文摘
nintedanib triple-angiokinase抑制剂是一种口头,有力,和选择性的肿瘤血管生成抑制剂通过阻断血管内皮生长因子受体的酪氨酸激酶活动(VEGFR) 1 - 3,血小板源生长因子受体(PDGFR)α和- - - - - -β,纤维母细胞生长因子受体(FGFR) 1 - 3。Nintedanib获得监管部门批准的二线治疗腺癌非小细胞肺癌(NSCLC),结合多烯紫杉醇。此外,nintedanib被批准用于治疗特发性肺纤维化。在这里,我们报告的结果广泛激酶屏幕识别额外的激酶作为低摩尔nintedanib目标范围。这些激酶的几个已知突变或过表达,参与肿瘤的发展(discoidin域受体家族,成员1和2,原肌球蛋白受体激酶(TRKA)和C,重新安排在转染原癌基因(RET原型致癌基因)),以及纤维化疾病(例如,ddr)。在肿瘤细胞系显示分子改变潜在nintedanib目标,抑制剂演示直接抗增殖效果:在非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703 PDGFRα放大(振幅);胃癌细胞系KatoIII和乳腺癌细胞系MFM223,由FGFR2放大;AN3CA(子宫内膜癌)基因突变FGFR2轴承;急性髓系白血病细胞株MOLM-13和MV-4-11-B FLT3突变;和非小细胞肺癌腺癌LC-2 /广告窝藏CCDC6-RET融合。然而,强有力的激酶抑制不严格地转化为抗增殖活性,证明在TRKA-dependent细胞系CUTO-3 KM-12。重要的是,nintedanib NCI-H1703肿瘤异种移植的治疗有效的肿瘤收缩,引发指示直接影响肿瘤细胞在肿瘤间质血管生成的影响。这些发现将在指导指导未来genome-based nintedanib的临床试验。
介绍
抑制肿瘤血管生成是一种公认的治疗选择,癌症患者的治疗。几个小分子抑制剂,以及抗体,近年来已获批准,从2004年贝伐单抗(铜,2005)结直肠癌和最新添加的ramucirumab nintedanib在2014年(Reinmuth et al ., 2015)。抗血管新生疗法,除了治疗肾细胞癌,是结合化疗(杰森et al ., 2016;Stukalin et al ., 2016)加强病人反应,延长总生存期。负责增强化疗药物的疗效的机制还不完全清楚,尤其是涉及多个组件的肿瘤基质不一定相关(Gasparini et al ., 2005 a,b;Boere et al ., 2010;Moschetta et al ., 2010;耆那教的,2014)。通过antivascular效应假说包括肿瘤血管正常化,导致更好的药物输送和分配(耆那教的,2005;Cesca et al ., 2016),血管吸收,肿瘤劫持现有的脉管系统的能力在肺部或肝脏等器官(Kerbel 2015)。另一个可能的贡献来自特定“脱靶”激酶的抗血管新生的抑制酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)常与所谓multi-TKIs(例如,pazopanib瞄准Ret激酶)。Nintedanib之前已经被描述为一个三angiokinase抑制剂靶向肿瘤基质尤其是脉管系统(Hilberg et al ., 2008)。基于抑制概要,nintedanib被作为肿瘤血管生成抑制剂的临床试验,导致其监管机构批准二线腺癌非小细胞肺癌(NSCLC)治疗结合多西他赛(介意et al ., 2014)。Nintedanib显示了强大的好处迅速进展的肿瘤患者不响应一线以铂为基础的化疗或显示启动后6个月内的进展一线化疗,这提示Nintedanib的血管生成的影响,因为这种快速增长的肿瘤严重依赖氧气供应和有氧代谢,因此适当的血管连接(Hilberg et al ., 2014) J肿瘤防治杂志32,2014(增刊;abst e22080) ASCO海报)。是否延长nintedanib激酶抑制概要文件可以导致观察到的临床效益,直接影响肿瘤细胞增殖和生存仍然是相关的。FGFR基因改变,如突变或放大或融合,已经报道了以下癌症:膀胱(FGFR3) (癌症基因组图谱研究,2014 b),子宫内膜(FGFR2) (Winterhoff Konecny, 2017)和肺(FGFR1) (维斯et al ., 2010;Dienstmann et al ., 2014),乳房(FGFR1和2),胃(FGFR2) (癌症基因组图谱研究,2014),肺和神经胶质瘤(FGFR3-TACC3融合)(Capelletti et al ., 2014;Di Stefano et al ., 2015)。PDGFRA基因的基因改变发生在约5%的胃肠道间质瘤,并放大多形性成胶质细胞瘤病例的-10%存在于5%,少突神经胶质瘤,在食管鳞状细胞癌,动脉内膜的肉瘤,2% - -3%的非小细胞肺癌(腺癌日,2013年)。
我们目前的数据清楚地强调nintedanib的潜力,作为一个代理,直接抑制肿瘤细胞增殖和生存。这种效应的nintedanib可以看到在一个广泛的肿瘤类型和各种基因改变从变异放大,也是在小分子抑制剂靶向肿瘤epigenetically组合。我们还表明,抑制受体酪氨酸激酶(RTK)激酶水平并不一定转化为细胞的效果。总的来说,我们的研究结果提供了一个强有力的理由的临床调查特定子集的nintedanib oncogene-driven癌症。
材料和方法
癌细胞的分子特征线面板(Ricerca 240 - oncopanel)
240 - oncopanel Ricerca信息可以发现:https://www.eurofinspanlabs.com/Catalog/Products/ProductDetails.aspx?prodId=YWEUPExy%2Fhg%3D和代表补充表3。相对拷贝数的值确定使用Affymetrix人类全基因组SNP数组6.0平台。使用CRMA v2的分析方法(Bengtsson et al ., 2009),其次是CBS分割,实现为香气的一部分项目(http://www.aroma-project.org)(Bengtsson et al ., 2008)。绝对复制数字计算使用野餐算法(http://www.sanger.ac.uk/science/tools/picnic)(格林曼et al ., 2010)。
突变分析
突变后被称为最佳实践描述,例如,在Alioto et al。(2015)。对于RNA-seq基因表达数据处理和量化,图书馆从polyA-enriched RNA(协议试剂盒,Illumina公司)测序的Illumina公司使用paired-end协议HiSeq1500 50周期和平均2500万读入。基因和转录量化进行了使用SAMtools版本1.0 (李et al ., 2009)和袖扣版本2.0.2 (杰尔et al ., 2010)。的分子状态nintedanib目标激酶Ricerca小组确定如下:激酶与相对拷贝数> 4被认为是放大。为每个激酶过度的阈值是由各自的定义指的是在所有的细胞系在肿瘤类型加上各自的标准差的两倍。突变的功能的影响是来自MutationAssessor (http://mutationassessor.org/)(Reva et al ., 2011)。统计计算(费舍尔测试)进行使用R开源编程语言(www.r-project.org;R核心团队,2016年,R:统计计算的语言和环境。R统计计算的基础,奥地利的维也纳。URLhttp://www.R-project.org/)。
人类肿瘤样本的分子特征
基因表达和变更频率(拷贝数变异),TCGA数据集进行了分析使用cBio门户网站在线工具(www.cbioportal.org)(斯拉米et al ., 2012)。
激酶试验
激酶化验进行热费希尔生命技术(十分WA)使用标准协议(SelectScreen生化分析服务,热费希尔科学)。ATP浓度使用的明显K米。
Z”·莱特试验条件。
1%的化合物筛选dimethylsulffoxide (DMSO)(最终浓度)。10点滴定,三倍系列从起始浓度进行稀释。所有肽/激酶混合物浓度被稀释到2×工作在适当的激酶缓冲区(见Kinase-Specific试验条件部分的完整描述补充材料)。ATP的解决方案都是稀释4×工作集中在激酶缓冲区(50毫米消息灵通的pH值7.5,0.01% BRIJ-35, MgCl 10毫米21毫米EGTA)。明显的ATPK米使用Z”·莱特试验之前确定。发展发展试剂稀释缓冲(见部分Kinase-Specific试验条件:直接和级联为一个完整的描述补充材料)。十倍的小说PKC脂质混合:2毫克/毫升磷脂酰丝氨酸,0.2毫克/毫升DAG 20毫米玫瑰,pH值7.4,0.3%的家伙。
Adapta试验条件。
1% DMSO溶液的化合物筛选(最终浓度)。10点滴定,三倍系列从起始浓度进行稀释。所有基质/激酶混合物浓度被稀释到2×工作在适当的激酶缓冲区(见Kinase-Specific试验条件部分的完整描述补充材料)。ATP的解决方案都是在水中稀释4×工作浓度。明显的ATPK米时使用放射分析除了之前确定没有可用衬底,在这种情况下,一个Adapta化验。检测混合制备TR-FRET稀释缓冲。检测混合的EDTA(30毫米),Eu-anti-ADP抗体(6海里),和ADP示踪剂。检测混合包含EC60示踪剂的浓度为5 - 150μM ATP。
LanthaScreen欧盟激酶结合试验条件。
1% DMSO溶液的化合物筛选(最终浓度)。10点滴定,三倍系列从起始浓度进行稀释。所有激酶/抗体混合物浓度被稀释到2×工作在适当的激酶缓冲区(见Kinase-Specific试验条件部分的完整描述补充材料)。在激酶4×AlexaFluor-labeled示踪剂制备缓冲。
细胞和免疫印迹
NCI-H1703细胞被播种在six-well板块和reverse-transfected 10 nmol / l ON-TARGETplus人类核和LipofectAMINE RNAiMAX(猫。不。13778075;表达载体,卡尔斯巴德,CA) 72小时37°C。转染是根据供应商的执行手册使用以下siRNAs: (FGFR1 siRNA j - 003131 - 00 - 0002 - 10;PDGFRA siRNA j - 003162 - 00 - 0002 - 12;不属预定目标的siRNA, d - 001810 - 01 - 20),所有来自Dharmacon(英国剑桥)。前两小时溶解细胞,nintedanib (BIBF 1120)和/或PD173074添加不同浓度的文化。化合物在DMSO溶液稀释连续和孵化细胞。溶菌产物生成根据标准协议(奥苏贝尔et al ., 2004)(当前分子生物学技术,由f·m·奥苏贝尔编辑r·布伦特·r·e·金斯顿·d·d·摩尔,j·g·塞德曼,j . a . Smith & k . Struhl 2004年,约翰·威利和儿子,Inc .)。 Western blotting was done using standard SDS-PAGE methods, loading 10µ每道克蛋白质,增强化学发光的检测。总金额和磷酸化蛋白质检测使用相应的抗体,购买和使用根据制造商的指示:phospho-p44/42增殖蛋白激酶(MAPK) (Erk1/2) (Thr202 / Tyr204)(猫。不。9101;细胞信号技术,丹弗斯,马);p44/42 MAPK (Erk1/2)(猫。不。9102;细胞信号);蛋白激酶B(一种蛋白激酶)(猫。 no. 9272); phosphorylated Akt (Ser473) (cat. no. 4058); cleaved caspase-3 (cat. no.. 9665); FGF receptor 1 (D8E4) XP Rabbit mAb (cat. no. 9740); FGF receptor 2 (D4H9) (cat. no. 11835); and PDGF receptorα(猫。不。3164)都从细胞信号。GAPDH是用作加载控制(ab8245;Abcam, Cambridge, MA)。
细胞生存能力分析
在3000年和10000年之间细胞/镀在96 -的平底微量滴定板和隔夜在37°C孵化有限公司2孵化器与各自的媒介。测试化合物添加不同浓度为72小时。6小时后孵化Alamar蓝色的解决方案(热费舍尔/表达载体,卡尔斯巴德,CA)在37°C,荧光测量(想象MultiModeReader;沃尔瑟姆,PerkinElmer MA)使用531 nm的激发波长和发射在595海里。
数据分析
通过迭代计算数据安装使用s形曲线分析程序(Prism 3.0版本;图垫,拉霍亚,CA)变量希尔EC的斜率50值计算。
IncuCyte化验
急性髓系白血病(AML)细胞(MOLM-13、MV-4-11B THP-1)镀(1×104/)在96 -聚-d-lysine-coated黑色/明确的底板块(BD BioCoat,霍舍姆PA)。第二天,化合物在表示添加浓度。细胞生长的可视化和测量是通过IncuCyte变焦活细胞成像(埃森生物科学,安阿伯市,MI)。细胞融合是监控长达140个小时,在此期间图片每3个小时。
体内肿瘤模型
老鼠被安置在无菌条件下(美国协会的评估实验动物保健认证机构)和治疗机构,政府,和欧盟指导方针(奥地利动物保护法,实验动物科学协会(GV-SOLAS),实验动物科学协会联合会[FELASA])。综述了动物研究和批准的内部伦理委员会和地方政府委员会。雌性老鼠6到8周大,BomTAC: NMRI -Foxn1ν(21-31 g)注射1×106(100年µl) NCI-H1703或2.5×106MV-4-11-B细胞皮下注射到右翼。肿瘤使用卡尺测量三次每周。卷是根据以下公式计算:肿瘤体积=长度直径×2×π/ 6。肿瘤生长抑制(家)以下公式计算:
家= 100×{1−[(治疗最后一天−治疗俊)/(控制最后一天−控制俊)]}。
单方面减少Mann-Whitney测试是用来比较肿瘤体积(功效)。的P肿瘤体积值评估调整根据Bonferroni-Holm多重比较。对所有分析,P值< 0.05代表了显著效果。计算计算使用kaplan - meier生存曲线曲线分析程序(Prism 3.0版本;图垫)。
结果
Nintedanib显示有效的抑制FGFR酪氨酸激酶1 - 3和PDGFR酪氨酸激酶α/β。
与课堂上的竞争对手进行比较,nintedanib分子显示nintedanib更有效,更平衡的抑制概要文件在三重angiokinase面板。Nintedanib与舒尼替、vandetanib pazopanib, cediranib基于IC50值确定并行分析(表1)。nintedanib, PDGFR VEGFR1-3之前报道的效力α和β与集成电路,FGFR1-3可以被复制50值< 100 nmol / l,稍微降低集成电路50值VEGFR2 3和PDGFRα和β(Hilberg et al ., 2008)。舒尼替、vandetanib pazopanib, cediranib抑制VEGFR-2和3浓度< 100 nmol / l,但PDGFR的抑制α和β是少的,有明确对FGFR抑制能力下降。展品的例外是cediranib抑制整个FGFRs nintedanib相提并论。在这个比较中,索拉非尼是最有效的药物,与集成电路50测试值≥100 nmol / l的激酶面板。
Nintedanib强有力地抑制致癌rtk FGFRs和pdgfr之外。
之前报道激酶目标光谱呈现nintedanib triple-angiokinase小分子TKI (Hilberg et al ., 2008)。探索激酶抑制前面描述的以外,nintedanib测试更广泛,245 -激酶面板。除了先前报道的13激酶nintedanib目标,我们21额外激酶也被nintedanib, IC50值< 100 nmol / l (表2)。在这些新发现的目标激酶是众所周知的管制通过基因改变,因此可以作为致癌司机在人类癌症。这些包括激酶改变在NSCLC的子集,比如Ret (2 nmol / l;(Berge Doebele, 2014)和原肌球蛋白受体激酶(TRKA) (35 nmol / l;(马et al ., 2008)。激酶Abl1和工具包(分别为13个和9 nmol / l)也被认为是会开车在几个肿瘤突变类型,包括白血病(Greuber et al ., 2013;Stankov et al ., 2014)。Nintedanib还能抑制DDR1和2(分别为23日和18 nmol / l),已被描述为参与炎症和纤维化的进程(Guerrot et al ., 2011;Olaso et al ., 2011)。
TKIs干扰激酶活性在体外激酶检测并不意味着这个活动将转化为细胞活动。我们解决这个问题在两个细胞系与已知的重组NTRK1导致本构TRKA受体激活:cuto - 3.29 NSCLC细胞腺癌行轴承MPRIP-NTRK1重排和(Doebele et al ., 2015)和微卫星不稳定高结直肠癌细胞系KM-12 TPM3-NTRK1易位的(营地et al ., 2004)。所示图1cuto - 3.29 (图1 c)和KM12 (图1 d)细胞有高水平的Ptrka,导致pERK1/2和pAKT水平升高。作为演示,这些pTRKA和pERK1/2水平可以减少TRK-specific抑制剂的添加,entrectinib,浓度低至1 nmol / l。相比之下,更高浓度的nintedanib (≥1000 nmol / l)被要求减少pTRKA和pERK1/2水平。欧共体50nintedanib和entrectinib值计算为955和117 nmol / l cuto - 3.29细胞和557和2.3 nmol / l KM12细胞系,分别为(图1,A和B)。因此,尽管nintedanib是一个相对的有效抑制剂TRKA激酶面板,这种力量不转化为抑制受体磷酸化和下游信号在癌症细胞系轴承TRKA重组。
Nintedanib直接抑制肿瘤细胞增殖。
解决详细nintedanib的细胞抑制能力,药物测试大量的细胞系(240 - oncopanel Ricerca,补充表3)。Nintedanib显示效果(截止:500 nmol / l;补充表1)对12 242年癌症细胞系的跨多个适应症(图2一个),包括胃癌、慢性粒细胞性白血病AML,非小细胞肺癌、肾癌、横纹肌肉瘤、甲状腺癌(补充表1 b)。这些细胞系司机突变,可能,可能被nintedanib目标。例如,AML细胞株MV-4-11 FLT3突变表达了ITD独家等位基因,它充当致癌驱动程序(Quentmeier et al ., 2003)和由nintedanib抑制胃肠道5053 nmol / l (补充表1)。10的12个敏感细胞株,表现出基因改变在一个总数16 nintedanib目标激酶,突变,放大或超表达(图2 b;补充表2)。两个敏感细胞株不带任何nintedanib目标激酶突变高度突变- 427 (NSCLC)线,携带418突变和肾细胞癌g - 401细胞株311突变(补充表1)。此外,a - 427细胞系显示了高度复杂的放大模式。16个激酶基因所示图2 b类似的程度上改变了敏感和不敏感细胞株。
TCGA的数据集的肿瘤类型所代表的敏感细胞株是查询来确定的总频率改变的16 nintedanib通道激酶。大约42%的胃癌病例存在分子改变的任何描述16基因。变化检测在急性髓系白血病和慢性淋巴白血病研究大多是突变与扩增或重组(补充图1)。nintedanib-sensitive激酶过表达的细胞系,在某种程度上,也在各自的TCGA数据集(补充图2)。总之,242 12 nintedanib-sensitive细胞系的癌症面板包含在激酶基因改变nintedanib的目标。
影响经济增长的肿瘤细胞株体外Nintedanib目标可能是驱动突变。
我们决定反应的非小细胞肺癌细胞株NCI-H1703 (PDGFRα和FGFR1放大器),胃癌行KatoIII (FGFR2放大器),子宫内膜癌的细胞系AN3CA (FGFR2傻瓜。)和乳腺癌细胞系mfm - 223 (FGFR2振幅)与nintedanib治疗。所示表3,所有四个细胞系生长抑制与EC nintedanib治疗50值越低摩尔范围:NCI-H1703 10 nmol / l, KatoIII 176 nmol / l, AN3CA 152 nmol / l, mfm - 223 108 nmol / l。正如所料,索拉非尼,这是一个非常弱的抑制剂和PDGFR FGFR激酶活性(见表1),也是一个脆弱的抑制剂NCI-H1703 KatoIII细胞系(EC50值分别为258和383 nmol / l;表3)。舒尼替,IC50值71年和184年对PDGFR nmol / lα和分别FGFR2激酶(表1),也明显不如nintedanib有力,与电子商务5039 nmol / l值NCI-H1703细胞和624 nmol / l对KatoIII线(表3)。nintedanib之间的差异、舒尼替和索拉非尼经信号通路分析NCI-H1703细胞PDGF BB刺激后。所示图3 dnintedanib和舒尼替能够减少pMAPK pAKT, pPDGFRα浓度的方式水平降至10 - 50 nmol / l,而索拉非尼与MAPK全面干预,AKT和PDGFRα激活只在测试浓度最高的1µmol / l。
图3一还表明,激活MAPK和PDGF BB是被刺激后nintedanib浓度≥10 nmol / l。磷酸化AKT的可以看到同样的效果。此外,PARP转换成裂解PARP的标记细胞凋亡也看到nintedanib浓度≥30 nmol / l。相比之下,我们还研究了伊马替尼的影响,一个弱抑制PDGFR TKI (Capdeville et al ., 2002在此设置。所示图3、伊马替尼干扰MAPK和AKT激活只在最高浓度测试(1000 nmol / l),导致微弱cPARP信号。这个区别nintedanib和伊马替尼的结果低(10倍)效力的伊马替尼抑制PDGFRB激酶活性,EC的确证50伊马替尼的值相比nintedanib(所示表3)。
所示补充图3,NCI-H1703和KatoIII细胞系有两个基因的扩增。PDGFRA和FGFR1在NCI-H1703细胞局部放大,而FGFR2和PDGFRA放大KatoIII细胞。确定哪些基因改造正在推动这两个细胞系的增殖和生存,可拆卸的实验进行。图3 b表明推倒FGFR1在NCI-H1703细胞没有影响pAKT pMAPK,而PDGFRA击倒(KD)减少了pMAPK以及pAKT信号。添加浓度的增加nintedanib PDGFRA KD导致一个完整pMAPK和pAKT信号的损失。添加nintedanib FGFR1 KD也影响了pAKT和MAPK信号但在较小程度上,证明NCI-H1703细胞主要由PDGFRA放大驱动。
在癌症迹象nintedanib-targetable司机突变,胃癌患病率分别显示了FGFR2放大4% - -10% (癌症基因组图谱研究,2014)。我们分析了nintedanib的影响,这个群体的代表,在KatoIII细胞增殖和生存途径。这个细胞株已经报道FGFR2的拷贝数增加17。Nintedanib抑制增殖在这个细胞与IC50176 nmol / l和干扰MAPK在bFGF和AKT激活——刺激KatoIII细胞100和30 nmol / l,分别为(图3 c)。在同样的实验中,pan-FGFR抑制剂PD173074抑制KatoIII细胞增殖IC5030 nmol / l和干扰MAPK和AKT浓度低至10 nmol / l。
NSCLC细胞腺癌行LC-2 /广告,带有CCDC6-RET融合作为司机突变(铃木et al ., 2013),也应对nintedanib测试,基于我们发现RET也是一个目标药物(EC50值= 149 nmol / l)。在同样的实验中,vandetanib,销售药物治疗甲状腺癌的基于其Ret抑制,给出了电子商务50值247 nmol / l(数据未显示)。
基于之前报道抑制Flt3 nintedanib (Kulimova et al ., 2006;Hilberg et al ., 2008)我们非常有兴趣去探究结合小分子打赌(bromodomain和extraterminal)家庭抑制剂BI 894999(影响小说的押注抑制剂BI的upregulation 894999HEXIM1在肿瘤细胞和抗肿瘤活性在异种移植肿瘤模型。J肿瘤防治杂志34,2016增刊;文摘11574 (ASCO))。证明了在补充图4,nintedanib特别有助于Flt3-mutated AML细胞株的增殖抑制(MOLM-13和MV-4-11-B)但没有抑制携带野生型Flt3 THP-1 AML细胞的增殖。nintedanib BI 894999的结合完全抑制MOLM-13和MV-4-11-B AML细胞的增殖,而没有结合的有益效果Flt3野生型细胞系是(Fiskus et al ., 2014)。
体内抗肿瘤功效的Nintedanib肿瘤异种移植轴承Nintedanib-Targeted司机改变。
作为nintedanib强有力地抑制NCI-H1703 NSCLC细胞的体外生长线,熊PDGFRα放大,我们决定分析肿瘤小鼠的体内抗肿瘤功效。证明了在图4 A和B,小鼠皮下NCI-H1703肿瘤治疗nintedanib(阻塞VEGFR-2和pdgfr);vatalanib VEGFR-2抑制TKI占主导地位;和PDGFR抑制剂伊马替尼的两个不同剂量(75毫克/公斤每天和每天两次)。选择剂量的药物的体内实验是基于先前发表的报告展示暴露> 1µmol / l的血浆浓度峰值nintedanib选择剂量100毫克/公斤(Hilberg et al ., 2008)和vatalanib (木头et al ., 2000)。NCI-H1703上按照其体外活性细胞,nintedanib是最强大的三个化合物的体内抗肿瘤功效与家的价值导致肿瘤收缩107%至100毫克/公斤。相比之下,PDGFR抑制剂伊马替尼在75毫克/公斤每天一次或两次取得家值的45%和58%,分别。每天换一次vatalanib治疗的剂量100毫克/公斤导致73%的家,这是符合抗血管新生药物的效果观察。所有治疗都是耐受性良好,所有治疗组的体重在治疗期间(数据没有显示)。
的抗肿瘤疗效nintedanib孤独和结合打赌家庭抑制剂BI 894999在皮下MV-4-11-B AML的评估模型,如图所示图4,汉英。TGI值单药打赌抑制剂BI 894999 78%, nintedanib占92%,99%的组合。结合良好的耐受性,剂量可以维持近100天也Kaplan-Meyer图所示图4 e。七个八个联合治疗组动物存活实验到最后只有一个治疗无关的死亡。894999年BI治疗组,所有的动物都必须根据终止标准安乐死在50天左右,nintedanib组,五个动物安乐死在100天。
讨论
三重angiokinase抑制剂nintedanib已经获得监管批准治疗特发性肺纤维化,以及二线非小细胞肺癌与多西他赛(勃朗特et al ., 2016)。在这个报告中,我们现在,第一次,药物直接证据表明nintedanib,强有力地抑制肿瘤的发展是由nintedanib目标激酶的基因改变。240肿瘤细胞系的屏幕显示12 nintedanib敏感细胞株,其中近一半来自白血病。16 nintedanib-sensitive激酶被放大,突变,或在这些细胞系。没有已知的突变代表功能热点地区各自的激酶域,和他们的功能影响,到目前为止,未知;然而,激酶结构域之外的激活突变的性质,例如,被证实为PI3激酶(康et al ., 2005)。两个细胞系不表现出突变nintedanib目标基因显示多个突变和放大模式过于复杂的推导nintedanib清晰的敏感性因素。改变到16 nintedanib-sensitive激酶不独家敏感细胞株;他们也不敏感细胞株中,我们假设依赖于其他改变和组合驱动恶性行为。
TCGA的数据库被审问了组合畸变对这些激酶发病率。比例最高的观察胃癌(42.2%),其次是AML (10%)。FLT4和PDGFRB经常过表达在胃癌和AML,表明nintedanib可能是有用的治疗这些特殊患者群体。
这可能是重要的科学或临床环境中肿瘤治疗越来越分散的基于预处理的遗传信息通过分析肿瘤活检。现在这种方法是建立在非小细胞肺癌患者的治疗轴承EML-ALK或表皮生长因子受体突变(罗科et al ., 2016),他接受适当TKIs针对这些变化在第一行设置。癌症的突变筛查越来越纳入标准临床实践要求需要有针对性和良好的耐受性增加药物。报告中说明的,除了强有力地抑制肿瘤血管生成,nintedanib也有效地阻止肿瘤细胞的扩散由改变PDGFRA, FGFR2,受潮湿腐烂,FLT3。我们还表明,该抗增殖活动转化为单药治疗体内抗肿瘤功效强劲nintedanib,包括肿瘤收缩。
这些结果表明,nintedanib双重机制:一方面,它抑制肿瘤血管生成;另一方面,它直接影响肿瘤细胞增殖,导致细胞凋亡的诱导。这将打开新的治疗可能性nintedanib肿瘤亚型,根据PDGFRA FGFR2,受潮湿腐烂,或FLT3基因改变单独或结合化疗。AML与内部的串联重复FLT3基因(FLT3ITD突变)据报道发生在约20%的AML患者(多恩et al ., 2015)。它与不利的结果,患者可能会复发。一类新的化合物,押注抑制剂,正在深入调查了功能型和在AML的第一阶段试验。结合打赌抑制剂BI 894999 nintedanib可能导致改善生存利益具有良好的耐受性AML的FLT3突变子群。这些发现扩展先前的报告结合打赌用FLT3抑制剂酪氨酸激酶抑制剂在体外设置(Fiskus et al ., 2014)。
在临床实践中,nintedanib耐受性良好,方便病人管理。在这里,我们表明,nintedanib是一个强有力的和均衡的三重angiokinase抑制剂与其他课堂相比竞争对手。全面的VEGFR、PDGFR FGFR亚型构成三重angiokinase抑制,nintedanib展品低摩尔IC50值,而等竞争对手舒尼替、vandetanib pazopanib,索拉非尼完全缺乏FGFR活动和更有效的抑制剂VEGFR1-3和PDGFRα和β。尽管延长34激酶的激酶抑制概要作为nintedanib目标,该药物是由患者耐受性良好daily-dosing时间表与课堂的药物需要间歇给药方案,以减少不良反应(李和Motzer, 2015年)。此外,nintedanib尚未与严重的副作用,如hand-foot综合征(李et al ., 2015)。
更多FGFR选择性TKIs(例如,AZD4547 BGJ398)在癌症治疗具有前景的临床功效2期临床试验,但也伴随着显著的负面影响,如hand-foot综合症和浆液性脉络膜视网膜病变(Katoh 2016)。Hibi等人已经解决的影响nintedanib FGFR1放大人类肺鳞状细胞癌细胞系H520 LK-2和可以证明nintedanib抑制扩散FGFR1 CNG-positive LSCC细胞系FGFR1-ERK与衰减的信号通路在体外和体内Hibi et al ., 2016)。这些数据与结果呈现在这篇文章中,演示nintedanib作为强有力的抑制剂的潜在癌细胞轴承FGFR改变(放大,突变)认股权证确认在癌症患者的肿瘤临床试验调查nintedanib港FGFR变化。
Nintedanib的双重活动TKI瞄准两个基因改变肿瘤细胞(FGFRs和pdgfr),以及肿瘤基质通过干扰肿瘤血管生成,可能是一种优势药物目标具体rtk更多的选择性。正常化肿瘤基质环境的重要性变得越来越重要在即将到来的组合与immune-checkpoint抑制剂(亨得利et al ., 2016)。新兴的数据强有力地证明了改进免疫反应的重要性通过干扰VEGF-driven负面影响在树突状细胞的成熟,t细胞激活,调节t细胞增殖,促进myeloid-derived抑制细胞,以及干扰激活肿瘤血管和肿瘤血管正常化的床(亨得利et al ., 2016)。
34激酶的抑制浓度低于100 nmol / l标识nintedanib多TKI,但这事实是有点误导,因为纯粹的激酶抑制并不总是转化为抑制性细胞的活动环境。在本文中,我们清楚地表明,激酶抑制NTRK1 IC5030 nmol / l值并没有转化为细胞系的细胞抑制窝藏TRKA受体激活。相同的差异激酶和细胞活动已经观察到林恩和LCK激酶细胞活动观察非常薄弱是预测的激酶抑制数据(Hilberg et al ., 2008)。
Nintedanib已经证明是一种有效的抗血管新生和antifibrotic药物获得监管部门的批准作为抗癌剂,作为antifibrotic药物用于治疗非小细胞肺癌的二线治疗,分别结合多烯紫杉醇和特发性肺纤维化。在这个报告中描述的附加功能,即抗增殖活动肿瘤由PDGFR, FGFR, FLT3,并且仓促的改变,可以认为是一个未来增值nintedanib在癌症治疗的临床应用。类似的方法已在临床实践中实现对肺肿瘤由EML-ALK重组(Blackhall Cappuzzo, 2016甲状腺癌)或RET-mutated crizotinib和vandetanib分别(楚et al ., 2012)。Nintedanib已经被临床试验在这些subindications在未来几年数据变得可用(例如,NCT02278978,NCT02299141)。
确认
作者感谢莫妮卡Kriz马修·肯尼迪玛蒂娜·谢勒,雷吉娜·尼娜Rodi, Susanne设和苏西施特劳宾优秀的技术支持和数据评估和伊丽莎白安德森博士的批判阅读手稿。
作者的贡献
参与研究设计:Hilberg Tontsch-Grunt, Baum, Le, Doebele Lieb,詹尼·沃斯,Garin-Chesa, Haslinger,德国人。
进行实验:Lieb Tontsch-Grunt Baum, Le,詹尼·沃斯。
执行数据分析:Hilberg Tontsch-Grunt, Baum, Le, Doebele Lieb,詹尼·沃斯,Garin-Chesa, Haslinger。
或导致写作手稿中写道:Hilberg Tontsch-Grunt, Baum, Le, Doebele Lieb,詹尼·沃斯,Garin-Chesa, Haslinger,德国人。
脚注
- 收到了2017年7月25日。
- 接受2017年12月11日。
A.T.L.和R.C.D.收到资金通过科罗拉多大学肺癌孢子(NIH / NCI P50 CA058187)。
本文在补充材料jpet.aspetjournals.org。
缩写
- 一种蛋白激酶
- 蛋白激酶B
- AML
- 骨髓性白血病
- 振幅
- 放大
- DDR 1和2
- discoidin域受体家族成员1和2
- DMSO溶液
- 二甲亚砜
- 的兵
- 细胞外调节激酶
- FGFR
- 纤维母细胞生长因子受体
- KD
- 可拆卸的
- MAPK
- 增殖蛋白激酶
- 非小细胞肺癌
- 非小细胞肺癌
- PDGFR
- 血小板源生长因子受体
- RTK
- 受体酪氨酸激酶
- TKI
- 酪氨酸激酶抑制剂
- TRKA
- 原肌球蛋白受体激酶
- VEGFR
- 血管内皮生长因子受体
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