文摘gydF4y2Ba
之前的研究已经表明,离子通道瞬时受体电位草酸4 (TRPV4)功能表现在气道平滑肌细胞gydF4y2BaTRPV4gydF4y2Ba单核苷酸多态性与气流梗阻患者的慢性阻塞性肺疾病。我们试图用等长张力测量体外航空公司确定短期药理激活强有力的兴奋剂的TRPV4 GSK1016790 [gydF4y2BaNgydF4y2Ba- ((1gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)1 - {[4 - ((2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)2 - {((2,4-dichlorophenyl)磺酰)氨基}3-hydroxypropanoyl羰基)1-piperazinyl]} 3-methylbutyl) 1-benzothiophene-2-carboxamide]将人类支气管收缩组织。正如预测的那样,瞬时受体电位草酸4激活人类呼吸道产生收缩受阻的非选择性瞬时受体电位通道阻滞剂钌红。此外,这部小说TRPV4-selective阻滞剂GSK2334775 [(gydF4y2BaRgydF4y2Ba(6)- methylsulfonyl 3 - (4 - (pyrrolidin-1-yl) piperindin-1-yl)甲基)-gydF4y2BaNgydF4y2Ba- (2,2,2,-trifluoro-1-phenylethyl) 2 - (3 - (trifluoromethyl)苯基)quinoline-4-carboxamide]抑制这些收缩浓度范围与其体外效力一致反对重组和本地TRPV4-containing频道。令人惊讶的是,TRPV4-dependent收缩也被一个5-lipoxygenase抑制剂和两个结构不同的半胱氨酰白三烯受体拮抗剂。总的来说,我们的结果不支持假设TRPV4气道平滑肌细胞短期调节气道收缩性。相反,我们提供药理证明TRPV4激活导致人工气道收缩完全依赖于半胱氨酰白三烯等的生产。在一起,这些数据确定一个新颖的机制TRPV4激活可能有助于病理重构和炎症,除了气流阻塞,在人类呼吸道病。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
在许多呼吸系统疾病,夸大了对吸入刺激物的反应导致气流阻塞。尽管多种因素导致这种净反应,包括组织重构,腔的粘液堵塞,和中枢神经系统的副交感神经反应,根本改变气道平滑肌收缩性被认为是气道反应性的关键调节器。因为气管平滑肌功能依赖于胞质CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba处理,大量的研究都集中在识别机制,可以通过限制恢复气道平滑肌内稳态胞质CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba海拔高度。gydF4y2Ba
压敏电阻器Ca的抑制剂gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba渠道有效地抑制人类气管平滑肌收缩引起的极化KCl-dependent,虽然收缩受生理机制如G protein-coupled受体配体和IgE交联比较抗压敏电阻器CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba通道块(gydF4y2BaGorenne et al ., 1998gydF4y2Ba)。分子的身份gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba渗透的渠道促进这一生理相关的细胞外钙gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba涌入仍然难以捉摸;然而,最近的研究表明,瞬时受体离子通道的潜在总科的成员可以给这个角色。特别是,瞬时受体电位草酸4 (TRPV4)已成为一个强有力的候选人基于几个观察:1)TRPV4消息出现在人类培养气道平滑肌细胞(gydF4y2Ba贾et al ., 2004gydF4y2Ba);2)4gydF4y2BaαgydF4y2Ba13-didecanoate佛波醇12日,拉伸(gydF4y2BaIto et al ., 2008gydF4y2Ba),和低渗的解决方案,每个激活不同的表达TRPV4通道(gydF4y2BaVriens et al ., 2004gydF4y2Ba),导致细胞外钙gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba流入到人类气管平滑肌细胞被TRPV通道阻滞剂钌红而不是其他胞质阻断剂CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba动员(gydF4y2BaIto et al ., 2008gydF4y2Ba);和3)造成的人类气管平滑肌的收缩是细胞外钙低渗的解决方案gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba依赖(gydF4y2BaJongejan et al ., 1990gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaTRPV4gydF4y2Ba单核苷酸多态性与气流阻塞在慢性阻塞性肺疾病(gydF4y2Ba朱et al ., 2009gydF4y2Ba)。基于这些结果,我们旨在测试的假设TRPV4引起收缩的人类孤立的航空公司。gydF4y2Ba
使用有效的和有效的TRPV4活化剂GSK1016790 [gydF4y2BaNgydF4y2Ba- ((1gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)1 - {[4 - ((2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)2 - {((2,4-dichlorophenyl)磺酰)氨基}3-hydroxypropanoyl羰基)1-piperazinyl]} 3-methylbutyl) 1-benzothiophene-2-carboxamide] (gydF4y2BaWillette et al ., 2008gydF4y2Ba),我们证明TRPV4激活产生健壮的人类和豚鼠的收缩(但不是老鼠或鼠标)孤立气道的准备工作。我们进一步证明非选择性TRPV阻滞剂钌红和小说TRPV4-selective阻滞剂GSK2334775 [(gydF4y2BaRgydF4y2Ba(6)- methylsulfonyl 3 - (4 - (pyrrolidin-1-yl) piperindin-1-yl)甲基)-gydF4y2BaNgydF4y2Ba- (2,2,2,-trifluoro-1-phenylethyl) 2 - (3 - (trifluoromethyl)苯基)quinoline-4-carboxamide] (gydF4y2Ba布鲁克斯et al ., 2011gydF4y2Ba)废除这些收缩,提供令人信服的药理证明TRPV4离子通道功能对这种反应至关重要。令人惊讶的是,进一步的实验未能支持假设TRPV4激活或封锁任何检测急性或直接对气管平滑肌收缩性的影响。相反,TRPV4激活引起收缩,实际上是被抑制5-lipoxygenase (5-LO)活动或得罪半胱氨酰白三烯(cysLT) 1受体识别TRPV4频道活动作为小说机制产生cysLT-dependent人类呼吸道的收缩。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
组织收购。gydF4y2Ba
所有程序进行认证设施按照普遍预防措施来处理人类血液,体液,和组织(Biohazardous代理注册88-06-22-060)和机构的指导方针,包括美国国家卫生研究院(NIH)gydF4y2Ba指导实验室动物保健和使用的gydF4y2Ba(NIH出版85 - 23)。人类的肺器官捐赠者获得国家疾病研究交换(费城,宾夕法尼亚州。gydF4y2Bawww.ndriresource.orggydF4y2Ba)。人类支气管肺泡灌洗(BAL)样本来自史蒂夫博士Kelsen(宾夕法尼亚州费城坦普尔大学肺中心)。所有适用的机构审查委员会批准。所有的人类生物样本的道德,他们的研究使用符合知情同意的条款。动物实验进行评估和认证协会的实验动物Care-accredited设施符合国家卫生研究院gydF4y2Ba指导实验室动物保健和使用的gydF4y2Ba并被批准的机构动物保健和使用委员会制度的执行工作。gydF4y2Ba
平滑肌张力测量。gydF4y2Ba
部分支气管肺癌和清洁的被附着连接,实质和脂肪组织。支气管条大约3到4毫米宽度都准备好并放在修改Krebs-Henseleit解决方案由113.0毫米氯化钠,氯化钾4.8毫米,2.5毫米CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,1.2毫米KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,1.2毫米MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba,25.0毫米NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,11.0毫米葡萄糖和平衡与95% OgydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ 5%股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba并保持在37°C。除非另外注明,饱和浓度的非选择性环氧合酶(COX)抑制剂(1gydF4y2BaμgydF4y2BaM meclofenamic酸或3gydF4y2BaμgydF4y2Ba吲哚美辛)都包括在缓冲溶液来消除干扰的内生考克斯发布产品。人类支气管静态组织浴条件下进行评估以及在过冷条件下。在所有情况下,组织暂停下最优的静息张力为1.5gydF4y2BaggydF4y2Ba。潜伏期后达到稳定的基底的语气,组织受到毒蕈碱的受体激动剂氯化carbamylcholine(碳酰胆碱,10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)确认可行性。张力达到高原后,卡巴可被自由组织和支气管放松回到基线。拮抗剂或车辆被添加到组织至少60分钟,之后TRPV4揭幕战GSK1016790 (100 nM,除非另有注明)然后添加到缓冲溶液。GSK1016790-evoked张力达到高原后,碳酰胆碱(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)又管理建立一个参考最大收缩。应对GSK1016790都表示为一个百分比的这个引用卡巴可收缩。当多个气道部分被用于一个实验条件相同的捐赠者,来自这些段平均响应和反应是作为一个单独的评估gydF4y2BangydF4y2Ba价值。我们发现没有显著差异的百分比GSK1016790收缩引起的过冷浴或静态组织设计;因此,我们汇集的数据两个方法。gydF4y2Ba
对于动物研究,气管被撤男性哈特利豚鼠(体重450 - 650克;查尔斯河、搬运、MI),雄性老鼠(C56BL / 6 j;杰克逊实验室,巴尔港,我),雄性老鼠(雄性sd,中查尔斯河)。对豚鼠和大鼠气管上皮被条被削减,大约两个软骨环宽。老鼠,整个气管进行了研究。个人组织暂停下最佳张力和平衡之前添加GSK1016790 60 - 90分钟。监测宫缩,表示为一个百分比的最大收缩与carbamylcholine观察。失败的啮齿动物气管应对GSK1016790所有强烈回应毒蕈碱的受体激动剂(例如,鼠标气管收缩2.3±0.2克;gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)gydF4y2Ba
钙成像实验。gydF4y2Ba
钙成像实验用FLIPR5荧光成像板读者(分子器件、桑尼维尔CA)。重组体人TRPV4渠道进行了实验根据以前公布的过程(gydF4y2Ba嗯et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaThorneloe et al ., 2012gydF4y2Ba)。研究人类TRPV4-containing本地频道,BAL细胞健康志愿者(27-52岁男性或女性不吸烟者,FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba(在1秒用力呼气量)> 80%的预测值)隔绝大约30 ml样品。平衡液,得到二阶cation-free磷酸盐含200 U / ml青霉素,200gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml链霉素,1gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml两性霉素B,过滤除去粘液或其他聚合,离心机在4°C (700gydF4y2BaggydF4y2Ba,10分钟),用台盼蓝排斥不能存活的细胞计数,resuspended 4×10的浓度gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/毫升杜尔贝科修改鹰的介质高葡萄糖10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升链霉素。BAL细胞被镀在96 -黑墙明确底部板在4×10 (Packard视图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞每口井。贴壁巨噬细胞选择是通过反复洗掉不依从细胞镀后30 - 120分钟,之后细胞培养基是补充和细胞孵化不超过24小时。孵化后,媒体吸气,取而代之的是100毫升的加载介质包含鹰与伯爵盐和最小的重要媒介gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,0.1%牛血清白蛋白(Billerica的微孔,MA), 4gydF4y2BaμgydF4y2BaM Fluo-4-acetoxymethyl酯荧光指示剂染料(Fluo-4点;表达载体,卡尔斯巴德,CA)和2.5毫米丙磺舒。细胞培养1小时在37°C。gydF4y2Ba
吸气dye-containing媒体后,细胞被洗了三次与100毫升Krebs-Ringers-Henseleit分析缓冲区(120毫米氯化钠,氯化钾4.6毫米,1.03毫米KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba25毫米NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba,1.0毫米CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,1.1毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,11毫米葡萄糖,20毫米玫瑰,0.1%明胶,2.5毫米丙磺舒,pH值7.4)。评估GSK2334775拮抗剂的影响,100毫升克雷布斯-gydF4y2Ba
Ringers-Henseleit分析缓冲区,含有0.1%二甲亚砜,GSK2334775(10或100海里),或钌红(10gydF4y2BaμgydF4y2BaM)添加到井和板加热到37°C的前15分钟dye-loaded细胞暴露在激发光(488海里)从6 W氩激光器。基底发射荧光测量拍摄后,细胞反应的浓度范围TRPV4揭幕战GSK1016790(0.3 -1000海里)监测10分钟516海里排放荧光强度。从每个结果转换为百分比GSK1016790峰值响应,因为这总是> 75%的阅读由添加ionomycin (1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)的实验(没有显示)。数据被转移到GraphPad棱镜软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)和策划。GSK1016790 EC的转变gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值的对手相比,车辆被用来确定对手力量席尔德使用标准分析。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
TRPV4通道的测试我们的假设,激活人类支气管收缩,我们体外暴露人类支气管组织有力和有效TRPV4揭幕战GSK1016790。符合我们的预测,GSK1016790引起人类支气管的收缩。在两个初步的实验中,我们发现GSK1016790阈值浓度为10 nM和最大响应得到100海里(见量效曲线代表gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。所有进一步的研究中,我们评估了应对TRPV4刀的100海里。22个捐助者的支气管评估时,GSK1016790造成一个健壮的(> 25%的最大响应诱发的毒蕈碱的受体激动剂氯化氨甲酰胆碱添加实验结束时)收缩,除了一个组织(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba),平均为50%±3%的最大值。我们测试的能力非选择性TRPV阻滞剂钌红抑制这种反应在从四个捐助者、支气管的收缩至100 nM GSK1016790平均为45%±13%。正如预测的那样,钌红(1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)废除了反应(0%±0%),但没有改变卡巴可参考收缩的实验。gydF4y2Ba
增加信心,TRPV4频道活动引起人类呼吸道的收缩,我们确定了新的复合GSK2334775,紧密的结构相对先前确定的有效和选择性TRPV4阻滞剂GSK2193874A [7-bromo -gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(1-phenylcyclopropyl) 3 - [(4-piperidin-1-ylpiperidin-1-yl)甲基]2 - [3 - (trifluoromethyl)苯基]quinoline-4-carboxamide] (gydF4y2Ba嗯et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaThorneloe et al ., 2012gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。细胞内钙荧光成像板读者分析测量gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba小说的水平,我们的拦截器有说服力地阻止agonist-induced CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba通量通过重组人类TRPV4渠道(图片gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 8.0 + 0.1;gydF4y2BangydF4y2Ba= 10)以及类似的力量在attachment-selected BAL细胞健康志愿者(pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 8.3 + 0.1;gydF4y2BangydF4y2Ba= 4;gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。这个细胞群,主要包含肺泡巨噬细胞,表达了本机老鼠TRPV4-containing频道(gydF4y2BaHamanaka et al ., 2010gydF4y2Ba),我们的数据提供了证据表明,这些发现对人类可翻译。因此,GSK2334775有效地重组和本地TRPV4-containing通道块类似的效力。gydF4y2Ba
后确定GSK2334775化合物适合TRPV4药理学研究,我们试图确定是否会阻止GSK1016790-induced人类支气管的收缩。事实上,GSK2334775产生的浓度抑制GSK1016790收缩ICgydF4y2Ba50gydF4y2Ba价值的pgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值获得与本地TRPV4-containing通道(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。抑制响应由一个已知的非选择性阳离子孔隙TRPV通道阻滞剂和一种新型小分子TRPV4抑制剂提供了令人信服的药理证明TRPV4频道活动会对人类支气管和可能限制气流阻塞性呼吸道疾病患者。gydF4y2Ba
我们注意到GSK1016790-evoked束缚发展相对缓慢,与3 - 10分钟gydF4y2BatgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba。在初步实验中,我们还注意到,GSK1016790-evoked收缩非常缓慢可逆(数据未显示)。我们的解释这些数据,GSK1016790可能通过间接机制人类气管平滑肌收缩,导致生产缓慢可逆/亲脂性的介质。我们实验中最大限度地有效浓度的非选择性COX抑制剂阻止bronchoconstricting前列腺素或凝血恶烷的生产。值得注意的是,当我们评估的影响在支气管GSK1016790两个捐助者没有COX抑制剂的情况下,最大萎缩32.7%和30.4%,这不是明显不同于我们观察到当考克斯被阻塞。gydF4y2Ba
的基础上缓慢的收缩反应的动力学和COX-independent性质,我们假设GSK1016790收缩可能依赖于生产cysLTs,唯一的亲脂性的特征和缓慢可逆部分人类的航空公司。如果cysLTs必要介质GSK1016790-induced收缩,收缩cysLT1受体的拮抗剂,应该敏感受体亚型已知调解cysLTs人类气管平滑肌的行为(gydF4y2BaPanettieri et al ., 1998gydF4y2Ba)。我们测试这个假说通过预处理组织最大限度地抑制浓度的ici - 198615 [1 - [[2-methoxygydF4y2BargydF4y2Ba羰基- [[(phenylsulfonyl)氨基]]苯基)甲基)1gydF4y2BaHgydF4y2Ba-indazol-6-yl]氨基甲酸环戊基酯;1gydF4y2BaμgydF4y2BaM]或SK&F 104353 [2 (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)-hydroxy-3 (gydF4y2BaRgydF4y2Ba)- ((2-carboxyethyl)含硫的)3 - [2 - (8-phenyloctyl) pheny l]丙酸;10gydF4y2BaμgydF4y2BaM],结构无关的cysLT1受体拮抗剂(gydF4y2Ba干草et al ., 1987gydF4y2Ba;gydF4y2Ba斯奈德et al ., 1987gydF4y2Ba)。与我们的假设一致,这两个分子几乎阻止了GSK1016790-mediated收缩(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
解决的可能性cysLT1拮抗剂阻断TRPV4,我们进一步评估在GSK1016790-mediated 5-LO抑制宫缩的影响。5-LO CysLTs合成的酶,这种酶催化花生四烯酸的氧化。5-LO抑制剂与特征(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)显著抑制GSK1016790-evoked收缩(gydF4y2Ba图3 A和CgydF4y2Ba),进一步充实我们假设cysLTs从头合成是一个专下游工序所需GSK1016790-mediated人类呼吸道的收缩。gydF4y2Ba
我们利用已知的物种差异气管平滑肌药理学提供进一步的证据,TRPV4通过cysLTs完全激活引起支气管收缩。豚鼠的航空公司(gydF4y2BaMcAlexander et al ., 1998gydF4y2Ba),类似于人类,在应对cysLTs收缩,而航空公司的老鼠和老鼠不(gydF4y2Baet al ., 1999年举行gydF4y2Ba;gydF4y2Ba里希特和Sirois, 2000gydF4y2Ba)。因为GSK1016790激活大鼠和小鼠TRPV4 (gydF4y2BaWillette et al ., 2008gydF4y2Ba),我们认为如果GSK1016790狭隘的人类和几内亚猪一样,但是不是老鼠或鼠的气道,这将提供额外的证据,GSK1016790收缩是cysLT依赖。事实上,GSK1016790没有收缩大鼠或小鼠气管(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)。值得注意的是,在两个额外的初步实验,GSK1016790浓度(1大10倍gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)也没有收缩鼠标航空公司(没有显示)。形成鲜明对比,100 nM GSK1016790感染豚鼠气管与功效比得上在人体组织(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。此外,这些豚鼠气道收缩受到1gydF4y2BaμgydF4y2Ba钌红(最大3%±3%的氯化氨甲酰胆碱对仅在组织接受GSK1016790 46%±10%;gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)。反应在两个豚鼠气管被cysLT1拮抗剂SK&F基本上废除了104353 (10gydF4y2BaμgydF4y2BaM;34%和61%和0.4%和0%)。这只发现GSK1016790压迫气道组织已知物种的收缩cysLTs符合人类支气管数据证明的多个结构无关的调节器cysLT生产或行动抑制GSK1016790响应。gydF4y2Ba
因为TRPV4通道功能表达人类气管平滑肌细胞体外(gydF4y2Ba贾et al ., 2004gydF4y2Ba),我们预计,TRPV4激活可能提高气管平滑肌收缩性。调查这种可能性,我们首先进行预处理与5-LO抑制剂与支气管组织,服务于防止任何潜在的混杂内生cysLTs的生产,然后我们检查体内的量效关系应用白三烯(LT) DgydF4y2Ba4gydF4y2Ba在没有和TRPV4刀面前GSK1016790(100海里)。5-LO封锁的条件下,与上述结果一致,GSK1016790没有影响基线紧张,也没有影响的量效特征有限公司gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。从两个额外的捐助者在支气管,我们还指出,GSK1016790对LTE的量效曲线没有影响gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。此外,我们注意到,无论是GSK1016790还是GSK2334775有任何影响收缩的效果最大响应卡巴可作为我们的标准(gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.1;gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。这些数据没有提供任何证据表明,TRPV4激活可以敏锐地改变人类气管平滑肌收缩性cysLT独立的生产。gydF4y2Ba
肥大细胞位于附近的气管平滑肌的可能来源cysLTs导致GSK1016790-induced收缩。我们比较了应对GSK1016790最大ige肥大细胞介导的反应,可以诱发。与来自八个捐助者的成对支气管在实验中,我们发现TRPV4受体激动剂引起的收缩大约50%的“肥大细胞最大”的反应得到1gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml ige(59.5%±4.4%和33.5%±8.7%;gydF4y2BangydF4y2Ba= 8)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
先前的研究表明,非选择性阳离子通道TRPV4表达和功能在哺乳动物的呼吸道(gydF4y2Ba贾et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2Ba安德拉德et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba杨et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba剑et al ., 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朱et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaDelany et al ., 2001gydF4y2Ba)和多个证据表明TRPV4激活可能影响气管平滑肌功能。TRPV4单核苷酸多态性,包括产生的一个功能,表现的频道人工气道上皮细胞(gydF4y2Ba李et al ., 2011gydF4y2Ba),与气流限制在慢性阻塞性肺疾病(gydF4y2Ba朱et al ., 2009gydF4y2Ba),药理研究表明,TRPV4可以影响气管平滑肌CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba信号在体外(gydF4y2Ba贾et al ., 2004gydF4y2Ba)。这里,我们使用有效和选择性药理工具检查急性TRPV4激活是否会引起收缩的人类孤立的航空公司。违背了我们最初的假设TRPV4直接影响气道平滑肌收缩性,我们证明TRPV4激活导致人类气道收缩只通过cysLTs的生产。因此,尽管我们无法检测的角色TRPV4离子通道在急性反应bronchoconstrictive刺激,我们的数据提供了新颖的证据支持一个人类支气管气道病理TRPV4的角色。具体来说,我们的数据介绍cysLT合成作为小说机制TRPV4通道激活内源性和/或吸入因素可能促进气道炎症,病理组织重构和气流阻塞。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们使用了一个强大的和选择性TRPV4调节器。的激动剂GSK1016790先前被标识为一个选择性TRPV4能够激活不同的表达人类TRPV4渠道比以前更大的效力和有效性特征TRPV4活化剂,包括佛波醇酯4gydF4y2BaαgydF4y2Ba佛波醇12日13-didecanoate (gydF4y2BaWillette et al ., 2008gydF4y2Ba)。我们发现造成的收缩GSK1016790二级TRPV4激活是支持的事实,他们被非选择性TRPV拮抗剂钌红。此外,收缩被封锁的选择性TRPV4拮抗剂GSK2334775浓度符合其明显关联重组人类TRPV4频道。顺便说一下,我们的初步描述这个对手adherence-selected BAL细胞健康志愿者提供的证据表明,这种细胞群,它主要包含肺泡巨噬细胞,表达TRPV4频道。这部小说发现与先前的发现在小鼠肺泡巨噬细胞(是一致的gydF4y2BaHamanaka et al ., 2010gydF4y2Ba),提供了第一个证据,这种现象转化为人类。gydF4y2Ba
TRPV4频道活动导致阳离子在生物膜通量,导致在胞质Ca膜电位去极化和海拔gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba。胞质钙的作用gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba海拔在平滑肌兴奋收缩偶联,结合现有的数据,多个化学和物理刺激激活TRPV4增加胞质CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba浓度在人类气管平滑肌细胞(gydF4y2Ba贾et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaIto et al ., 2008gydF4y2Ba),让我们假设化学活化的TRPV4 GSK1016790将直接人类气管平滑肌收缩。多个证据反驳这一假设,而是支持假设TRPV4刺激人类支气管间接通过生产cysLTs激活平滑肌。首先,健壮的气道收缩引起的GSK1016790几乎是被两个结构无关的cysLT1受体拮抗剂。第二,阻止5-LO cysLT的义务酶的生产,实际上废除了TRPV4-mediated收缩。第三,GSK1016790狭隘的人类和豚鼠气道组织,与航空公司的两个物种,收缩cysLTs,而GSK1016790没有收缩航空从大鼠或小鼠,尽管GSK1016790激活TRPV4频道。第四,GSK1016790 5-LO抑制剂的存在与,没有影响的效力或疗效等收缩受体激动剂有限公司gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,LTEgydF4y2Ba4gydF4y2Ba氯化氨甲酰胆碱。后者的结果表明,急性TRPV4调制不从根本上改变人类支气管的收缩效果。gydF4y2Ba
小鼠或大鼠静脉注射GSK1016790管理是非常致命的,因为失败的循环衰竭导致的肺泡间隔障碍(gydF4y2BaWillette et al ., 2008gydF4y2Ba)。这个响应的快速而深刻的自然排除了调查机制TRPV4活动可能调节软骨气道功能在这些物种。此外,cysLTs不收缩小鼠和大鼠的航空公司(gydF4y2Baet al ., 1999年举行gydF4y2Ba)。因此,尽管TRPV4激活明显有毒多个远端肺的哺乳动物的物种,软骨航空通道活动可能导致更广泛的有害的影响在人类航空公司比啮齿动物。在这方面,我们的数据的扩展和补充gydF4y2Ba李et al。(2011)gydF4y2Ba表明,柴油废气可以刺激TRPV4在人工气道上皮细胞,导致分泌的矩阵metalloprotease酶参与病理组织重构没有鼠标直接同源。gydF4y2Ba
虽然这些数据不支持角色TRPV4直接和急性人类气管平滑肌的收缩,他们不排除这种可能性,TRPV4可能引起CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba涌入人类气管平滑肌细胞在病理结果重构(例如,增殖和/或释放炎症介质)而不是收缩。这一点,而TRPV4和衣架式CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba渠道引起胞质钙gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba海拔在肺内皮细胞(gydF4y2Ba吴et al ., 2009gydF4y2Ba),下游反应触发功能隔离,因为TRPV4-dependent CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba流入血管渗透性增加,而衣架式CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Bachannel-dependent途径导致upregulation P-selectin粘附分子(gydF4y2Ba吴et al ., 2009gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
观察,人类航空TRPV4-dependent收缩是cysLT依赖是意想不到的,都基于前面讨论的证据TRPV4函数在气管平滑肌和没有任何发表TRPV4和LT生产之间的联系。这些实验中产生的cysLTs的细胞来源尚未阐明。人工气道上皮细胞(gydF4y2Ba詹姆et al ., 2007gydF4y2Ba)和成纤维细胞(gydF4y2Ba詹姆斯et al ., 2006gydF4y2Ba)可以通过5-LO cysLTs生产活动。上皮似乎并不影响这种反应,因为在豚鼠气道上皮细胞机械剥蚀的准备,然而豚鼠气道收缩的大小,以应对GSK1016790是相同的人类。尽管小鼠肺泡巨噬细胞表达TRPV4 (gydF4y2BaHamanaka et al ., 2010gydF4y2Ba)和我们的数据证实,人类平衡细胞,呼吸道巨噬细胞被发现主要在越远端空域摄取物质不被咳嗽的物理路线和黏膜纤毛的自动扶梯。此外,嗜酸性粒细胞和证据的存在的函数是稀疏nonasthmatic航空公司。我们目前支持的假设肥大细胞位于附近的支气管平滑肌cysLTs的来源。腺苷是支气管的刺激肥大细胞并导致人类支气管收缩与GSK1016790类似于我们所观察到的现象;在这两种情况下,反应在很大程度上抑制cystLT1受体的拮抗剂(gydF4y2BaBjorck et al ., 1992gydF4y2Ba)。抗原或支气管ige刺激肥大细胞也会对支气管平滑肌通过cysLT(和组胺)端依赖机制(gydF4y2Ba埃利斯et al ., 1994gydF4y2Ba)。然而,我们观察到的支气管收缩反应中没有相关ige和GSK1016790。gydF4y2Ba
总之,我们的数据表明,一个强有力的和选择性的化学活化剂TRPV4原因健壮的人类航空公司通过一个完全的收缩cysLT-dependent机制。我们提供进一步的支持,TRPV4离子通道活动负责这种效应,证明收缩引起的非选择性TRPV GSK1016790不仅废除的通道阻滞剂钌红还TRPV4-selective阻滞剂GSK2334775的小说。这些数据提供了第一个cysLTs TRPV4激活和生产之间的联系和提供小说了解TRPV4可能导致气流限制,人类呼吸道疾病病理炎症,可回复。此外,这些数据识别GSK2334775作为新颖的化合物可以使调查TRPV4药理学的人体组织,并可能作为未来疗法针对TRPV4模板。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者感谢史蒂夫Kelsen天普大学落下帷幕的样本进行支气管镜检查程序和获取人类志愿者。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
参与研究设计:gydF4y2BaMcAlexander Undem。gydF4y2Ba
进行实验:gydF4y2BaLuttmann Hunsberger。gydF4y2Ba
执行数据分析:gydF4y2BaLuttmann Hunsberger。gydF4y2Ba
或导致写作手稿中写道:gydF4y2BaMcAlexander Undem。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2013年10月4日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2014年2月4日。gydF4y2Ba
这项研究是支持的gydF4y2Ba美国国立卫生研究院的gydF4y2Ba国家心脏、肺和血液研究所(格兰特gydF4y2Ba5 r01-hl062296gydF4y2Ba];葛兰素史克制药。gydF4y2Ba
缩写gydF4y2Ba
- 5-lipoxygenasegydF4y2Ba
- 5-LOgydF4y2Ba
- 落下帷幕gydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
- 考克斯gydF4y2Ba
- 环氧合酶gydF4y2Ba
- cysLTgydF4y2Ba
- 半胱氨酰白三烯gydF4y2Ba
- GSK1016790gydF4y2Ba
- NgydF4y2Ba- ((1gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)1 - {[4 - ((2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)2 - {((2,4-dichlorophenyl)磺酰)氨基}3-hydroxypropanoyl羰基)1-piperazinyl]} 1-benzothiophene-2-carboxamide 3-methylbutyl)gydF4y2Ba
- 葛兰素史克公司2193874gydF4y2Ba
- 7-bromo -gydF4y2BaNgydF4y2Ba——(1-phenylcyclopropyl) 3 - [(4-piperidin-1-ylpiperidin-1-yl)甲基]2 - [3 - (trifluoromethyl)苯基]quinoline-4-carboxamidegydF4y2Ba
- GSK2334775gydF4y2Ba
- (gydF4y2BaRgydF4y2Ba(6)- methylsulfonyl 3 - (4 - (pyrrolidin-1-yl) piperindin-1-yl)甲基)-gydF4y2BaNgydF4y2Ba- (2,2,2,-trifluoro-1-phenylethyl) 2 - (3 - (trifluoromethyl)苯基)quinoline-4-carboxamidegydF4y2Ba
- ici - 198615gydF4y2Ba
- [1 - [[2-methoxygydF4y2BargydF4y2Ba羰基- [[(phenylsulfonyl)氨基]]苯基)甲基)1gydF4y2BaHgydF4y2Ba-indazol-6-yl]氨基甲酸环戊基酯gydF4y2Ba
- LTgydF4y2Ba
- 白三烯gydF4y2Ba
- 国家卫生研究院gydF4y2Ba
- 美国国立卫生研究院的gydF4y2Ba
- SK&F 104353gydF4y2Ba
- 2 (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)-hydroxy-3 (gydF4y2BaRgydF4y2Ba)- ((2-carboxyethyl)含硫的)3 - [2 - (8-phenyloctyl) pheny l]丙酸gydF4y2Ba
- TRPVgydF4y2Ba
- 瞬时受体电位香草酸gydF4y2Ba
- 版权©2014年药理学和实验治疗的美国社会gydF4y2Ba