摘要gydF4y2Ba
p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在炎症细胞因子表达中的确切作用尚不清楚;它可以通过转录、转录后、翻译或翻译后进行调控。其中一种或多种机制的作用取决于特定的细胞因子、所研究的细胞类型和所使用的特定刺激。由于使用了4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚砜基苯基)-5-(4-吡啶基)-1等抑制剂,对某些已发表数据的解释进一步复杂化gydF4y2BaHgydF4y2Ba-咪唑(SB 203580),单次高浓度使用。本研究的目的是确定两种第二代p38 MAPK抑制剂对人类培养细胞中一系列炎症细胞因子在基因和蛋白水平上表达的影响。在气道炎症的临床前体内模型中,对这些化合物对炎症细胞因子表达的影响进行了类似的评估。在THP-1细胞和原代气道巨噬细胞中的结果清楚地表明,抑制蛋白表达的浓度远低于影响基因表达所需的浓度。在啮齿动物模型中,这两种化合物在最大程度抑制细胞募集的剂量下,抑制肿瘤坏死因子α (TNFα)蛋白的产生,而不影响核因子κB通路的激活或TNFα基因的表达。总之,这里显示的数据表明,尽管在高浓度的化合物中存在一定程度的转录调节,但p38 MAPK在细胞因子产生中的主要作用是在翻译水平。这些数据质疑p38抑制剂对基因转录的影响是否与它们作为抗炎化合物的潜在治疗作用有关。gydF4y2Ba
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路被认为在对入侵病原体的先天反应中起着不可或缺的作用。在三种主要的MAPKs中,p38被认为参与细胞因子和趋化因子的产生,这些因子对招募对先天免疫反应至关重要的效应白细胞(如中性粒细胞)至关重要。SB 203580等化合物对p38 MAPK的抑制作用已被证明可以阻断脂多糖(LPS)诱导的单核/巨噬细胞产生细胞因子,如TNFα和IL-8 (gydF4y2BaYoung et al., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2BaLee等人,1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaManthey et al., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2BaNick et al., 2000gydF4y2Ba).在lps驱动的气道炎症的临床前啮齿动物模型中,研究表明p38 MAPK抑制剂存在时细胞因子产生和炎症细胞募集减少(Nick等人;gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba;安德伍德等人。gydF4y2Ba2000年,一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba;gydF4y2Ba哈达德等人,2001gydF4y2Ba).p38 MAPK在炎症细胞因子表达中的确切作用尚不清楚;牛顿和霍尔顿(gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba)整理了表明该激酶可能通过转录、转录后、翻译或翻译后进行调控的数据。事实上,回顾表明,这些机制中的一种或多种的参与可能取决于特定的细胞因子,所研究的细胞类型和所使用的刺激。最初使用SB 203580等抑制剂的研究表明,p38 MAPK只参与细胞因子表达的翻译控制(gydF4y2BaYoung et al., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2BaLee等人,1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaKotlyarov等人,1999gydF4y2Ba).然而,其他出版物表明p38 MAPK在调节几种促炎转录因子(如激活转录因子-2)中的作用。gydF4y2BaChen et al., 1998gydF4y2Ba)、nf -κb (gydF4y2Baraineaud et al., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba尼克等人,1999gydF4y2Ba),以及间接的激活蛋白-1 (gydF4y2Ba牛顿和霍尔顿,2003gydF4y2Ba).此外,有报道称p38 MAPK通过调节染色质调节间接影响NF-κB通路,影响DNA结合位点的通路(Saccani et al., 2001)。p38 MAPK也被证明可以增加含有腺苷/富尿苷元素的基因的mRNA的稳定性(gydF4y2BaWang等,1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaBrook et al., 2000gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
虽然p38 MAPK在细胞因子表达中的作用似乎是复杂的,但对一些已发表数据的解释因使用单一高浓度的抑制剂(如SB 203580)而进一步复杂化。本研究的目的是确定两种第二代p38 MAPK抑制剂SB 239063(报道在p38α ATP结合位点的活性为50 nM;安德伍德等人。gydF4y2Ba2000年,一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)和化合物2(在p38α ATP结合位点的活性为40 nM)在基因和蛋白质水平上对一系列炎症细胞因子的表达产生影响。活动(集成电路gydF4y2Ba50gydF4y2Ba据报道,SB 239063和化合物2在其他激酶上的表达量分别为100 - 10000和2500(纳米摩尔);> 10000和> 10000表达κ- b激酶-2;>为10,000,>为10,000;>0 10000, > 10000 AKT;> 10000, > 10000;2000美元,1000美元,10000美元;使用基于Lee等人发表的方法进行的分析,raf-MEK-ERK分别为b>万和b>万。gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba).在lps刺激的人单核细胞和原代培养的人肺组织巨噬细胞中进行浓度-反应曲线,比较不同化合物暴露水平对基因和蛋白质水平的影响。这两种抑制剂也在lps诱导的气道炎症的临床前啮齿动物模型中进行了分析,在该模型中,我们确定了对细胞因子基因和蛋白质表达的影响,以及对体内先天效应细胞募集的影响。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
THP-1单核细胞的培养gydF4y2Ba
人单核细胞系THP-1购自欧洲细胞培养集(ECACC;应用微生物学与研究中心,英国威尔特郡索尔兹伯里)。细胞在Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640中培养,使用谷氨酰胺I (Invitrogen LTD, Paisley, UK)添加10%胎牛血清和1%抗生素和抗真菌溶液(青霉素/链霉素;Sigma-Aldrich Co., Poole, UK)在37°C的加湿大气中[95%空气,5% (v/v) Co]gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。将细胞培养至75 cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba3天后更换培养基,此后每48 h更换一次。800℃离心上清液更换培养基gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下在冷旋(Mistral 3000i;MSE,伦敦,英国)。丢弃上清,将细胞颗粒重悬于1 ml含谷氨酰胺I的RPMI 1640中,加入10%胎牛血清和1%抗生素抗真菌液。台盼蓝细胞计数,细胞传代至2 × 75-cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba当细胞数达到10 × 10时烧瓶gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/毫升。该细胞系的倍增时间约为48小时。在实验天,细胞(10 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/ml), 800离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下在冷旋(Mistral 3000i;MSE)。丢弃上清,细胞小球用10 ml RPMI 1640洗涤,含谷氨酰胺I (Invitrogen LTD),添加1%抗生素和抗真菌溶液(青霉素/链霉素;西格玛-奥尔德里奇公司),没有胎牛血清。然后在相同条件下离心细胞,丢弃上清,细胞重悬于含有谷氨酰胺I的RPMI 1640中,添加3%胎牛血清和1%抗生素和抗真菌液。gydF4y2Ba
人肺组织巨噬细胞的提取gydF4y2Ba
人肺组织巨噬细胞是从不适合移植的未患病供体组织中获得的,如下所述。在获得亲属同意的同时,也获得了研究的伦理批准。将肺组织切成小块,用针和注射器(不含钙和镁)用磷酸盐缓冲盐水冲洗(Sigma-Aldrich Co.)。将混合后的细胞悬浮液通过70 μm细胞筛,在250℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C的冷旋中10分钟(Mistral 3000i;MSE)。丢弃上清,将细胞微球重悬于磷酸盐缓冲盐水中(不含钙和镁),并分层至六个不连续的Percoll梯度[60%/35%/25% (v/v)]。这些梯度然后在1200度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在20°C下放置25分钟。离心后,从35%和60% Percoll界面获得巨噬细胞富集组分,用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。然后将细胞用含谷氨酰胺I (Invitrogen LTD)的RPMI 1640重悬,添加10%胎牛血清(Invitrogen LTD)和1%抗生素和抗真菌溶液(青霉素/链霉素;Sigma-Aldrich有限公司)。台盼蓝排除法评估细胞活力,木村染色法检测巨噬细胞富集部分的细胞纯度。细胞悬液用谷氨酰胺I在RPMI 1640中稀释,添加10%胎牛血清和1%抗生素和抗真菌液,每孔40万个细胞加入24孔板(Costar)。然后将这些板在37°C的加湿气氛[95%空气,5% (v/v) CO]中孵育60分钟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。60 min后,洗去非贴壁细胞,加入新鲜培养基。粘附的纯化巨噬细胞(一致为>99%)孵育过夜,第二天处理。gydF4y2Ba
THP-1单核细胞与人肺组织巨噬细胞的复合治疗gydF4y2Ba
将含有40万个细胞的THP-1细胞悬液225 μl接种到24孔板上进行蛋白表达分析,将含有1.6 × 10个细胞的THP-1细胞悬液900 μl接种到RNA提取或细胞核提取上gydF4y2Ba6gydF4y2Ba将细胞接种到六孔板上。对于巨噬细胞,分别在贴壁细胞的24孔板和6孔板上添加225或900 μ lrpmi 1640和谷氨酰胺I,并添加3%胎牛血清和1%抗生素和抗真菌液。不同浓度(THP-1, 0.1 nM-1 μM;以10 nM-10 μM的SB 239063巨噬细胞和化合物2(英国GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, UK赠送)为阳性对照,以1 μM的地塞米松为阳性对照。在指定的孔中加入250微升(24孔板)或1000 μl(6孔板)每种浓度的药物,在37°C的湿化气氛[95%空气,5% (v/v) CO]中孵育60分钟gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。60 min后,加入25 μl(24孔板)或100 μl(6孔板)的培养液[0.01% (v/v)磷酸盐缓冲盐水(PBS)]或LPS (0.1 μl /ml),在37°C的湿化气氛[95%空气,5% (v/v) CO]中孵育gydF4y2Ba2gydF4y2Ba] 2小时(用于基因表达和提取)或24小时(用于蛋白质表达)。2 h和24 h后,将THP-1细胞悬液从板上转移到离心管中,800℃离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C的米斯特尔冷旋中浸泡5分钟。保留上清液用于酶联免疫吸附试验(ELISA)表达蛋白,保留细胞微球用于基因表达或总蛋白提取。对于巨噬细胞贴壁板,也保留上清液以ELISA法表达蛋白,并将贴壁细胞板冷冻以表达基因或提取总蛋白。gydF4y2Ba
SB 239063和化合物2对lps诱导THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞产生细胞因子(蛋白)的影响gydF4y2Ba
采用ELISA法检测THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞上清中tnf - α、IL-8、IL-6、mmp -1α、GROα、GM-CSF和G-CSF的水平,使用human Duosets,按照制造商说明书(R&D Systems Europe, Oxfordshire, UK)。gydF4y2Ba
SB 239063和化合物2对lps诱导THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞产生细胞因子(基因)的影响gydF4y2Ba
RNA提取和逆转录。gydF4y2Ba使用Tri Reagent (Sigma, Poole, UK)从THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞中分离细胞总RNA。简单地说,将1ml Tri试剂加入THP-1细胞的每个小颗粒和六孔巨噬细胞板的每孔中,然后将巨噬细胞转移到离心管中,按照制造商的说明从细胞中提取RNA。RNA样品的纯度和完整性通过gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba260gydF4y2Ba/gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba280gydF4y2Ba分光光度法测量GeneQuant RNA/DNA定量仪(Amersham Pharmacia Biotech, UK)。gydF4y2Ba
RNA样品(1 μg)使用主混合物(TaqMan逆转录试剂;应用生物系统公司,沃灵顿,柴郡,英国)含有1x TaqMan RT缓冲液,5.5 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,脱氧yntps混合物(500 μM / NTP), 2.5 μM随机六聚体,0.4 U/μl RNase抑制剂,1.25 U/μl Multiscribe逆转录酶,终反应体积为50 μl。RNA样品在Perkin-Elmer 480热循环器(Boston, MA)中25°C孵育10分钟,然后在48°C下反转录30分钟,最后在95°C下变性5分钟。然后将样品保存在-80°C直到需要分析。gydF4y2Ba
细胞因子mRNA表达。gydF4y2Ba通过聚合酶链式反应(PCR)扩增检测RNA样品中目标mRNA转录本的转录表达,并使用荧光标记的TaqMan探针(TaqMan;应用生物系统公司),使用ABI PRISM 7700序列检测系统(应用生物系统公司)的TaqMan实时定量PCR进行分析。gydF4y2Ba
预先开发的检测试剂盒(按需检测)从Applied Biosystems购买,用于研究THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞中靶基因(TNFα、IL-8、IL-6、groa和MIP-1α)的基因表达。反应用18s rRNA内控(Applied Biosystems)进行内控。PCR反应在含有3 μl样品cDNA (2.5 ng/μl)的25 μl反应体积中进行,目的基因按需测定,2× TaqMan Universal Master Mix, 18s内控(Applied Biosystems)。gydF4y2Ba
特定产物的扩增和检测在ABI PRISM 7000序列检测系统(Applied Biosystems)中进行,扩增方案包括1周期在50°C下2分钟,1周期在95°C下10分钟,40周期在95°C下15秒,60°C下1分钟。使用序列检测软件(Applied Biosystems)分析结果。将目的基因转录物的相对量归一化为同一cDNA样本中18S内控转录物的量。然后将数据与车辆对照组的水平进行比较,并显示为单独对照的2倍增长。gydF4y2Ba
化合物对p38 MAPK下游靶标和翻译标记的影响:Mnk1磷酸化。gydF4y2Ba为了证明这两种p38 MAPK抑制剂实际上影响激酶并抑制炎症介质蛋白的翻译,我们测量了磷酸化Mnk1的水平。Mnk1已被p38 MAPK磷酸化,该蛋白的磷酸化在翻译过程中至关重要(gydF4y2BaPyronnet等人,1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaWaskiewicz et al., 1999gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
THP-1细胞除在六孔板(1.6 × 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba1 nM-1 μM的化合物处理1 h,然后暴露于LPS (0.1 μg/ml)中。刺激后2小时(先前确定的时间点适合证明磷酸化Mnk1的增加),收集细胞颗粒。总蛋白用0.5 ml冷冻裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸,0.01 M EDTA)提取,其中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(25 μg/ml抑肽蛋白,10 μg/ml胰肽,10 μg/ml胃抑素A, 5 mM二硫苏糖醇,0.5 mM苯基甲基磺酰氟,2 mM正钒酸钠,1.25 mM氟化钠,1 mM热磷酸钠)。将细胞碎片离心成球,取下上清液保存。按照制造商的说明,使用NuPAGE系统(Invitrogen)进行蛋白质的Western blot分析。所有样品在添加抗氧化剂(Invitrogen)的MOPS缓冲液中以4 - 12%梯度凝胶运行。用NuPAGE转移缓冲液将蛋白质电转移到硝化纤维素膜上。根据制造商的说明,使用增强化学发光(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Bucks, UK)进行蛋白质检测。使用的一抗是抗phospho- mnk1 (Thr197/202, 1:1000;Cell Signaling Technology Inc.),二抗为抗兔免疫球蛋白/辣根过氧化物酶(1:2500; DakoCytomation Ltd.). Housekeeping protein used was actin (1:1000; Sigma-Aldrich Co.).
SB 239063和化合物2对lps诱导大鼠气道炎症的影响gydF4y2Ba
雄性Wistar大鼠(150-180 g)购自Harlan-Olac (Bicester, UK),使用前至少饲养5天。食物和水是免费供应的。英国内政部根据《1986年动物(科学程序)法》制定的动物福利准则得到严格遵守。gydF4y2Ba
如前所述,用不含内毒素的生理盐水(30分钟)或LPS (0.3 mg/ml)气雾剂刺激大鼠(gydF4y2Ba哈达德等人,2001gydF4y2Ba).在攻毒前1小时和攻毒后2小时口服载药(0.5%甲基纤维素和0.2%吐温80水中,2 ml/kg)、SB 239063(3、10或30 mg/kg)或化合物2(1、3、10或30 mg/kg)。纳入阳性标准地塞米松(0.01、0.1或1 mg/kg),并采用相同的治疗方案。攻毒6小时后,采用Birrell等人详细介绍的方法测定细胞炎症、髓过氧化物酶(MPO)活性、NF-κB p65 DNA结合、TNFα和IL-1β基因表达和蛋白水平。gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba).简单地说,用戊巴比酮钠(200mg /kg i.p)对动物实施安乐死,用RPMI (1ml / 100g体重乘以2,合并)灌洗气道,切除左肺叶,用RPMI灌注血管以清除任何血液,然后切碎。300毫克的肺组织通过酶消化来提取白细胞。剩余肺在液氮中快速冷冻,-80°C保存,用于细胞因子蛋白和基因表达分析。gydF4y2Ba
使用自动细胞计数器(Sysmex F-820;Sysmex UK Ltd, Linford Wood, Buckinghamshire, UK)。这些样品的细胞自旋是在一种细胞自旋(Shandon, Runcorn, UK)中以100 μl等分离心,700 rpm,室温下低加速,离心5 min制备的。载玻片固定并在Hema-tek 2000 (Ames Co., Elkhart, IL)上使用改良的wright - giemsa染色。按照标准形态学标准,每张切片200个细胞进行四部分鉴别计数,并测定嗜酸性粒细胞、淋巴单核细胞和中性粒细胞的百分比。gydF4y2Ba
为了测定肺组织中的MPO水平,使用Ultraturrax T25匀浆机将约200mg肺组织匀浆于2ml冰冷的生理盐水中。然后在台式微离心机中以13000的速度旋转样品gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟[MSE Micro Centaur;Jencons (Scientific) Ltd., Leighton Buzzard, Bedfordshire, UK]。gydF4y2Ba
用分光光度法测定肺匀浆中MPO的含量gydF4y2BaogydF4y2Ba-盐酸二苯胺作为底物。简单地说,240 μl底物溶液(50 mM磷酸盐,0.5%十六烷基三甲基铵缓冲液,含0.167 mg/ml)gydF4y2BaogydF4y2Ba盐酸二苯胺),10 μl HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(0.0005%),与10 μl样品或标准品(Sigma人MPO检测浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5和5 U/ml)混合。加入样品开始反应。用平板阅读器在450nm处读取吸光度,结果以每毫克总蛋白的单位表示。MPO水平被校正为总蛋白含量,这是用布拉德福德测定法测量的。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液中的细胞因子水平采用ELISA法测定,使用市售试剂盒,根据制造商的说明。tnf - α和IL-1β的测定采用R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)的大鼠特异性夹心免疫测定试剂盒。gydF4y2Ba
采用TransAM NF-κB p65 elisa检测试剂盒(Activ Motif, Rixensart, Belgium)检测NF-κB活性。简单地说,肺组织在裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Nonidet P40, 0.05%脱氧胆酸钠,0.025% SDS和0.1% Triton X-100)中均质,其中含有5 mM二硫苏糖醇和完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂(50ml缓冲液中一片)。采用Bradford法测定蛋白浓度,每个样品取100 μg蛋白。将样品(20 μl)与70 μl的结合缓冲液一起放置在96孔板上,固定含有NF-κB一致结合位点的寡核苷酸,在摇杆上放置1小时。在此期间,样品中含有的活化的NF-κB特异性结合该核苷酸,然后洗涤板,使用针对NF-κB p65亚基的一抗(100 μl在抗体结合缓冲液中1:1000稀释1 h),检测与寡核苷酸结合的NF-κB复合物。再次洗板,加入辣根过氧化物酶偶联二抗100 μl(抗体结合缓冲液1:1000稀释),静置1 h。再次洗板,加入显影液100 μl。避光孵育2 ~ 10min;加入100 μl停止液,用MCC/340 Multiskan读板仪在450 nm处读板。gydF4y2Ba
提取总细胞RNA、逆转录和肺组织中的基因表达,按照上述基于细胞的测定方法进行测定。使用从Applied Biosystems购买的预先确定的检测试剂检测TNFα mRNA的表达。为了证明这两种化合物对p38 MAPK的下游靶标和蛋白质翻译标记有影响,使用上述方法对均质肺组织磷酸化的Mnk1进行了Western blot分析。gydF4y2Ba
材料gydF4y2Ba
sb239063和化合物2是葛兰素史克公司的礼物。有限合伙人的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba血清型0111:B4购自Sigma。罗氏诊断公司(lewis, UK)提供dna酶和胶原酶。RPMI 1640培养基、HEPES、谷氨酰胺、PBS和胎牛血清均来自Invitrogen公司。所有ELISA试剂盒均来自R&D Systems (Abingdon, UK)。所有逆转录pcr试剂和Assay on requirements均来自Applied Biosystems (Warrington, UK)。戊巴比妥钠(Euthatal)来自National Veterinary Supplies (Harlow, UK)。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
图中及文中所有数值均以mean±S.E. mean of表示gydF4y2BangydF4y2Ba观察。使用Student's比较LPS暴露的影响gydF4y2BatgydF4y2Ba用曼-惠特尼测试gydF4y2BaUgydF4y2Ba未配对数据的后测。多重比较的统计分析采用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后检验。将各处理与相关载体对照组进行比较;差异被认为是显著的,当gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
SB 239063和化合物2对lps诱导THP-1细胞和人肺组织巨噬细胞产生细胞因子(蛋白)的影响gydF4y2BaLPS刺激引起THP-1细胞中tnf - α、IL-8、GROα和MIP-1α蛋白水平显著升高(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).SB 239063和化合物2预处理能显著抑制lps诱导的四种细胞因子的释放,其抑制作用近似ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba10 nM值(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).LPS刺激人肺组织巨噬细胞导致TNFα、IL-8、IL-6、MIP-1α、GM-CSF和G-CSF蛋白表达增加(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).两种p38 MAPK抑制剂引起细胞因子表达的浓度相关降低,类似于对THP-1细胞的影响;然而,抑制的幅度似乎较小,特别是对某些细胞因子,即IL-8,并且化合物的效力降低了10倍。gydF4y2Ba
SB 239063和化合物2对lps诱导THP-1细胞和原代人肺巨噬细胞产生细胞因子(基因)的影响gydF4y2BaLPS刺激THP-1细胞导致细胞因子基因表达显著增加(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).这两种化合物的预处理对TNFα、GROα和MIP-1α基因表达均无显著影响,尽管在某些情况下,使用最高浓度会有所降低(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba).有趣的是,这两种化合物都抑制了lps诱导的IL-8基因表达,与化合物2 (1 μM)相比具有统计学意义,并显著抑制了基础IL-8基因表达。gydF4y2Ba
为了研究这些化合物对巨噬细胞基因表达的影响,我们测量了IL-6的水平,因为这种细胞因子的蛋白表达受p38 MAPK抑制剂的影响最大。与基础水平相比,SB 239063和化合物2(0.01、0.1、1和10 μM)的表达差异为1倍,分别为26.6、27.1、27.4和16.1,而对照组为28.9,与24.0对照组相比分别为29.5、30.2、27.4和13.8。这些数据表明,与THP-1细胞的结果相似,两种化合物在一定浓度下都不会影响基因表达,从而抑制蛋白质表达。虽然在最高浓度(10 μM)对基因表达有抑制作用。gydF4y2Ba
两种p38 MAPK抑制剂在人类细胞检测系统中的活性证明及其在蛋白质翻译水平上的影响gydF4y2BaLPS刺激引起培养的人细胞中Mnk1磷酸化水平升高(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba).两种p38 MAPK抑制剂的预孵育引起磷酸化- mnk1增加的浓度相关抑制,这似乎与观察到的炎症蛋白的抑制直接相关(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
SB 239063和化合物2对lps诱导大鼠气道炎症的影响。gydF4y2BaLPS暴露导致肺组织嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增加(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)和BALF中性粒细胞(从15±5到1849±174 × 10gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba细胞/ml)和嗜酸性粒细胞(从1±0到68±12 × 10)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba细胞/毫升)号码。口服两种p38 MAPK抑制剂和地塞米松引起lps诱导的肺组织嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的剂量相关减少(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba).这些化合物对组织嗜中性粒细胞的影响是通过测量MPO水平来证实的,MPO是这种细胞类型的特异性标记(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba).p38 MAPK抑制剂对气道管腔中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量均无显著影响,但SB 239063最高剂量(30 mg/kg)显著减少中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(797±128和22±3 × 10)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba分别为cell /毫升)。地塞米松处理(1mg /kg)显著降低lps诱导的灌洗液中性粒细胞和嗜酸性粒细胞募集水平(481±68和21±6 × 10)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba分别为cell /毫升)。任何化合物对BALF和肺组织淋巴单核细胞数量均无显著影响(数据未显示)。gydF4y2Ba
对TNFα和IL-1β蛋白水平的评估显示,lps诱导TNFα升高,但IL-1β不升高[生理盐水/对照物,158±23;LPS/vehicle, 1720±183;LPS/化合物2 (30 mg/kg), 1633±248;LPS/SB 239063 (30 mg/kg), 1434±199;脂多糖/地塞米松(1 mg/kg), 532±88 pg/mg肺组织],被两种p38 MAPK抑制剂以剂量相关的方式抑制(数据与化合物的最高剂量显示在gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba),而阳性对照组地塞米松显著降低了这两种细胞因子的水平。使用p65 DNA结合来评估NF-κB通路激活水平,数据显示LPS暴露后NF-κB通路激活水平显著增加,p38 MAPK抑制剂不受影响,但地塞米松(gydF4y2Ba图9 bgydF4y2Ba).暴露于LPS导致tnf - α基因表达增加,地塞米松显著降低了tnf - α基因表达,但p38 MAPK抑制剂对tnf - α基因表达没有影响(gydF4y2Ba图9 cgydF4y2Ba).先前暴露于LPS的动物的肺组织匀浆中磷酸化的Mnk1水平显著增加(参见gydF4y2Ba图9 dgydF4y2Ba).p38 MAPK抑制剂抑制了phospho-Mnk1 (gydF4y2Ba图9 dgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
p38 MAPK在炎症细胞因子表达中的作用尚不清楚;最近的一项研究表明,这种激酶可以通过转录、转录后、翻译或翻译后调节它们的表达(gydF4y2Ba牛顿和霍尔顿,2003gydF4y2Ba).对一些已发表的数据的解释由于使用单一的、高浓度的抑制剂而进一步复杂化。本研究的目的是确定两种第二代p38 MAPK抑制剂SB 239063 (Underwood et al.;gydF4y2Ba2000年,一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba)和化合物2在基因和蛋白质水平上对一系列炎症细胞因子的表达有影响。gydF4y2Ba
在lps刺激的人单核细胞和肺组织巨噬细胞中,这两种化合物预处理降低了大多数细胞因子的蛋白水平,其他组在这些细胞类型中观察到抑制p38 MAPK的功能(gydF4y2BaLee等人,1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaCarter et al., 1999gydF4y2Ba;Shafer et al., 1999;gydF4y2BaNick et al., 2000gydF4y2Ba;安德伍德等人。gydF4y2Ba2000年,一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba;gydF4y2BaCampbell et al., 2004gydF4y2Ba).结果表明,与原代肺组织巨噬细胞相比,化合物对单核细胞的疗效和效力更大。这种差异在IL-8蛋白表达方面尤为明显,这一结果与最近的一项研究一致,该研究显示SB 203580对肺泡巨噬细胞产生IL-8的抑制作用有限(gydF4y2BaKoch et al., 2003gydF4y2Ba).造成这种差异的原因尚不清楚,但正如Carter等人所提出的,这可能意味着p38 MAPK在这种细胞类型中的主导作用较弱。gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba)和Nick等人(gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba),并且在开发这种类型的化合物用于治疗慢性阻塞性肺病等疾病时需要考虑,其中巨噬细胞可能是重要的效应细胞。gydF4y2Ba
TaqMan实时mRNA表达分析比传统PCR更敏感,表明化合物对相同细胞因子的mRNA水平影响有限。在观察到对基因表达的影响时,只有在高于影响蛋白质表达所需的浓度时才明显。有趣的是,这两种化合物似乎都抑制了基础和lps刺激的IL-8基因表达,这可能表明p38 MAPK对该细胞因子的作用不同。总的来说,这一数据与Young等人发表的结果一致(gydF4y2Ba1993gydF4y2Ba), Lee等人(gydF4y2Ba1994gydF4y2Ba), Kotlyarov等人(gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba),因为p38抑制剂对细胞因子蛋白产生的主要作用是通过阻断转录后机制。事实上,来自体外和体内研究的数据表明,Mnk1的磷酸化受到抑制,这首先表明这两种化合物在两个系统中抑制p38 MAPK,其次,这些抑制剂的影响是在蛋白质翻译水平上。基于人类细胞的实验数据清楚地表明,抑制细胞因子的产生与抑制蛋白质翻译标记(gydF4y2BaPyronnet等人,1999gydF4y2Ba;gydF4y2BaWaskiewicz et al., 1999gydF4y2Ba), Mnk1的磷酸化,这表明两者之间存在因果关系。在临床前模型的组织中,观察到类似的Mnk1抑制,而不是NF-κB通路活性或细胞因子基因表达,这再次表明这些化合物的影响是在蛋白质翻译水平上。gydF4y2Ba
引言中概述的其他研究表明p38 MAPK抑制剂对细胞因子基因转录的影响,事实上,在更高的化合物浓度下,本研究也观察到类似的数据。从这项研究看来,使用p38 MAPK抑制剂抑制细胞因子表达的“转录方面”仅在高浓度下实现,这可能会质疑这类抗炎化合物的这一特征的药理学/治疗相关性。gydF4y2Ba
在lps驱动的气道炎症的临床前啮齿动物模型中,这两种化合物都抑制了先天效应细胞的募集,证实了我们小组和其他使用p38 MAPK抑制剂的研究的类似结果(Nick等人)。gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba;安德伍德等人。gydF4y2Ba2000年,一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba;gydF4y2Ba哈达德等人,2001gydF4y2Ba).两种化合物均抑制lps诱导的肺组织中TNFα蛋白的生成,如Nick等人所示(gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba),但有趣的是,与我们之前对SB 203580的研究不同,它们对IL-1β蛋白水平没有影响(gydF4y2Ba哈达德等人,2001gydF4y2Ba).这一结果表明,使用该模型方案,lps诱导的TNFα而非IL-1β的产生涉及p38 MAPK。我们之前的研究与这次研究的差异原因尚不清楚,但可能是由于SB 203580缺乏选择性(gydF4y2BaDean et al., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉利等人,2000gydF4y2Ba).为了确定这些化合物是否在该模型中影响转录或翻译,我们通过elisa检测p65 DNA结合,TaqMan实时PCR检测TNFα基因表达,Western blot分析Mnk1磷酸化,评估了这些化合物对NF-κB通路的影响。数据清楚地表明,虽然阳性对照地塞米松显著抑制p65 DNA结合和tnf - α基因表达,但两种化合物在转录水平上似乎都没有影响。该结果表明,暴露于雾化LPS后,p38 MAPK通过转录后机制调节肺中细胞因子蛋白的产生。gydF4y2Ba
总之,我们已经确定了两种第二代p38 MAPK抑制剂在lps驱动的人类细胞实验和内毒素诱导的气道先天反应的临床前啮齿动物模型中的影响。这里显示的数据表明,尽管在高化合物浓度下存在一定程度的转录调节,但p38 MAPK在细胞因子产生中的主要作用是在翻译水平上。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2005年7月27日gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2005年12月15日gydF4y2Ba
doi: 10.1124 / jpet.105.093310。gydF4y2Ba
缩写:gydF4y2BaMAPK,丝裂原活化蛋白激酶;sb203580, 4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚砜基苯基)-5-(4-吡啶基)-1gydF4y2BaHgydF4y2Ba咪唑;有限合伙人,脂多糖;肿瘤坏死因子α;IL,白介素;NF-κB,核因子κB;ROCK, rho相关的盘绕形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶;Alk5,激活素受体样激酶;AKT,丝氨酸/苏氨酸激酶(蛋白激酶B);Lck,轻链激酶;细胞外信号调节蛋白激酶; MEK, MAPK/ERK kinase; SB 239063,反式gydF4y2Ba(1) - 4-hydroxycyclohexyl 4 - (4-fluorphenyl) 5 - (2-methoxy-pyridimidin-4-yl)咪唑;化合物2,1 -(1,3-二羟基丙基-2-基)-4-(4-氟苯基)-5-(2-苯氧嘧啶-4-基)咪唑;PBS,磷酸盐缓冲盐水;ELISA,酶联免疫吸附试验;巨噬细胞炎症蛋白;GRO,生长调节癌基因产物;GM-CSF,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;G-CSF,粒细胞集落刺激因子;聚合酶链式反应;4- morpholinepropanesonic acid; MPO, myeloperoxidase; BALF, bronchoalveolar lavage fluid; BAL, bronchoalveolar lavage.
- 美国药理学和实验治疗学会gydF4y2Ba