文摘
共济失调的角色变异毛细管扩张(ATM), DNA双链断裂识别和响应的蛋白质,在炎症和炎性疾病尚不清楚。我们曾表明,高水平的系统性DNA损伤在野生型小鼠肠道炎症引起的。以确定的影响自动取款机我们缺乏炎症,诱发实验性结肠炎自动取款机−−/,自动取款机+ /−和野生型老鼠通过葡聚糖硫酸酯钠(DSS)管理。自动取款机−−/小鼠疾病活动指数和利率上升的死亡率与杂合的和野生型小鼠相比。系统性的DNA损伤和免疫反应的特点在外周血和经过三个周期的治疗。自动取款机−−/老鼠敏感性增加外周白细胞的DNA链断裂水平,以及在成红血球细胞微核的形成,与杂合的和野生型小鼠相比,尤其是在缓解期和结束后治疗。标记的活性氧和氮species-mediated损伤,包括8-oxoguanine和硝基酪氨酸,出席在远端结肠和外围白细胞,自动取款机−−/老鼠展现比野生型老鼠8-oxoguanine形成。自动取款机−−/老鼠表现出更大的百分比明显高于upregulation炎性细胞因子和CD69激活+和CD44+外周血中T细胞在治疗。ATM,因此,可能是一个重要的免疫调节因子抑制慢性DSS-induced炎症的有害影响,必要的系统性基因组稳定性和体内平衡的肠道上皮屏障。癌症Res;70 (5);1875 - 84
- 自动取款机
- 葡聚糖硫酸酯钠
- 溃疡性结肠炎
- DNA损伤
介绍
长期炎症导致超过20%的人类癌症的发展,由于细胞增殖增加环境支持DNA损伤和肿瘤发生1)。溃疡性结肠炎是一个这样的慢性炎症条件影响数以百万计的人在世界范围内,导致增加结直肠癌的风险。持续时间和严重程度的炎症与癌症发展的累积概率,从2%,10年的结肠炎30年后的18% (2)。特异表达的免疫反应对共生的植物瞬时断裂造成的粘膜屏障被认为是参与溃疡性结肠炎的发病机制(3),尽管确切的机制还有待阐明。
的自动取款机变异基因编码的共济失调毛细管扩张(ATM),一种多向性的激酶参与DNA双链断裂的识别、DNA修复蛋白的激活,信号在细胞周期检查点控制(4,5)。其缺陷导致共济失调毛细血管扩张(t),一种罕见的人类疾病涉及缺陷在t细胞成熟,小脑变性,辐射敏感度,在其他癌症易感性增加淋巴瘤(6)。自动取款机−−/老鼠培育类似缺陷t患者(7- - - - - -9),允许研究t DNA损伤反应机制和致癌作用。值得注意的是,自动取款机−−/老鼠不自发发展结肠炎或结直肠癌;然而,他们显示氧化应激水平升高与野生型小鼠相比。尽管inflammation-derived氧化和nitrative压力导致DNA损伤最近卷入colitis-associated癌症(10,11),自动取款机的角色在化学诱导肠道炎症没有先前的研究。
循环的葡聚糖硫酸酯钠(DSS),一个nongenotoxic硫酸多糖、饮用水临床和形态类似于溃疡性结肠炎和癌症的进展,从而使慢性炎症的独家研究肿瘤促进致癌物的致癌作用,而无需使用(12)。直接破坏上皮屏障和先天免疫反应提出了DSS-induced结肠炎的发病机理(12,13)。调查人员已经观察到氧化DNA碱基在大鼠和小鼠结肠粘膜急性DSS治疗后(14,15),结肠组织的微卫星不稳定性Msh2−−/小鼠慢性DSS治疗(16),防护alkyladenine DNA糖基化酶在大肠肿瘤发生中的作用10),建议修复DNA氧化损伤的重要性的炎症。我们最近发现,肠道炎症引起系统性基因毒性的DNA单、双链断裂和氧化基地DSS-treated野生型小鼠的外周血,以及遗传粘膜炎症模型(17)。探讨系统性ATM在肠道炎症的发病机制中的作用,我们的敏感性特征自动取款机−−/老鼠DSS-induced急性和慢性炎症的系统性基因毒性和免疫反应必然地安装。
材料和方法
动物
成人自动取款机−−/老鼠进入父母的C57BL / 6 jp联合国/ p联合国背景(如前所述)(18)、杂合的老鼠(自动取款机+ /−p联合国/ p联合国)、小鼠和野生型控制(自动取款机+ / +p联合国/ p联合国),12至16周内,被安置在一个特定的无菌设施,美联储一个标准的啮齿动物食物的饮食,和酸化提供饮用水,身子光/暗周期。食物、床上用品和热压处理过的水。实验过程都是按照加州大学洛杉矶分校的动物研究委员会的指导方针。
诱导实验性结肠炎
急性和慢性实验性结肠炎引起管理3% (w / v) DSS (MP生物医学;40000 MW)溶解在无菌酸化饮用水随意三个周期。一个周期的治疗包括7 d处理过的水接着14 d正常的饮用水。水改变了日常和症状包括体重,粪便一致性,和总出血也记录的计算疾病活动指数(DAI),所述其他地方(19)。短暂,得分从0到4被指派为每个测量[减肥(0 - 15%),粪便一致性(正常腹泻),和血液在凳子上(没有血液总出血)和记录这些分数的平均值。老鼠监控31 d结束后治疗。
血液采集
外周血收集通过下颌静脉用5毫米柳叶刀(布伦特里科学)EDTA-coated管(布伦特里科学)。血液收集之前和之后的每一个7 d的DSS三周期和治疗2和4周结束后的三个周期。彗星试验,血液立即被稀释1:1 RPMI / 10% DMSO,立即冻结在−80°C,直到进一步的分析。采集的新鲜血液立即处理所有其他化验。相同的样本用于基因毒性终点以及细胞因子表达或流式细胞术,允许每个动物作为自己的控制。
碱性彗星试验
检测DNA链断裂,以及碱不稳定的网站,进行了碱性彗星试验和分析所描述的其他地方(17,20.)。橄榄尾巴的时刻,代表两个尾巴长度和尾巴,DNA的一部分是用于数据收集和分析,凋亡细胞被排除在先前提出的标准(20.)。
测定氧化DNA损伤
使用酶hOgg1-modified彗星试验并进行了相同(如前所述)(17)。
免疫荧光
外周血中孵化缓冲EL(试剂盒)去除红细胞。样本然后盖玻片上处理沾anti-phospho-histone H2A。413.5 X S139 (P)、鼠标anti-8-oxoguanine克隆,或兔子anti-nitrotyrosine(微孔)如前所述17,21)。至少125细胞数和细胞有超过四个不同焦点γH2AX核被认为是积极的(21)。凋亡细胞,区分由于10倍的存在核疫源地受损细胞的数量(22),不包括在分析中。
石蜡的部分(5μm)冒号自动取款机−−/和野生型控制在10更易与微波/ L柠檬酸缓冲(pH值6)为抗原10分钟检索,封锁,然后孵化anti-8-oxoguanine或anti-nitrotyrosine其次是二级抗体,与上面描述的过程。图像捕获与CytoVision(应用成像)和染色使用ImageJ量化软件(23)。
在活的有机体内微核测定
在外周血红细胞微核形成确定评估染色体不稳定(如前所述)(17)。至少4000成熟红细胞每个动物,被数和频率的微核形成计算血细胞的数量每1000人红细胞normochromatic红细胞。
RNA分离和定量实时PCR
总RNA分离使用QiaAmp RNA血液迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。总RNA (25 ng /μL)用于逆转录使用OligodT(表达载体)和上标三世逆转录酶(表达载体)。互补脱氧核糖核酸(10 ng /μL)使用TaqMan用于定量实时PCR基因表达分析(应用生物系统公司)TATA盒结合蛋白(真沸点),肿瘤坏死factor-α(TNF-α)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) IFN-γ,改变增长factor-β(TGF-β)、白介素(IL) 4, IL - 10、IL - 6, IL-17, IL-23,和IL - 12在7500年ABI棱镜序列检测系统(ABI),根据制造商的指示。真沸点被选为内生控制由于其低变异性和低介质相对丰度表达式的血液(24)。每个测量是一式三份和结果进行了分析使用SDS 2.2.1软件(ABI)。量化的基因表达决心使用相对标准曲线方法规范化真沸点表达式。
流式细胞术
T细胞数量特征为激活状态(CD69和CD44)和CD4使用流式细胞仪或CD8α表达式。红细胞与BD立即细胞溶解PharmLyse裂解缓冲(BD生物科学)。与污点洗后缓冲0.2%牛血清白蛋白(BD),细胞被沾FITC-conjugated仓鼠anti-mouse CD69, FITC-conjugated鼠anti-mouse /人类CD44, R-PE-conjugated老鼠anti-mouse CD4, PerCP鼠anti-mouse CD8α,或适当的负同形像控制(BD生物科学)30分钟在4°C。细胞然后使用BD FACScan清洗和分析。荧光强度归一化到每个各自的同形像控制抗体和数据进行了分析与CellQuest (BD生物科学)。死细胞已排除了闸门向前/一侧散射。标记表达式被记录为积极的绝对计数总T细胞的百分比或平均荧光强度如果人口控制和标记重叠。
统计分析
结果(误差)表示为均值±SEMn= 10小鼠基因型。统计学意义是由非参数单向/双向方差分析邓恩的多重比较测试或成对的学生的t测试与对数转换数据的时间点比较,定义为P< 0.05。线性回归模型的方差分析。基因毒性检测和流式细胞术重复两次。计算是用GraphPad Instat 3.00 R (GraphPad软件)或(25)。
结果
自动取款机−−/DSS治疗的小鼠显示敏感性升高
老鼠每天监测的测量,平均分数考虑减肥,粪便一致性,出现便血,最高得分为4。急性接触DSS 7 d后,自动取款机−−/老鼠有一个温和的戴与野生型和杂合的老鼠相比更高(图1)。症状严重程度的差异更加明显的第二个和第三个周期的末尾(* *,P< 0.01)在慢性炎症。杂合的和野生型老鼠有类似的讲台在整个研究中,表明缺乏基因剂量效应。此外,自动取款机−−/,自动取款机+ /−和野生型老鼠没有DSS治疗讲台(0)在整个研究(数据未显示),没有基线临床症状。两个十自动取款机−−/老鼠死于严重的症状和直肠脱垂,一个第二周期结束时,一个在第三周期的结束。所有其他老鼠存活整个治疗。在缓解期,没有减肥的迹象或持续腹泻,在所有基因型。幸存的老鼠也随访4周结束后第三个周期;然而,没有明显的症状。
高架系统性基因毒性自动取款机−−/老鼠
因为自动取款机−−/老鼠在DNA双链断裂修复有缺陷,更高水平的细胞氧化应激(26),我们假设inflammation-induced DNA损伤会更明显。因此对治疗的敏感性评估基因毒性的外周白细胞,系统性DNA损伤的措施。DNA链断裂以及alkali-labile网站,由橄榄尾巴,增加野生型老鼠在第一周期(P< 0.001;图2一个)。损伤修复第一缓解期间,先后增加了第二个循环,直到2周后的最后周期治疗后修复的损伤之前出现过了。氧化基础伤害,以与hOgg1孵化,并没有显著的野生型老鼠直到第三个周期的治疗。
另一方面,DNA链断裂先后增加了治疗自动取款机−−/老鼠的缓解期。橄榄尾巴时刻明显更高自动取款机−−/老鼠特别是在第二个和第三个周期的治疗与野生型小鼠相比P< 0.001)。氧化基础伤害也更明显自动取款机−−/老鼠和更多结束后第二个周期的治疗和治疗结束后4周过去(P< 0.001)。自动取款机−−/比野生型老鼠老鼠因此招致更多的DNA损伤,尤其是在慢性炎症。
DNA双链断裂仅被证实外周白细胞通过免疫荧光γ-H2AX (图2 b)。组蛋白的磷酸化2 ax或γ-H2AX,发生在双链断裂反应2-Mbp地区侧翼打破网站(22)。ATM和其他ATM-like磷酸化激酶负责。淋巴细胞的双链断裂通常是更普遍比其他单核细胞类型,和第二次循环后达到顶峰,在接下来的缓解期这三个基因型。自动取款机−−/老鼠的水平明显高于有双链断裂在所有三个比野生型老鼠缓解期(P< 0.05),也看到彗星试验。缺乏修复双链断裂再次明显2和4周治疗结束后自动取款机−−/老鼠,可能代表不完全愈合的上皮屏障,长期慢性炎症的影响。杂合的小鼠显示出了相似的γ-H2AX模式形成野生型老鼠在治疗和缓解期。略有增加但无意义的双链断裂的形成,然而,被视为在野生型小鼠2周治疗结束后。
微核形成成红血球细胞是测量外周血血细胞成熟红细胞。毒性炎症明显早在DSS的急性治疗7 d后,和更严重自动取款机−−/老鼠(图3)。微核诱导显著更高自动取款机−−/小鼠血液采集的每一点治疗,4周之后与野生型相比,杂合的老鼠。类似γH2AX疫源地形成杂合的老鼠表现出更高水平的微核形成只在2和4周治疗结束后与野生型小鼠相比,进一步表明ATM在慢性炎症的重要性。增加的敏感性自动取款机−−/小鼠的骨髓染色体畸变可能是由于持续诱导损伤成红血球细胞在骨髓或缺陷清除血细胞发生红细胞。
增加8-oxoguanine外周血和结肠组织中形成
inflammation-derived活性氧和氮物种的存在潜在的病因对观察到的DNA链断裂和微核形成的形式测量8-oxoguanine在DNA和蛋白质硝基酪氨酸的远端结肠周围白细胞和(图4)。8-Oxoguanine引起的DNA损伤反应的氧化活性物种,如羟基自由基、与DNA,造成旅客:C T:在复制期间颠换(27)。从NO-induced硝基酪氨酸形成过氧亚硝基反应与其他活性物种酪氨酸残基的蛋白质(28)。野生型老鼠仅显示显著增加急性7 d后暴露在DSS 8-oxoguanine和硝基酪氨酸形成外周白细胞(P< 0.01)。自动取款机−−/老鼠也会增加8-oxoguanine (P< 0.05)和形成硝基酪氨酸(P7 d的DSS治疗后< 0.05);然而,只有8-oxoguanine形成显著更高自动取款机−−/与野生型小鼠相比,治疗结束时P< 0.05)。8-oxoguanine和硝基酪氨酸也明显在表面上皮细胞近端和绒毛状隐窝最靠近肠道流明和远端结肠炎症细胞(图4情况)。染色8-oxoguanine本地化的原子核在硝基酪氨酸明显受损细胞的细胞核和细胞质。8-oxoguanine染色是更加突出自动取款机−−/小鼠与野生型小鼠相比P< 0.01),而硝基酪氨酸水平相似的基因型(图4我)。
持久的免疫反应自动取款机−−/老鼠
作为显示的严重的系统性基因毒性的可能的解释自动取款机−−/老鼠,采血的免疫反应每一点的特点并与野生型老鼠。虽然先天反应主要驱动器DSS-colitis和可能观察到的基因毒性,我们还推测,适应性免疫反应会调制和在驱动基因毒性中发挥作用。转录水平的Th1、Th17/23和Th2外周血细胞因子,在基因毒性测定,通过定量实时PCR(量化图5)。自动取款机−−/老鼠显示大upregulation TNF-α(Tnf1)和MCP-1 (Ccl2)在第二第三周期治疗后缓解期和(P< 0.05)比野生型小鼠,表明长期激活先天免疫反应。水平的il - 6、il - 12和IL-23也显著调节自动取款机−−/与野生型小鼠相比,在缓解后治疗周期和周期,表明T-cell-mediated促炎反应。有趣的是,IL-17成绩单没有发现在这两种基因型(没有显示)。同样,低水平的IL-17 Th12/23水平上升和Th1细胞因子之前观察到DSS-treated C57BL / 6小鼠(29日)。
尽管IFN-γ水平(Ifng),也是一个指标的t细胞反应,被调制自动取款机−−/老鼠,被认为与野生型小鼠相比无显著差异。Th2反应更加明显自动取款机−−/老鼠在治疗慢性阶段,特点是增加il - 4的表达(Il4), il - 10 (Il10)和TGF -β(Tgfb)。缺陷容忍机制与抗炎细胞因子因此最有可能不增加的敏感性的原因自动取款机−−/小鼠慢性炎症。
外周血中T细胞的数量也以流式细胞术对CD4, CD8α,和CD69,早期活化T细胞的标记包括自然杀伤(NK)细胞(30.),CD44表达在白细胞和参与招聘、激活和效应功能(ref。31日;图6模拟)。自然地,自动取款机−−/老鼠有成熟的CD4计数明显降低+T细胞比野生型和杂合的老鼠,与之前的研究相一致(图6 c;参考文献。32- - - - - -34)。然而,这些T细胞比例明显增大被激活,以应对DSS治疗与野生型小鼠相比,由CD69和CD44阳性染色(如图所示图6 a和B)。杂合的老鼠表现出类似水平的阳性染色与野生型小鼠相比图6 d)。CD4的数量和CD8α-positive T细胞也显著调节整个治疗,极有可能代表站点之间的动态流入和流出细胞的炎症和外周血(数据没有显示)。激活T细胞百分比显著升高特别是在缓解期自动取款机−−/与野生型小鼠相比,直到研究结束时,指示一个持久的免疫反应。
讨论
自动取款机−−/小鼠T细胞数量减少的循环由于T细胞祖细胞的内在缺陷和相应的阳性胸腺细胞发育异常(8,32)。然而,尽管数量低、成熟T患者T细胞已被证明是功能正常,显示安装主管免疫反应的能力(35)。自动取款机−−/老鼠也不发展自发结肠炎或其他胃肠道炎症性疾病(36)。然而,当挑战与DSS,导致中断在肠上皮屏障的完整性,我们显示自动取款机−−/老鼠表现出更大的临床症状的严重程度和死亡率以及DNA损伤外周白细胞和成红血球细胞,和挂载一个更强的免疫反应的特点是炎性细胞因子与野生型小鼠相比,循环活化T细胞。并没有观察到显著的基因剂量效应的疾病活动或百分比激活T细胞,尽管在野生型基因毒性增加一个小老鼠被第三个周期后,指示潜在的杂合性的补偿机制自动取款机。同样的,自动取款机杂合性并不会增加肿瘤易感性γ-irradiation后在小鼠与野生型小鼠相比37),尽管在对乳腺肿瘤发生的易感性增加乳腺癌易感基因1突变背景相比,自动取款机足够的老鼠(38)。
观察到的系统可以认为是炎症介导的DNA损伤因为DSS本身并不直接基因毒性(39,40)。通过氧化活性物种来自炎症细胞破裂可能导致氧化和nitrative破坏局部和全身衡量8-oxoguanine和硝基酪氨酸的形成。本地化这个损坏的绒毛,周围上皮细胞,浸润炎症细胞可能是由于DSS-induced绒毛萎缩和广泛上皮营业额。尽管ATM不明显保护作用的蛋白质损伤,8-oxoguanine水平高自动取款机−−/老鼠,显示缺乏修复氧化DNA损伤除了链断裂。有趣的是,尽管DNA损伤仍然高企,结肠炎的临床症状没有缓解期间和结束后治疗,强调角色的亚临床炎症诱导的DNA损伤和修复的缺乏先前发生的损害。高水平的炎症反应氧化应激,除了固有的缺陷修复合成的DNA损伤,和部分抑制DNA损伤response-dependent细胞凋亡(41,42)可能解释的极端敏感性自动取款机−−/老鼠。DNA损伤的积累在整个治疗期间在缓慢的DNA修复和细胞因此营业额是一个可能的解释增加的DNA损伤水平自动取款机−−/老鼠,考虑淋巴细胞的寿命相对较长。幼稚T细胞的分化成Th1和Th17效应细胞可能导致扩散(43),DNA损伤积累会导致固定的突变。
双链断裂的积累会导致染色体断裂和微核形成(44)。成红血球细胞在骨髓损伤可能是体液的影响DNA损伤,炎症反应与外周白细胞。促炎细胞因子是细胞迁移到网站公布的优先而不是常驻巨噬细胞炎症(3)。激活单核细胞的再循环池可能招募和激活效应细胞,接触到成红血球细胞在骨髓,导致观察到的clastogenicity。
持续激活免疫反应安装自动取款机−−/老鼠表示一个可能的ATM DSS在免疫调节治疗的作用。myeloid-derived细胞的招聘网站的炎症,随着居民树突细胞,允许DSS颗粒的吞噬作用和激活的适应性反应,包括分化幼稚T细胞激活效应细胞(45)。长期的存在更大的激活T细胞的比例自动取款机−−/老鼠,港口总CD4的数量要低得多+T细胞,代表这些老鼠山一个成功的能力但有害的免疫反应,尽管这一缺陷。信使炎性细胞因子水平的增加,特别是在缓解期本身就是证据的系统性分布,也对应水平的提高外周血激活T细胞和基因毒性。这种持续激活的T细胞和细胞因子可能导致upregulation增加巨噬细胞的活性和氧化破裂,这可能是一个潜在的解释观察到的直接基因毒性外周白细胞。进一步的机制可能会被政府调查酶抑制剂或抗增殖剂。
最近的证据指出,DNA损伤反应涉及ATM的作用在调节免疫反应。不会侮辱和激活的ATM / ATR通路被证明移植NKG2D配体的受体在小鼠和人类,所有NK细胞,CD8γδ-T细胞,激活+T细胞(46)。这是联系基因毒性应激和免疫激活。因此,不仅可以通过氧化免疫反应有可能引起DNA损伤破裂,但DNA损伤本身可以进一步激活nk细胞,可能造成进一步的破坏,如果不妥善修复自动取款机−−/老鼠。核ATM也已被证明能够直接绑定NF-κB基本调制器(NEMO),导致细胞质NF-κB易位和激活,导致炎症和prosurvival响应基因的转录,特别是在可以忍受的DNA损伤反应(47)。这些不同的激活模式意味着一个耦合的应激反应和细胞生存。
ATM在这些方面的缺乏可能导致异常信号的响应基因毒性压力设定的慢性炎症。ATM的转录镇压最近发现有选择地在幼稚T细胞的风湿性关节炎患者,其中有增加DNA损伤被认为是独立于炎症、指示的替代模式增加了DNA损伤细胞缺乏ATM (48)。除了ATM不足,缺乏FEN1,多功能酶,导致不完整的消化凋亡细胞的DNA和结果在慢性炎症和自身免疫(49)。同样,从慢性炎症水平的提高DNA损伤结果,由于双链断裂的一个固有的缺陷修复自动取款机−−/老鼠,会进一步促进炎症和造成进一步的DNA损伤在一个积极的反馈回路。自动取款机可能因此发挥保护作用不仅作为DNA损伤传感器也作为immunoregulator。增加灵敏度DSS治疗不仅是目前作为结肠局部炎症的临床症状也主要体现为系统性侮辱具有基因毒性和激活免疫反应。
总之,自动取款机−−/老鼠对DSS-induced更敏感比杂合的或野生型小鼠急性和慢性炎症,尤其是在缓解,最后一轮治疗4周后,显示缺乏发生损伤的修复。灵敏度高的特点是发病率的增加死亡率,临床症状,系统性的基因毒性外周白细胞和成红血球细胞,激活免疫反应包括增加外周血中炎症细胞因子的成绩单。系统性基因毒性副产品的炎症引起的压力可能会进一步促进炎症反应和prosurvival机制通过ATM的错综复杂的参与。缺乏这种蛋白质引起的DNA损伤和遗传不稳定,以及一个更强的免疫反应,可能由于其他途径提醒,进一步激活免疫反应或解决由于缺陷激活效应细胞。ATM因此可以推断在免疫调节中发挥作用和遗传稳定性的维护在炎症和被认为是一个潜在的目标不仅在治疗慢性炎性疾病,也在癌症治疗和预防。
披露潜在的利益冲突
没有披露潜在的利益冲突。
确认
给予支持:国家卫生研究院的基金ES09519(右Schiestl)和CA016042 (Jonsson综合癌症中心),Jonsson综合癌症中心基金会(右Schiestl),和一个加州大学洛杉矶国家环境健康科学研究所的培训给予分子毒理学韦斯特布鲁克(点)。
这篇文章的出版成本支付部分费用的支付页面。这篇文章必须在此标记广告按照18事项部分1734只表明这个事实。
- 收到了2009年7月13日。
- 修订了2009年12月16日。
- 接受2009年12月17日。
- 第一次出版2010年2月23日。
- ©2010美国癌症研究协会。