基因表达分析显示,基质蛋白在小鼠和人肺纤维化中是一个关键的调节因子
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Matthew P. Scott,斯坦福大学医学院,加州斯坦福(2001年10月11日收到审查)
摘要
肺纤维化是一种进步和很大程度上无法治疗的疾病组,这些疾病影响到美国任何一天的10万人。为了阐明导致终级人肺纤维化的分子机制,我们通过使用寡核苷酸微阵列分析了来自组织学证实肺纤维化(通常间质肺炎)的患者的样品。基因表达模式清楚地区的纤维化肺部正常。在纤维化肺部编码蛋白质中显着增加的许多基因,与细胞外基质形成和降解和在平滑肌中表达的蛋白质。使用组合集评分系统,我们确定了矩形素(基质金属蛋白酶7),一种先前未与肺纤维化相关的金属蛋白酶,是我们数据集中最具信息丰富的基因。免疫组织化学在纤维化肺中表现出母体蛋白蛋白的表达增加。此外,尤利柳蛋白敲除小鼠响应腹腔内的Bleomcin而显着保护肺纤维化。我们的结果鉴定母体作为肺纤维化和潜在治疗靶标的介质。他们还说明了人体组织样品的全局基因表达分析的力量,以鉴定临床疾病所涉及的分子途径。
导致终末期肺纤维化的分子机制很差。虽然包括肉芽肿,环境粉尘和毒素,自身免疫疾病和药物的暴露,但具有肺纤维化的众多病症,但在许多情况下,致病剂仍然未知。最致命和难治性的肺纤维化形式是特发性肺纤维化(IPF)。IPF通过通常间质肺炎(UIP)的结果来组织学,其特征在于与与最小炎症相关的活性成纤维细胞增殖的斑块焦点的插入,高级瘢痕和纤维化(蜂窝状)和正常出现的肺(1那2).IPF / UIP的病因仍然难以捉摸,无论治疗如何,诊断的平均存活率仅为3年(3.).
我们对肺纤维化机制的大部分理解来自小鼠肺霉素诱导的肺纤维化的研究。常见的范例假设初始肺泡损伤,致炎症反应,随后,纤维化(4.).目前治疗UIP的主要方法是抑制炎症。然而,这种方法对大多数患者无效(3.).最近,证据已经出现了UIP可能是紊乱的成纤维细胞调节的结果。在这种范式下,纤维化的病理过程是通过成纤维细胞和平滑肌细胞的肺插形持续重塑的结果,而不是持续炎症的结果(5.).
微阵列技术的出现允许同时监测数千个基因的转录行为。这项技术在分析各种细胞系统对刺激的反应、对人类癌症的分类以及对人类疾病的动物模型的分析中已多次被证明是有用的(6.-8.).为了表征UIP的转录谱,我们通过使用寡核苷酸微阵列从UIP患者分析了肺组织中的基因表达模式,并将它们与正常肺组织中的基因表达模式进行了比较。我们的结果表明,UIP患者的肺部基因表达模式明显区别。除了预期的细胞外基质蛋白质外,我们发现编码金属蛋白酶的基因的协调诱导。其中一个,Matriolysin [基质金属蛋白酶(MMP)7]是纤维化和正常肺之间最鲜明的基因。为了分析母蛋白在肺纤维化中的作用,我们将玻璃霉素注入母体蛋白敲除小鼠的气相中,发现麦芽素敲除小鼠免受博来霉素诱导的肺纤维化。我们的数据表明,Matriolysin是小鼠和人类肺纤维化的关键调节因子。因此,阻断矩形活性可以作为这种破坏性疾病的新治疗介入。
方法
肺标本。
对于微阵列分析来自肺纤维化患者的肺标本由移除肺移植(患者4和5)或通过诊断胸腔镜检查(6-8患者)。只有其中一个患者在活组织检查时间(患者8,泼尼松15mg /天)治疗皮质类固醇。从去除用于肺癌(1-3款)的肺的正常部位获得控制样品。另外的控制是从Clontech(样品0)中获得的五个肺的总RNA的购买池。患有肺纤维化的患者(吸烟者,三个非吸烟者)显示出限制性的生理学,随着扩散能力,地面玻璃衰减和蜂窝线上的高分辨率CT扫描,以及肺组织学的典型UIP模式。两种患有自身免疫性疾病(患者7:类风湿性关节炎;患者8:Sjogren的综合症)。另外三名患者被诊断为具有IPF / UIP。实验议定书经机构内部审查委员会批准。所有用于基因表达分析的手术标本都在液氮中冷冻。
免疫组化方面,我们从其他7名IPF/UIP患者(5名男性和2名女性;5名非吸烟者,2名戒烟者),59±6岁,肺活检。所有患者均未接受过皮质类固醇或免疫抑制药物治疗。IPF的诊断是基于临床、放射学和功能表现,并由UIP的特征性形态学证实。对照组肺组织样本来自于非肺相关原因死亡患者的尸检(2男1女,平均年龄48±11岁)。
标记CRNA的制备。
探针制备按照微阵列制造商(9.). 简单地说,总RNA是通过在冰冷的Trizol中对肺标本进行均质化来分离的。分离两次纯化的poly(A)mRNA(Oligotex,Qiagen,Chatsworth,CA),并将其用作模板,以寡核苷酸(dT)合成双链cDNA24含有添加到3'末端(Genset,La Jolla,Ca)的T7 RNA聚合酶启动子位点的引物。用苯酚/氯仿,乙醇沉淀萃取cDNA,用作模板体外转录(AMAMION T7 Megascript系统)具有生物素标记的核苷酸(Enzo诊断)。标记的CRNA是碎片化的,并根据推荐产生杂交混合物(9.).
微阵列的杂交。
每个样品的等分试样(200μl杂交混合物中的10μgrCA)与GeneChip Hugene FL阵列杂交。在杂交之后,用链霉抗生物素蛋白植物(分子探针)染色,用链霉素染色,用生物素杂交,用链霉蛋白植物植物(分子探针),并扫描(Hewlett-Packard,GeneArrett-Packard,GeneArray扫描仪G2500A)杂交。
分析Genechip.数据。
对扫描的输出文件进行目视检查,以确定是否存在杂化伪影。使用基因芯片3.3软件(加利福尼亚州圣克拉拉市Affymetrix)分析缺乏明显伪影的阵列。阵列的平均强度为每个基因150个,并进行独立分析。通过计算用于该基因的探针对的平均差异(完全匹配强度减去不匹配强度),确定每个基因的表达值。然后将GENECHIP 3.3软件创建的表达分析文件传输到与互联网基因组数据库(如国家心脏、肺和血液研究所、瑞士Prot和基因卡)链接的数据库(Microsoft Access),以更新基因定义。所有小于20的测量值都被指定为20。对于聚类分析,我们使用簇和树视图Michael Eisen描述的程序等。(10).我们不包括在分析基因中,不具有至少一个平均差异强度值≥100或通过Affymetrix标准的呼叫。针对每个样品对控制中值计算的每个样品计算折叠比率。平均折比例是UIP样品的折叠比的平均值。
分离研究。
确定我们使用前面描述的Ben-Dor描述的评分方法的最具信息性基因等等。(11)并应用于乳腺癌和黑色素瘤的cDNA阵列分析(12).详情请参阅参考资料。13. 简言之,根据基因的组织表达水平预测组织样本独立分类为“有病”或“无病”的程度,基因被指定为信息基因(11).本研究使用的评分如下:
阈值错误分类(TNOM)。
TNoM是根据特定基因的表达水平,使用最佳简单阈值区分两个类别(患病或未患病)时发生的分类错误数。
信息。
Info是对样本分类(患病或未患病)的不确定性的估计,该不确定性是基于单个基因的表达而进行的预测(Info得分越低表示对给定基因的预测值越高)。
高斯。
高斯分布是两类基因表达水平分布之间的重叠。分数是基于正态性假设的。
免疫组化。
免疫组织化学如上所述进行(14).简而言之,在脱碱化和再水化组织部分后封闭3%H后2O.2然后在柠檬酸缓冲液(10 mM pH 6.0)中提取抗原。肺切片与正常血清孵育30分钟,然后在4℃下用单克隆抗体抗mmp -1 (20 mg/ml)、抗mmp -9 (5 mg/ml) (Fuji)或抗mmp -7 (20 mg/ml) (Chemicon)孵育过夜。根据制造商的说法,先使用生物素化的二次抗ig,然后使用辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素(BioGenex Laboratories, San Ramon, CA)。以含有0.05% H2O2的醋酸缓冲液中的3-氨基-9-乙基咔唑(BioGenex Laboratories)为底物。切片用苏木精反染色。用非免疫血清代替一抗作阴性对照片。
博来霉素治疗。
年龄和性别匹配,8至16周龄129 / svMMP.-7+ / +(杰克逊实验室)和MMP.-7- / -小鼠(L. M. Mastisian,Vanderbilt大学医学院,纳什维尔)的礼物,14至23周的C57BL / 6MMP.-7+ / +(查尔斯河育种实验室)和MMP.-7- / -(L.M. matrisian)小鼠保持在无理体的无菌环境中。通过甲氧基氟醚麻醉小鼠,通过口腔将24·尺寸针插入气管中。将50微升的博来霉素(0.9%盐水,σ)或盐水中的0.05-0.08单位。在Bleomcin或盐水注射后14或21天杀死小鼠,收集肺部脯氨酸测定或组织学。
羟脯氨酸测定。
为了估算肺中胶原蛋白的总量,如上所述测量羟脯氨酸(15).简而言之,除去两种肺,并在110℃下将酸水解在5ml 6M HCl中。通过离心除去沉淀物。将上清液干燥过夜并在室温下溶于100μl蒸馏水中。每一份测试每个样品。乙酸柠檬酸盐缓冲液(pH6.0),50μl高氯酸和50μl·埃尔希希试剂中的50微升氯胺T(Sigma),如上所述(15).在570 nm处测定吸光度,计算羟脯氨酸的含量。
组织学和形态学。
小鼠肺经10%福尔马林灌注后浸泡固定,常规组织学方法经石蜡切片制成苏木精/伊红染色切片,光镜观察。每只小鼠的每个肺叶的单个纵向切片被检查。对肺纤维化、肺泡巨噬细胞增多、肺泡内除巨噬细胞外存在白细胞以及间质白细胞浸润进行评分。每个参数都被标记为基本正常或给予从1(最低严重程度)到5(最严重程度)的严重程度评分。1分表示一个门槛水平。2分表示轻微的变化,不涉及大量的组织。3分表明,该效应在多个位点都很容易识别,并且/或在一个到几个位点的更大的焦点中都存在。4分表明一个相对严重的变化在多个脑叶中广泛存在,或者完全占据了一个脑叶。5分表示变化严重,涉及所有脑叶。
结果
基因表达模式在纤维化和非纤维化肺中是不同的。
纤维化和正常组织学肺之间清楚地区的全局基因表达模式(图。1一种).此外,当呈现接受最显着得分(TNOM = 0)的基因时,基因表达模式的差异甚至更清楚(图。1B.).当我们将分层聚类应用于样本(未显示的数据)时,这种区别也很明显。
微阵列数据分析的一个已知问题是,与大量测量参数相比,样本数量少,这种情况可能导致虚假的统计关联。为了解决这个问题,我们对TNoM进行了严格的统计基准测试。当组织的分类被均匀地随机绘制时,我们计算了每个评分(TNoM 0,1,2,等等)的预期基因数(7,129)。在这种情况下,我们预计111个基因得分最高(TNoM = 0),但实际上我们观察到了164个信息含量高的基因。如此多的高信息量基因具有P.值< 10-6当基因被独立地绘制时,并且它们的TNOM相对于随机分区计算。在进行计算中,我们将五个正常肺部的池作为单个样本处理,因此这里呈现的数字甚至可能低估了本研究的信息内容。我们的网站上提供完整的数据集(http://FGUSheba.cs.huji.ac.il/).
纤维化肺部的平滑肌标记增加。
UIP发展过程中发生的最有趣的现象之一是形成活跃增殖的肌成纤维细胞和成纤维细胞的小聚集体,称为肌成纤维细胞/成纤维细胞灶(5.).此外,在UIP肺中发现了平滑肌细胞异常聚集(16).有趣的是,我们观察了编码肌蛋白的基因表达的显着增加。这些包括平滑肌分化的标志物,如血管α平滑肌肌动蛋白,γ平滑肌肌动蛋白,钙隆和整合蛋白α7β1。还增加了编码用于与细胞收缩和肌动蛋白丝组织相关的蛋白质的基因,例如肌素,SM22,Trobomyosin和S100A9蛋白也增加。完整列表在表中提供1。
编码免疫球蛋白,补体和一些趋化因子的基因在纤维化肺部上调。
令人惊讶的是,肺纤维化患者的基因表达模式并未表明急性炎症活性增加。我们没有观察到IL-1或肿瘤坏死因子α相关途径的任何激活,也没有观察到凋亡相关基因的任何增加。然而,我们确实观察了编码免疫球蛋白的基因的增加,可能反映慢性B细胞浸润,以及一些补充因子的增加。增加了编码趋化因子MCP 4,GO 1和Eotaxin的基因(表1).
在纤维化的肺中,编码参与细胞外基质形成、降解和信号转导的蛋白质的基因增加。
正如预期的那样,在纤维化肺中编码I和III胶原的基因表达增加,编码VI胶原、腱蛋白C、骨桥蛋白和纤维连接蛋白的基因表达也增加(见表)1).几种用于编码参与细胞外基质形成的蛋白质如Bigh3,丝素和Fibrillin的其他基因,与细胞外基质相关信号传导相关的基因,例如细胞粘附激酶β和胶原受体酪氨酸激酶DDR(表1).另一个有趣的子集是编码蛋白酶的基因。MMP-1,MMP-2,MMP-7,MMP-9的表达水平(表1)和组织蛋白酶E在纤维化肺部相对较大。MMP-7(Matililysin)是基因被评分为最具信息性(TNOM = 0,INFO = 0,Gaussian = 0.00625,完整数据集,http://FGUSheba.cs.huji.ac.il/)在上调的基因中(图。2一种).
免疫组化证实MMP-7表达增加。
为了验证蛋白质表达水平并鉴定MMP-7的细胞来源的基因表达数据,我们对UIP患者的肺组织进行免疫组化。免疫反应性MMP-7在上皮内大量定位,包括肺泡和支气管上皮细胞(图。2B.和C图4一种-C,它被公布为PNA网站上的支持信息,www.pnas.org.). 如增厚的肺泡间隔和细胞外基质染色所示,MMP-7也在细胞外空间检测到(图。2B.).MMP-7在正常的肺部薄壁组织中最小地检测到(图。2D.).我们还染成MMP-1和MMP-9。MMP-1主要存在于过增殖型2肺细胞和支气管细胞衬里蜂窝囊肿,以及反应性肺泡上皮细胞(图5一种和B.,它被公布为在PNA网站上的支持信息)。肺泡巨噬细胞在纤维化肺病患者的组织切片中也强烈地染色了MMP-1(图。1一种和5一种).中性粒细胞中检测到MMP-9,包括血管内和间质(图6)一种,它被公布为在PNA网站上的支持信息)。MMP-9还在细胞外基质中和一些致密疤痕的区域定位(图6B.).对照肺显示MMP-1散在染色(图5)C)和中性粒细胞中的最小MMP-9染色(图6D.).与非免疫血清孵育的对照样品如图4所示为阴性。4D.。
博莱霉素治疗后,基质蛋白敲除小鼠不会发生肺纤维化。
为了确定MMP-7实际上是否参与纤维化过程,我们将博尔霉素施用到肺部MMP-7.- / -小鼠,以及来自两个不同背景的年龄和性别匹配的野生型控制:129SV和C57BL / 6。在腹腔内脑膜炎霉素两至3周后,野生型129SV小鼠中羟脯氨酸水平增加了96-119%,与55-59%的矩形敲除小鼠相比,在三个单独的实验中,使用5-9小鼠/组(图。3.一种).差异有统计学意义P.所有三个实验中的0.0002至0.02的值。该发现不依赖于小鼠的遗传背景,因为在三个单独的实验中获得了与C57BL / 6背景的小鼠的比较结果(图。3.一种).这些结果得到了组织学评估的支持,所述组织学评估显示矩形蛋白敲除小鼠肺部肺部变化(图。3.D.).在博莱霉素攻击中,评估的所有组织病理学参数的平均严重程度显着较低MMP-7.- / -与相应的野生型对照相比(图)。3.B.).
讨论
该研究的结果支持UIP作为持续基质沉积和破坏的疾病,与相对适度的,慢性炎症相关。有趣的是,尽管是“蜂窝状”肺作为不可逆转的疤痕和静态组织的普遍看法,我们的基因表达数据显示了一种组织,其与涉及基质沉积的两种基质降解蛋白质和蛋白质的高水平基因表达是非常积极的重塑。
我们的结果中最令人印象深刻的特征是基因表达模式的明确区别,因此与非纤维化肺相比,UIP肺的基本组织生物学。通常关注的疾病微阵列分析,其中组织可用性是挑战,是获取生物学上有意义和统计学意义的数据的难度。由于样品数量与测量的参数的数量与测量的参数数量之间的令人不慢的不对称,使用传统统计数据在微阵列实验中的使用是复杂的,这可能导致杂散的统计关联。我们在此用于我们使用的分析方法的优点是他们对严格的统计基准测试(11).我们可以在随机分类中计算预期的每个评分的信息基因数,然后将该估计数量的高分(或信息性)基因与在我们的数据集中测量的实际信息基因(每种分数)进行比较(13).在我们的研究中,尽管样本量小且患者的遗传异质性,但我们观察到信息基因过多,这表明我们观察到的两组基因表达差异具有生物学意义。事实上,当我们应用其他统计工具(T.test, Wilcoxon)、聚类方法和自组织映射(未显示数据)。我们的分析结果是一个例子,通过使用专门为微阵列实验设计的计算工具,克服了小样本量的一些限制。
在我们的数据集中对信息基因的密切检查揭示了纤维化肺疾病的几个重要方面。一个令人印象深刻的特征是mmp的协调上调,主要是MMP-1和MMP-7那在UIP患者的肺部。已经提出,纤维化的组织表型(主要是夸张的细胞外基质沉积)产生的胃细胞间基质蛋白的合成和降解的缺陷和降解 - 一种涉及MMP家族的几个成员的方法。因此,先前已经报道了MMP-1(降解纤维胶原胶原胶原蛋白-1)以及MMP-2和MMP-9(明胶酶A和B的Gelatinase A和B),已经据报道在人肺纤维化和肺纤维化动物模型中进行上调(17-19).在我们的数据集中,UIP肺部的MMP-1,MMP-2和MMP-9显着高。在MMP-1和MMP-9的蛋白质表达水平上验证这些观察结果(图5和6)。我们没有观察UIP肺中金属蛋白酶组织抑制剂基因表达水平的任何显着增加。令人惊讶的是,我们检测到TIMP3基因表达的减少(完整的数据集表,http://FGUSheba.cs.huji.ac.il/),在其他微阵列实验中看到的观察(A.P.,未发表的观察)。
MMP-7是一种先前与肺纤维化无关的金属蛋白酶,是UIP肺中增加的基因中信息量最大的基因。这一观察结果通过一组UIP患者肺组织的免疫组织化学染色得到证实。高强度染色证实上皮细胞MMP-7蛋白表达增加,以及与细胞外基质结合的MMP-7增加。保护MMP-7.- / -来自博莱霉素诱导的纤维化的敲除表明,这种金属蛋白酶在肺纤维化的发展中起着重要作用。MMP-7在与环境接触的上皮组织中表达。虽然它不是由生活在无菌环境中的小鼠表达(20),其表达迅速通过感染和空气污染诱导(21那22).MMP-7需要激活小肠中的Defensins和MMP-7.- / -老鼠不能杀死肠道病原体(23).最近,MMP-7已被证明在两种途径中发挥作用,该途径被认为是在博来霉素诱导的肺纤维化,肿瘤坏死因子α和FAS途径(24那25).与MMP-1一样,MMP-7主要由肺泡上皮细胞表达,两者都可能在细胞迁移中发挥作用,正如在皮肤伤口愈合中的角质形成细胞所提出的(26那27).类似地,MMP-1和MMP-7可以在UIP肺改造期间参与不同矩阵的肺泡和支气管肌细胞迁移(28).此外,MMP-7可以增强肺泡空间中的促凝血微环境,因为它能够快速切割组织因子途径抑制剂,组织因子诱导的凝血剂(29). 在纤维化肺疾病(包括特发性肺纤维化)中发现局部促凝活性增加,肺泡上皮细胞似乎有助于该疾病中促凝活性和抗纤溶活性的增加(5.那30).基于我们的数据和其已知的功能,基质蛋白酶是一个很好的候选人,在持续的组织损伤和纤维化中发挥关键作用。一方面,它是由上皮损伤引起的,上皮损伤是导致肺纤维化的常见病理过程那另一方面,它可能是细胞死亡,慢性炎症和促凝血活性的活化剂。在我们的作品中的重点是MMP-7是大规模基因表达实验的一个很好的例子,作为发电机的假设产生工具。基于以前的知识,我们没有理由怀疑MMP-7在肺纤维化中发挥了作用。然而,无论使用什么类型的分析,MMP-7是UIP样品中诱导的最重要的基因,从而苛刻的分析。
在明显上调的基因中,我们没有发现很多与炎症相关的基因。我们观察到慢性炎症浸润的证据,可能与B细胞浸润(免疫球蛋白等)有关,但我们没有观察到任何证据表明T细胞活化或凋亡通路的任何显著激活。虽然在肺纤维化动物模型中,纤维化反应可能依赖于完整的肿瘤坏死因子α或Fas信号通路(31-35),这些通路的激活在本研究中不明显。
在我们的研究中使用全肺匀浆的一个局限性是,我们相对不能准确评估在UIP肺中过高表达基因的细胞。对于一些典型的细胞标记,甚至很难猜测这些变化是由于细胞含量的变化还是真实的基因表达模式。例如,我们观察到三种细胞角蛋白(5.那8.那15).这一发现可能代表上皮基因表达的变化,上皮细胞亚群的变化(上皮迁移),或其他细胞类型的表型变化。到目前为止,这样的分析是繁琐的,但创建数据库,将包含特定细胞类型的基因表达签名和分析方法,以计算出它们可以改善这一困难。尽管有这样的限制,在UIP肺中显著增加的令人印象深刻的基因簇之一是肌肉相关基因。UIP组织学描述的一个重要特征是纤维母细胞灶的存在(5.).成纤维细胞体积可能代表成纤维细胞迁移,增殖和维持肺的异常结构的微观区域。在这些焦点中的成纤维细胞的主要亚群表达平滑肌分化的标记,例如α-平滑肌肌动蛋白(16那17).此外,UIP肺内通常可见平滑肌细胞簇,可能导致肺顺应性降低(16).我们观察到肌肉相关基因的增加,范围为2.5至25倍(表1).这些协调在平滑肌标记物中和细胞收缩机制中增加,反映了我们在肺中相对小的细胞群中检测到显着表型变化的能力。
在本研究中,我们使用寡核苷酸微阵列分析UIP中的基因表达模式。我们区分了将UIP与非纤维化肺区分开来的特定基因亚群。这些基因包括编码与B细胞和慢性炎症相关蛋白的基因、肌肉相关基因以及编码与细胞外基质产生、降解和信号传导相关蛋白的基因。使用先进的计算评分方法,我们确定MMP-7,一种先前与肺纤维化无关的多功能MMP,是我们数据集中信息量最大的增加基因。MMP-7确实参与肺纤维化发病机制的假说得到了我们观察到的MMP-7基因敲除小鼠免受博莱霉素诱导的纤维化的支持。我们的结果支持UIP是一种慢性破坏性过程的观点,其中肌成纤维细胞和具有平滑肌样表型的细胞的增加、活跃的异常上皮化和异常修复交织在一起。
致谢
我们感谢Gady Cojocaro和Hal van Wart博士的支持,感谢Tom Raffin博士和Susan Jacob女士从斯坦福大学斯坦福医学中心提供的新鲜人类肺组织样本。Isasshar Ben-Dov博士对手稿提供了有帮助的评论。N.K.以色列肺脏协会(israel Lung Association)特拉维夫分会的慷慨资助在一定程度上支持了该研究。
脚注
缩写
- IPF那
- 特发性肺纤维化;
- UIP那
- 通常的间质性肺炎;
- MMP.那
- 基质金属蛋白酶;
- TNOM.那
- 阈值错误分类数量
- 已收到2001年10月11日。
- 公认2002年3月7日。
- 版权所有©2002,国家科学院
参考文献
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- Affymetrix.
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- 班珠一种那
- 弗里德曼N那
- yakhiniZ.
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- 塞尔曼m那
- 鲁伊斯V.那
- CABRERAS.那
- Segura.L.那
- 拉姆里斯R.那
- 巴里奥斯R.那
- 帕尔多一种
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- 苏W Y那
- JaskotR H那
- 理查兹j那
- 艾布拉姆森S R那
- Woessner.j f.j那
- 余W H那
- 德雷尔K L.
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- ↵
- 公园W C那
- Mecham.r p.
- 公园W C那
- SudbeckB D那
- Doyle.G R.那
- Saariahlo-kereU K
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