2O2(无花果。5)。在灭活顺乌头酸酶的存在,NAD (P) H荧光下降只有当α-KGDH也抑制(H更高2O2浓度)。它遵循从这个发现在没有完整的顺乌头酸酶,能保持呼吸链的NADH供应;因此一段克雷布斯循环必须功能。
已经观察到,在缺乏葡萄糖段α-ketoglutarate与草酰乙酸之间的变化加快,表明替代基质(s)进入α-ketoglutarate可以操作的这一部分克雷布斯循环(Yudkoff et al ., 1994;Erecinska et al ., 1996)。我们发现在缺乏葡萄糖NAD (P) H荧光持平(表2这个建议是一致的。也有人建议(Yudkoff et al ., 1994),谷氨酸,出席的44 nmol /毫克神经终端(Erecinska et al ., 1988),可以转换为α-ketoglutarate,是最可能的代谢物加油克雷布斯循环在缺乏葡萄糖。我们发现H2O2显著降低谷氨酸的神经终端,类似glucose-free条件,但只有在浓度顺乌头酸酶被抑制在很大程度上(表4)。这表明一个类似的机制可以glucose-free条件下操作和接触H2O2顺乌头酸酶受到抑制。
它可以得出结论,谷氨酸可能转化为α-ketoglutarate下H2O2全身的氧化应激。早期阶段的氧化应激,这种机制会挽救一段克雷布斯循环当顺乌头酸酶已经几乎完全灭活(因此形成α-ketoglutarate柠檬酸是有限的)但α-KGDH仍然是功能。只有当α-KGDH抑制在更高浓度的氧化剂(> 50μ米)是生产NADH妥协(无花果。5)。因为天冬氨酸转氨酶,但不是谷氨酸脱氢酶,具有很高的活动准备(Cheeseman和克拉克,1988年;Yudkoff et al ., 1994),转氨作用可能是谷氨酸转化为α-ketoglutarate的主要机制。可能的途径操作的H2O2概述了在图6。
总之,当前工作的结论如下。(1)顺乌头酸酶是最敏感的酶H2O2克雷布斯循环,但抑制α-KGDH发挥了至关重要的作用限制在H NADH的数量2O2全身的氧化应激。(2)增加转换的NADH NADPH供应减少等价物消除H2O2NADH下降水平做出贡献。(3)早期的H2O2全身的氧化应激,谷氨酸可能用作代谢物维持NADH生产三羧酸循环的一个环节。
本研究强调的重要性α-KGDH涉及氧化应激的条件。最近有报道称peroxinitrate小胶质细胞(公园et al ., 1999)和4-hydroxy-2-nonenal (HNE),脂质过氧化作用的产物,在孤立心脏线粒体抑制α-KGDH和减少NADH生产由添加α-ketoglutarate (汉弗莱斯et al ., 1998)。H2O2是一个相对温和的侮辱,这在早期阶段的氧化应激(< 30分钟)与膜脂质过氧化反应(没有联系添头,Adam-Vizi 1996),因此HNE的形成。
α-KGDH还展出reperfusion-induced年龄相关性失活在线粒体准备接触后大鼠心脏缺血/再灌注(卢卡斯和Szweda, 1999年)。这可能与一个H的效果2O2鉴于,在微量透析可把时程延长H2O2在0.1米米浓度是缺血后再灌注期间形成的纹状体(Hyslop et al ., 1995)。高浓度的氢2O2也可以达到在大脑年龄(Sohal et al ., 1994;奥尔巴赫和西格尔,1997年)。抑制α-KGDH的至关重要的作用2O2显示在这项研究可能在晚发性神经退行性疾病的发病机制中扮演重要角色,如帕金森病(美津浓et al ., 1994)和阿尔茨海默病(布拉斯和吉布森,1991;吉布森et al ., 1998 a),在此期间α-KGDH被发现的活性抑制(审查,请参阅吉布森et al ., 2000)。α-KGDH的敏感神经终端可能尤其建议相关神经终端主站点在阿尔茨海默氏症神经元线粒体损伤(先驱et al ., 1986;布拉斯和吉布森,1991)。
α-KGDH功能有限,线粒体在神经终端可能无法满足能源需求由神经元活动,最终导致功能受损。这是在我们之前发现H表示2O2全身的氧化应激,能源需求增加引起的一个完整的功能性神经崩溃终端(Chinopoulos et al ., 2000)。
脚注
这项工作支持由OR52AGO5 Tudomanyos Kutatasi阿拉普,EGES2SEGUGTI Tudomanyos Tanacs, Oktatasi Miniszterium,和匈牙利人的Tudomanyos Akademia V.A.-V。我们感谢Katalin塔卡克斯Katalin Zolde优秀技术援助。
信件应该向维拉Adam-Vizi教授,医学生物化学部门,Semmelweis医学大学,布达佩斯,h - 1444,邮政信箱262,匈牙利。电子邮件:AV在{}puskin.sote.hu。