文摘gydF4y2Ba
激活毒蕈碱的亚型3 (M3)毒蕈碱的胆碱能受体(mAChRs)增加气道的语气,而其封锁改善肺功能和肺部疾病患者的生活质量。本研究评估小说mAChR拮抗剂的药理性质,GSK573719(4 -(羟基(二苯)甲基]1 - {2 - [(phenylmethyl)氧]乙基}1-azoniabicyclo[2.2.2]辛烷;umeclidinium)。亲和力(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)的GSK573719克隆人类M1-M5 mAChRs范围从0.05到0.16纳米。解离的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719 M3 mAChR是低于的M2 mAChR[半衰期(tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba分别)值:82和9分钟)。中国仓鼠卵巢细胞转染重组人类M3 mAChRs GSK573719证明picomolar效力(日志pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 23.9 pM)在一个乙酰胆碱(Ach)介导的CagydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba动员化验。量效曲线表明竞争对抗药物冲刷后部分可逆性。使用孤立的人类支气管,GSK573719也是有效的,显示竞争对抗(日志pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 316点)与氯化氨甲酰胆碱,慢慢可逆浓度的方式(1 - 100 nM)。时间恢复收缩50% 10 nM约为381分钟(tiotropium溴和413分钟)。在小鼠中,EDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba值为0.02gydF4y2BaμgydF4y2Bag /鼠标鼻内。在有意识的豚鼠气管内的管理GSK573719剂量依赖性Ach-induced阻塞支气管狭窄的长期行动,并与tiotropium;2.5gydF4y2BaμgydF4y2Bag引起50% bronchoprotection > 24小时。因此,GSK573719是一种有效的抗胆碱能剂,演示了减缓功能可逆性人类M3 mAChR和长期的行动在动物模型。这个药理概要文件翻译成一个24小时期间bronchodilation体内,建议umeclidinium将每日一吸入肺部疾病的治疗。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
肺部疾病,如慢性阻塞性肺疾病(COPD)仍然是一个残疾和死亡的主要原因,而导致全球卫生负担。慢性阻塞性肺病的主要表现是这些患者无法实现充分氧化的肺外组织。大气中的氧气输送到肺泡空间交换血液可以通过扩张气道辅助使用药物。这些化合物被设计成块的活动毒蕈碱的胆碱能受体,尤其是毒蕈碱的亚型3 (M3)毒蕈碱的胆碱能受体(mAChR),这是对气管平滑肌高度表达。gydF4y2Ba
维护支持口径气管树的副交感神经纤维内迷走神经。副交感神经节与大航空公司与相关神经节后纤维支配较小直径细支气管,主要是负责建立阻力的气流从大气中气体交换单元(审查,请参考gydF4y2Ba罐装和费舍尔,2001年gydF4y2Ba)。迷走神经切断术或阿托品导致bronchodilation管理局在动物和人类身上,这表明副交感神经tonically活跃,并能提供一个持久的阻塞(gydF4y2Ba罐装和Undem, 1994年gydF4y2Ba)。两副交感胆碱能神经输出和nonadrenergic noncholinergic纤维气管平滑肌收缩活动的影响。交感神经纤维不直接刺激活动这些效应细胞,尽管gydF4y2BaβgydF4y2Ba肾上腺素能受体是位于质膜内。传播的副交感神经冲动气道平滑肌细胞和顺向收缩发生通过乙酰胆碱的释放(Ach)和绑定M3 mAChR。五mAChRs, M2受体是最丰富的气管平滑肌细胞,因此其行动反对gydF4y2BaβgydF4y2Ba肾上腺素能receptor-induced放松(gydF4y2BaEglen et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2Ba库尔森和油炸锅,2003gydF4y2Ba)。调制释放Ach也是影响M2 mAChRs位于prejunctional纤维,表现出了抑制的影响。激活的M3 mAChR Ach启动信号的级联事件与G蛋白(《Gq》)、肌醇三磷酸和磷酸肌醇磷脂酶C由此增加细胞内钙和增强(见例如气管平滑肌收缩gydF4y2BaChilvers Nahorski, 1990gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
支气管扩张剂治疗已成为主要控制症状带来的副交感神经活动增强,bronchoconstrictive肺COPD和哮喘等疾病的患者(gydF4y2BaCazzola et al ., 2012gydF4y2Ba)。gydF4y2BaβgydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂和黄嘌呤可用多年这些疾病的症状缓解。最近,antimuscarinic胆碱能拮抗剂一直寻找疾病的管理维护呼吸道口径足够的气体交换(gydF4y2BaBusch-Petersen莱恩,2011gydF4y2Ba)。促进坚持治疗,这些代理的长期行动更可取的,并避免这些药物的系统性影响,化合物的吸入这些患者受益。本研究进行的临床前药理学特征4 -(羟基(二苯)甲基]1 - {2 - [(phenylmethyl)氧]乙基}1-azoniabicyclo[2.2.2]辛烷(GSK573719;世界卫生组织和美国采用Name-approved术语umeclidinium),一个强有力的mAChR拮抗剂是设计用于通过吸入路线每天一次。尽管这种化合物是pan-active药效基因的每个5毒蕈碱的受体,这些数据是,在大多数情况下,来自功能分析系统描绘M3 mAChR反应。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
mAChR绑定。gydF4y2Ba
研究采用膜是准备从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞稳定表达人类M1-M5 mAChRs。克隆,不同的表情,和扩大增长的CHO细胞转染mAChRs进行根据先前的方法(gydF4y2BaAllard et al ., 1987gydF4y2Ba;gydF4y2Ba佩拉尔塔et al ., 1987gydF4y2Ba;gydF4y2Ba邦纳et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2Ba查普曼和布朗,1990年gydF4y2Ba)。融合的细胞生长37°C湿润孵化器加油公司为5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ 95%啊gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。M2和M4 mAChRs coexpressed嵌合G蛋白,Gqi5 (gydF4y2Ba董et al ., 1995gydF4y2Ba)。CHO细胞包含M1、M3或M5 mAChR是α最低基本培养基培养(MEM) (Gibco,绿色岛,纽约)与核苷、谷酰胺,和10%的胎牛血清,而这些表达M2和M4 mAChRs杜尔贝科的修改鹰的培养基培养营养混合物F12媒体(Gibco)补充200 mg / l G418 (Geneticin)和10%胎牛血清。膜是由离心(1000gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟4°C)和洗涤细胞颗粒与磷酸盐快速冻结使用液态N紧随其后gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和存储在−80°C (gydF4y2BaRominger et al ., 2009gydF4y2Ba)。冻丸解冻,resuspended在寒冷的低渗的介质(40毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5;1毫米MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba;0.5毫米EDTA;1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物;2.5 mg / l亮抑酶肽;0.1毫克/毫升抑肽酶),孵化冰面上5分钟。悬架是均质,离心机(2000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C)×6分钟,颗粒resuspended。这个过程重复两次,离心收集上层清液(100000gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C×60分钟)。后再悬浮的颗粒,能整除的是储存在−80°C到实验的日子。蛋白质浓度是量化使用Bio-Rad试验(大力神,CA)。gydF4y2Ba
配体结合化验和GSK573719 [gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba甲基东莨菪碱(0.5海里)进行使用闪烁间接测定M1, M2, M3 mAChRs和M4、M5 mAChRs过滤试验。闪烁接近试验测定,膜与麦芽凝集素孵化珠子在50 mM消息灵通的缓冲区,在4°C pH值7.4,30分钟,然后用放射性配体在96 - OptiPlate (PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)在室温下2小时的汽车(1%二甲亚砜(DMSO)]或GSK573719(0.01 -300海里)。最后孵化,盘子离心机(贝克曼CS-6R;贝克曼库尔特、沥青、钙;5分钟,享年2000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba)和放射性计数(最高计数模型A9912;帕卡德,梅里登,CT)。膜过滤试验,(M4、M5)也在消息灵通的缓冲区包含放射性配体在室温下2小时的汽车(1% DMSO)或GSK573719(0.03 -300海里)。阿托品作为参考代理。反应被终止快速过滤(Brandel细胞收割机;Brandel马里兰州盖瑟斯堡)通过GF / C过滤器(玻璃微纤维粘结剂1.2免费gydF4y2BaμgydF4y2Ba;绘画纸,英国肯特郡)。膜是用冰冷的50 mM玫瑰和转移到闪烁瓶。放射性计数在闪烁计数器(贝克曼模型LS6500)。反应被终止快速过滤如前所述。从三个独立实验获得的数据。特定的绑定是由减去特异性的绑定(使用0.3gydF4y2BaμgydF4y2Ba阿托品)从总绑定。抑制常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2BaGSK573719)是根据计算gydF4y2Ba程和Prusoff (1973)gydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba=集成电路gydF4y2Ba50 /gydF4y2Ba[L] /gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba+ 1;gydF4y2BaKgydF4y2BadgydF4y2Ba= 0.17,0.28,0.16,0.07,和0.2 nM M1-M5 mAChRs,分别和[L]测定放射性配体的浓度。膜含有M3 mAChRs也孵化2小时在室温下与浓度增加(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba甲基东莨菪碱(0.08 - -9.24海里)的存在与否GSK573719(0.2 - -0.5海里)在50 mM玫瑰,pH值7.4。非特异性结合决心使用10gydF4y2BaμgydF4y2BaM阿托品。饱和度数据被转换为一个scatchard情节进行分析。gydF4y2Ba
动态测量的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719或[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium膜碎片CHO细胞稳定表达人类M2和M3 mAChRs准备如前所述(gydF4y2Ba松弛et al ., 2011gydF4y2Ba)。碎片被放置在96 -深孔板保持在37°C中包含50 mM消息灵通的缓冲区,pH值为7.4,与gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719, [gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium,或车辆(2% DMSO)和10gydF4y2BaμgydF4y2BaM阿托品为特异性的绑定和特定的绑定。不同的潜伏期后,绑定被快速真空过滤终止(Brandel)。滤液收集GF / 1.0 B(玻璃微纤维粘结剂免费gydF4y2BaμgydF4y2Ba绘画纸,肯特,英国)过滤器文件事先在0.3% v / v表面,与冰冷的介质洗了三次,过滤器被转移到瓶包含Ultima-Flo M (PerkinElmer, Beaconsfield,英国)和分析使用TR LS 2900 TriCarb计数器(PerkinElmer)。特定绑定的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719或[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium没有发现在细胞缺乏毒蕈碱的受体(未发表的数据)。饱和绑定的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719(0.01∼-2.4海里)或(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium(0.01∼-2.9海里)M2和M3 mAChRs孵化24小时后确定。协会的比率(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719(0.02∼-0.43海里)或(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium(0.02∼-0.38海里)mAChRs测量使用孵化时间1小时。利率的离解放射性配体([gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719∼0.1 nM或(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium∼0.2 nM)测定膜1小时孵化后,稀释(1:20)中包含10µM阿托品和培养不同时间过滤前24小时。平衡离解常数(gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba)、受体的总数(gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba),协会率(gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba)和离解率(gydF4y2BakgydF4y2Ba从gydF4y2Ba)计算使用商用软件(Prism 5.0;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。one-affinity站点模型被用来确定gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba值。全球协会绑定数据安装在一个关联动力学模型gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba值,而离解one-dissociation模型绑定数据拟合gydF4y2BakgydF4y2Ba从gydF4y2Ba价值观和离解半衰期(t的估计gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba)。gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba值也被计算出gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba和gydF4y2BakgydF4y2Ba从gydF4y2Ba值使用方程gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba=gydF4y2BakgydF4y2Ba从gydF4y2Ba/gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
效能的测量GSK573719受体或网站除了mAChRs由CEREP实验室(法国普瓦捷)。gydF4y2Ba
在CHO细胞钙动员。gydF4y2Ba
功能Ach-mediated拮抗钙瞬变通过人类M1, M2, M3乙酰胆碱受体进行了使用微量滴定plate-based荧光成像板读者(FLIPR)试验(分子器件、桑尼维尔CA) (gydF4y2Ba施罗德Neagle, 1996gydF4y2Ba)。CHO细胞被放置在96 -孔板(40000个细胞/;Packard) 24小时,然后中取代了鹰的最小包含伯爵盐的重要媒介,gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,0.1%牛血清白蛋白(σ- 788;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),4gydF4y2BaμgydF4y2BaM Fluo-4-acetoxymethyl酯荧光指示剂染料(Fluo-4点;分子探针,宏伟的岛,纽约),2.5毫米丙磺舒1小时在37°C。这中被一个类似1 -取代染料和0.1%明胶代替白蛋白。10分钟后,这些细胞被洗(3×)Krebs-Ringer-Henseleit缓冲区:氯化钠(120毫米),氯化钾(4.6毫米),KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(1.0毫米),NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba(25毫米),CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(1.0毫米),MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(1.1毫米)、葡萄糖(11毫米),玫瑰(20 mM), pH值7.4,加上0.1%明胶丙磺舒和2.5毫米。细胞反应Ach拮抗剂存在与否的监控(FLIPR激发= 488海里,发射= 516海里)。每秒钟数据获得和分析使用商用软件(Prism 5.0, GraphPad软件)。力量和受体相互作用模式是由经典席尔德分析(gydF4y2Ba席尔德1949gydF4y2Ba使用电子商务的计算)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba(half-maximal钙响应)或pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值,爸爸gydF4y2Ba2gydF4y2Ba=日志(DR-1)日志[B];博士的剂量比定义为比equiactive浓度(ECgydF4y2Ba50gydF4y2Ba受体激动剂)的拮抗物的存在与否,和(B)拮抗剂的浓度。gydF4y2Ba
评估的复苏Ach-mediated钙反应在CHO细胞包含M3 mAChRs暴露在对手后,细胞治疗只有拮抗剂或暴露于复合,然后洗(3×30分钟间隔)Krebs-Ringer-Henseleit移除。后者的细胞被暴露于Ach测定残余agonist-mediated抑制性反应增加细胞内钙。对手曝光时间是30分钟在所有情况下,而间隙的持续时间是180分钟;tiotropium例外是(90分钟在大多数实验和180分钟在一次实验中,与类似的结果)。gydF4y2Ba
孤立的气道反应。gydF4y2Ba
人类肺器官捐赠者(五个男性,两个女性)从国家获得疾病研究交换(费城,PA)。人类生物样本的道德,他们的研究使用符合知情同意的条款。部分支气管肺癌和清洁的被附着软组织。支气管条(配对;3 - 4毫米宽)暂停(静息张力= 1.5 g)在10毫升水套器官浴(37°C)由Krebs-Henseleit含有氯化钠溶液(113.0毫米),氯化钾(4.8毫米),CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(2.5毫米),KHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(1.2毫米),MgSOgydF4y2Ba4gydF4y2Ba(1.2毫米),NaHCOgydF4y2Ba3gydF4y2Ba(25.0毫米)和葡萄糖(11.0毫米)加油O为95%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:5%的公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba力-位移传感器和连接到草FT03C(草仪器公司,昆西,MA)。Meclofenamic酸(1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)被添加到块内生环氧酶的活动。等距反应记录使用商用数据采集系统(MP100WS /承认;BIOPAC系统、Goleta CA)界面的Macintosh G4电脑(苹果,库比蒂诺,CA)。小时后平衡期,肺组织萎缩课时(1毫米),直到达到持续响应检查组织生存能力。平均Ach-induced增加张力为0.84±0.09 g (gydF4y2BangydF4y2Ba= 33)。配对组织每隔15分钟然后冲洗重建基线基调。组织被暴露于mAChR拮抗剂或车辆120分钟之前累积的卡巴可获得量效曲线(crc) (gydF4y2BaVan Rossum 1963gydF4y2Ba;gydF4y2BaMuccitelli et al ., 2000gydF4y2Ba)。在没有对手的情况下,平均累积张力达到1.58±0.14克(gydF4y2BangydF4y2Ba= 33)与治疗组间无显著差异。Agonist-induced反应表示为一个百分比的应对参考兴奋剂,组胺(1毫米),实验结束时获得的。意思是压电陶瓷gydF4y2Ba50gydF4y2Ba和几何平均电子商务gydF4y2Ba50gydF4y2Ba从非线性回归分析(计算的值gydF4y2BaMotulsky Christopoulos, 2003gydF4y2Ba)。在适当的时候,对手的力量值被表示为pKgydF4y2BaBgydF4y2Ba和爸爸gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(gydF4y2BaArunlakshana席尔德,1959gydF4y2Ba),pKgydF4y2BaBgydF4y2Ba日志(对手)/ X =−−1, X受体激动剂浓度的比例是需要引起50%的最大收缩拮抗剂的存在与缺失,和pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba=−拮抗剂离解常数的日志。分析考评的gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值实现了使用全局拟合的数据(gydF4y2BaMotulsky Christopoulos, 2003gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
在不同的实验中,人类支气管条也悬浮在过冷室(gydF4y2Ba科尔曼和Nials, 1989年gydF4y2Ba;哈佛装置,Inc ., Holliston马;连接到BIOPAC TSD125C传感器)。然而,这些组织都不断过冷(2毫升/分钟)与Krebs-Henseleit解决方案在整个实验过程中,当受体激动剂和拮抗剂注入通过22码(0.02毫升/分钟)针插入到superfusate接触到组织中。一小时后平衡期,组织不断暴露于碳酰胆碱(1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),直到这项研究的结论,参考数据收集。到达持续收缩,异丙肾上腺素(10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)是引用最大放松管理,停下来让恢复carbachol-induced张力。毒蕈碱的对手被注入一个浓度/组织,直到达到持续放松,大约6个小时,以确保平衡状态在对手浓度越低,和组织的药物冲洗10小时。这时,卡巴可注入了允许恢复基底,然后获得了碳酰胆碱CRC,紧随其后的是一个1毫米histamine-induced参考收缩。gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba显示了在这些研究中使用的实验范式测量时间生产的50%的最大放松mAChR对手的存在,称为tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba,清除的药物,即。,their ex vivo duration of effect or the offset half-time of tension recovery (OFF t1/2gydF4y2Ba)。在额外的实验中,气管被撤雄性豚鼠(450 - 650 g, Dunkin-Hartley;查尔斯河,搬运,MI)。上皮细胞被免职,气管条软骨环(2)准备类似的评估。gydF4y2Ba
气道力学。gydF4y2Ba
小鼠经预处理(50gydF4y2BaμgydF4y2Bal /鼠标)与车辆(0.9%生理盐水)或GSK573719间隔-48小时(0.25)之前醋甲胆碱的挑战,并放在个体体积描记器室(Buxco电子、特洛伊、纽约)。新鲜空气是由偏差流泵室。后基线呼吸(增强暂停(金边))值收集,老鼠收到醋甲胆碱(30毫克/毫升或ECgydF4y2Ba80年gydF4y2Ba)通过气溶胶交付(流= 1.6 ml / min×2分钟;DeVilbiss模型5500 d, Utrasonic喷雾器;DeVilbiss,萨默塞特郡PA)。平均金边就5分钟计算。金边=[(呼气时间/弛豫时间)−1)×(最大呼气流量/峰值吸气流),所需的时间和放松时间是70%的潮汐卷到期。在某些情况下,动物们在多个治疗,连续几天如图传说中描述。数据被表示为均值±S.E.M.金边的抑制百分比或车辆治疗组−金边(意思是金边的值为每个药物治疗动物)除以(意思是金边的车辆的价值治疗组)×100%。数据分析使用商用软件(GraphPad Prism 3.0)。gydF4y2Ba
在几内亚猪(600 - 800克),mAChR拮抗剂或车辆(0.5%渐变;Sigma-Aldrich)被安装(200气管内的管理gydF4y2BaμgydF4y2Baisofluorane l)麻醉(5%)。动物被reanesthetized(氯胺酮90毫克/公斤,甲苯噻嗪15毫克/公斤肌肉)4小时后的管子颈静脉,颈动脉,和气管给药,血压记录和通风的动物(H = 8厘米的压力gydF4y2Ba2gydF4y2Ba啊,60次/分钟;模型683;哈佛装置,南纳蒂克,MA)。琥珀酰胆碱是管理(2.0毫克/公斤增长值)麻痹的动物。在整个实验中测量电阻和动态合规(gydF4y2BaPalecek 1969gydF4y2Ba;gydF4y2Ba钻石和O ' donnell, 1977年gydF4y2Ba)。一旦动物稳定,空调采暖(10 - 100gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/公斤增长值)管理。替代研究使用全身体积描记法(Buxco XA;Buxco电子)测定金边作为气道阻塞的指标(gydF4y2BaHamelmann et al ., 1997gydF4y2Ba)。在这些研究中,动物暴露在空调采暖的气溶胶(3.5毫克/毫升,流= 0.6 ml / min×36秒后两分钟干燥时间;DeVilbiss Pulmosonic 5000 d;DeVilbiss)。收集数据(金边)10分钟Ach曝光后,曲线下的面积计算。gydF4y2Ba
统计分析。gydF4y2Ba
数据提出了意味着±S.E.M.统计差异分析使用方差分析或学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试使用商用软件(GraphPad棱镜),建立在最低水平的意义gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
动物。gydF4y2Ba
所有研究都是根据葛兰素史克公司开展的政策照顾,综述了实验动物的福利和待遇,由葛兰素史克动物保健和使用委员会制度设施工作。通用汽车的同龄雄性BALB / c小鼠(第23 - 25;查尔斯河实验室繁殖)和豚鼠(Dunkin-Hartley;查尔斯河实验室繁殖)被允许免费获取食物和水。gydF4y2Ba
化学物质。gydF4y2Ba
mAChR拮抗剂GSK573719 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)制备水晶溴盐。这种化合物和其他毒蕈碱的拮抗剂,如ipratropium和tiotropium(化学结构,请参阅gydF4y2Ba巴恩斯2001gydF4y2Ba葛兰素史克的),在实验室合成。放射性配体结合动力学,化学物质都是购自Sigma-Aldrich有限公司(吉林厄姆,英国),除非另有说明。(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719和[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium(分别比活度43和82 Ci /毫米)被商合成生物学研究(放射化学)有限公司(英国卡迪夫)。莨菪碱氯甲烷((-)- (gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)3-hydroxy-2-phenylpropionic酸(1gydF4y2BaRgydF4y2Ba,2gydF4y2BaRgydF4y2Ba4gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba7gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba,9gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)9-methyl-9 -[甲基-gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] 3-oxa-9-azatricyclo [3.3.1.0gydF4y2Ba2、4gydF4y2Ba]non-7-yl酯氯],从PerkinElmer购买。CHO细胞从美国购买类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。鹰的MEM和αMEM从Gibco BRL购买(大岛,纽约)。所有其他试剂购买商业来源。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
体外受体结合的研究。gydF4y2Ba
绑定关联值(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)GSK573719获得使用膜准备从CHO细胞稳定表达个人五个人类mAChRs显示在重组gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。值(点和对应的负对数值pgydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba)获得了在稳态条件下使用(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methyl-scopolamine作为配体竞争如下:M1 = 159 (9.8), M2 = 151 (9.8), M3 = 62 (10.2), M4 = 50(10.3),和M5 = 131 (9.9)。饱和绑定的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methyl-scopolamine M3受体转移向右的浓度增加GSK573719没有结合位点的最大数量的变化(gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba= 5.75 pmol /毫升)。离解常数,gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba,增加GSK573719的增量变化。gydF4y2Ba
额外的饱和度,协会和离解绑定研究进行使用(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba[H] GSK573719,比较gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium,确定在M2和M3 mAChRs受体结合动力学。值[平衡离解常数(gydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2Ba受体(总数)gydF4y2BaBgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)协会率(gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba)和离解率(gydF4y2BakgydF4y2Ba从gydF4y2Ba)所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。数据表明,协会是快速的在每个受体化合物类型。(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719 M3 mAChR分离较慢,大约8倍,比从M2 mAChR(分别为82和9分钟)。这种差异在离解受体亚型之间还发现(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium,尽管时间受体入住率达到50%,tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba,超过GSK573719。值得注意的是发现(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719 M2 mAChR分离更容易(约4倍)比(gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium。亲和力值,pgydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2BaM3和M2 mAChRs在这些饱和度研究显示稍微更广泛的分离gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719比[(10.5和9.8)gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium(10.7和10.3)。gydF4y2Ba
选择性评价GSK573719使用标准化的受体和通道表明它不太可能产生生物效应与乙酰胆碱或mAChR活动无关。亲和力值(gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba),这些蛋白质与最狂热的绑定是69和220海里gydF4y2BaκgydF4y2Ba和gydF4y2BaσgydF4y2Baopiod受体,分别;l型钙+ +频道330海里;网站2 Na +频道170海里;和多巴胺转运体780海里。293年人类胚胎肾细胞,GSK573719抑制人类ether-a-go-go-related基因频道当前浓度的方式(IC的尾巴gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 9.4gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)。gydF4y2Ba
体外功能研究。gydF4y2Ba
功能性GSK573719药理作用的体外评价使用两个系统:首先,通过监测钙通量与人类重组CHO细胞转染mAChRs(和G-coupled蛋白质)和刺激,其次,通过测量气道收缩反应条隔绝人类支气管或豚鼠气管。gydF4y2Ba
细胞内含有人类重组M3 mAChR CRC得到Ach转移向右的GSK573719 (1 - 1000 nM)浓度的方式(见gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。最大的响应被对手的存在最低限度的影响。力量所描述的pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba价值是在点范围M1-M3 mAChRs (9.6 - -10.6;看到gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。席尔德分析表明边坡的团结一致的M3受体拮抗作用竞争类型mAChR(斜率= 0.96;看到gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)以及M1和M2 mAChRs(斜率= 0.83和0.93,分别;未公开的数据)。gydF4y2Ba
额外的细胞的影响研究表明,GSK573719 M3 mAChR-mediated活动慢慢可逆的。在gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,可以看出预处理细胞GSK573719(3.3 -330海里30分钟)向右位移的Ach CRC与获得以前,当随后广泛洗前180分钟Ach挑战,剩余浓度Ach-induced CRC仍明显右转。尽管如此,右转的数量明显不足,没有洗。ipratropium和tiotropium出现一种不同的模式。Ipratropium (0.1 - 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)抑制Ach-induced钙通量浓度的方式;然而,洗后基本上没有抑制剩余的细胞。细胞的初始接触tiotropium产生浓度(3.3 -330海里)向右转变与进步和显著抑制最大Ach响应。在高浓度的tiotropium(330海里),只有边际钙响应刺激的课时。右转的Ach CRC仍从细胞间隙后拮抗剂;然而,tiotropium导致的三个浓度相同大小的向右移动的CRC(仅相对于Ach),看似独立的药物浓度最初应用于细胞。此外,没有损失的最大响应后间隙。这些数据表明这三个毒蕈碱的受体拮抗剂显示后独立的药理作用在接触模式和间隙的化合物。gydF4y2Ba
GSK573719的药理作用也决定用孤立的更复杂的矩阵组织准备的人工气道(支气管条)在传统的静态组织浴。与前面描述的研究使用个人mAChRs CHO细胞,表达人类支气管组织包含毒蕈碱的受体的分布,M2和M3 mAChRs,发现在正常气道(gydF4y2Ba库尔森和油炸锅,2003gydF4y2Ba),尽管在给定的支气管树。因此,任何潜在的对手活动相互影响M2 mAChR或M3 mAChR会承担收缩活动。这些数据都与那些获得ipratropium相比,tiotropium,阿托品用成对支气管带切除来自同一个捐赠者(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。氯化氨甲酰胆碱(Cch),一个靠模仿,产生累积浓度增加紧张的开发(引用,获得1毫米组胺;绝对增加张力为1.59±0.14克)。收缩活动的变化是concentration-dependently被预孵化(120分钟)的组织与GSK573719 (1 - 100 nM),从而取代Cch-CRC向右以类似的方式。能力值,即,爸爸gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 9.5,表明sub-nM亲和力,只有适度抑制最大的反应。”只使用一个集中的阿托品(10海里),一个向右的Cch-CRC也发生转变,和大小相媲美,获得GSK573719的最低浓度(1纳米)。Ipratropium (1 - 100 nM)也改变了向右Cch-CRC (pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 9.2),但不影响最大Cch-induced收缩。在这种情况下,封锁了10 nM ipratropium相当于由10 nM阿托品。Tiotropium在低浓度(0.1 nM)对Cch-CRC的影响可以忽略不计,而收缩反应中间(1纳米)和高浓度(10 nM)相似,明显抑制最大Cch-induced紧张开发60%以上。gydF4y2Ba
这些后者研究扩展使用修改后的系统来确定功能出现对抗和紧张的恢复发展Cch根据不断删除GSK573719过冷的组织。”通过这种方式,行动的持续时间被外推估计半场的张力恢复(tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba紧张的情节发展和时间,这是与ipratropium和tiotropium相比gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba数据使用10 nM)和阿托品作为一个额外的引用(未发表的数据)。50%的最大放松的时间(称为tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba)GSK573719浓度,减少值作为对手的浓度增加。在1纳米,以tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba(平均±S.E.M.)是102±10分钟(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),而在10或100海里,它下降到43±5 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和20±2 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)分钟,分别。同样,在t浓度gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba值均获得ipratropium [19±1 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),14±3 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和6±0.4 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)分钟,分别]和tiotropium [24±2 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),10±1 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)和6±0.1 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)分钟,分别;10 nM阿托品= 20分钟,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2,配对组织,历史参考= 9±1分钟,gydF4y2BangydF4y2Ba= 17]。当这些组织免费洗GSK573719, tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba(与置信区间范围)浓度。在1纳米,tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba= 71分钟(25 - 170分钟;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)和恢复完全恢复,类似于阿托品。然而,在中、高浓度、张力恢复更长期(tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba= 381分钟(241 - > 600分钟;gydF4y2BangydF4y2Ba= 7)和> 600分钟(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),只有在10个小时返回到67%(平均源自这些组织在10小时恢复50%以上;一些组织没有达到这一水平)和6%,分别。相比之下,收缩张力基本上恢复在10小时所有ipratropium浓度(tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba(分钟)= 6(第4 - 9;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),63 (28 - 118;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和224年(143 - 310;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),分别)。Tiotropium缓慢恢复收缩张力(tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba(分钟)= 176 (62 - > 600;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3),434 (331 - > 600;gydF4y2BangydF4y2Ba分别= 7),> 600),并且有微不足道的复苏的紧张在100 nM 10小时后,约1% (10 nM OFFt阿托品gydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba= 55分钟,gydF4y2BangydF4y2Ba= 2;历史参考= 34分钟,距离= 23-49分钟,gydF4y2BangydF4y2Ba= 17)。最终协议后间隙的,组胺暴露了一个健壮的收缩,表明组织是可行的和响应nonmuscarinic机制。当tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba和tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba测量值(10 nM)在豚鼠气管条,平均的值(gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)如下:GSK573719 = 34, > 600分钟,ipratropium = 12和35分钟,分别和tiotropium = 9, > 600分钟。gydF4y2Ba
体内研究。gydF4y2Ba
管理完善,外生Ach(或模拟)产生一个健壮的支气管收缩,可以反驳毒蕈碱的拮抗剂。GSK573719评估在小鼠模型的药效学活性的乙酰甲胆碱(Mch)全身的支气管收缩使用标准体积描记器(金边担任代理测量气道语气的变化)。当鼻内接种作为一个解决方案,GSK573719阻塞喷雾醋甲胆碱(30毫克/毫升或EDgydF4y2Ba80年gydF4y2Ba值最大剂量依赖性的方式(ED支气管收缩)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.02gydF4y2BaμgydF4y2Bag /鼠标滴注法测量5小时后)。后的抑制作用单一政府持续长时间的时间,例如,为0.05gydF4y2BaμgydF4y2Bag /鼠标,抑制约50%或更高达72小时(数据没有显示)。这种抑制持续,尽管在较低的水平,近7天。tiotropium均获得可比数据在同一剂量,虽然最大bronchodilatory效应发生早(5小时)比GSK573719剂量(24小时后)。当GSK573719给小鼠连续5天每天一次(0.025gydF4y2BaμgydF4y2Bag鼻内),抑制上面的第五天小幅增加后获得了一个政府相同的老鼠(60 35%,分别)。第五天的剂量后,老鼠额外休息5天,允许bronchomotor语气回到基线水平。第六天,老鼠收到最后一个剂量的拮抗剂和妇幼保健再次挑战。抑制水平基本上是一样的,找到的第一天测试,表明宽容与反复鼻内交付GSK573719尚不明显。相比之下,当GSK573719口服(2.0毫克/公斤)的老鼠在一个剂量的100倍gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值(鼻内),没有可观察到的保护一个妇幼保健挑战(监控24小时后剂量;未公开的数据)。gydF4y2Ba
在类似的研究中使用豚鼠而不是老鼠,气管内的盒子GSK573719(0.25、2.5和25gydF4y2BaμgydF4y2Bag /豚鼠)剂量依赖性了金边的增加引起雾化Ach (gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。抑制效果持续很长一段时间,和保护的持续时间每增加GSK573719所持续的时间更长。例如,封锁的级别对应于50%抑制维持超过2天为2.5gydF4y2BaμgydF4y2Bag /豚鼠,5天在25岁以上gydF4y2BaμgydF4y2Bag /豚鼠。然而,这些增量没有dose-proportional。GSK573719的抑制效应与时同tiotropium(动物有两个化合物为2.5gydF4y2BaμgydF4y2Bag /天竺鼠),研究结果类似(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。额外的研究中,麻醉豚鼠检测气道阻力和心率的测量表明,GSK573719(0.025、0.25和2.5gydF4y2BaμgydF4y2Bag)抑制了Ach-induced气道基调的增加存在剂量依赖的相关性(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。在最高剂量的Ach (100gydF4y2BaμgydF4y2Bag增长值),显著抑制,即。74.4%,gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,获得了4小时后滴剂为0.25gydF4y2BaμgydF4y2Bag / GSK573719豚鼠。使用tiotropium可比数据获得在同一剂量范围(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。完全封锁了动物接受高剂量时的代理。在这些动物中,剂量降低心率发生在每一个管理Ach车辆和三个药物治疗组。GSK573719滴注法没有与剂量相关的封锁Ach-induced一致降低心率(未发表的数据)。例如,平均心率下降没有对手是每分钟148±8次后政府100gydF4y2BaμgydF4y2Ba克,和高剂量的GSK573719 (2.5gydF4y2BaμgydF4y2Bag)、心率下降了每分钟136±14次。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究的目的是描述小说的药理作用吸入拮抗剂的毒蕈碱的胆碱能受体:GSK573719或umeclidinium。主要的发现表明GSK573719是强有力的,竞争力,pan-active mAChR拮抗剂的长期行动。药理作用是评估使用含有人类重组mAChRs或内源性的化验气道的居民在人类和动物模型。动物模型并不是设计来模拟人类肺部疾病;相反,他们解决疾病过程的某些特性,例如,mAChR-induced支气管狭窄(gydF4y2Ba罐装和周,2008年gydF4y2Ba)。在所有情况下,GSK573719强有力地阻止agonist-mediated事件的方式符合竞争类型的对抗。gydF4y2Ba
GSK573719强antagonist-receptor互动的良好反映在放射性配体结合研究亲和力值是人类mAChRs sub-nM范围为5。例如,pgydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba或pgydF4y2BaKgydF4y2BaDgydF4y2BaM3 mAChR值分别为10.2和10.5使用[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methyl-scopolamine或[gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719,分别。功能水平的体外药效得到当受体系统加上适当的蛋白和细胞内分子组装影响胞内钙信号的变化测量在CHO细胞和孤立的人类支气管。在前测定系统,所描述的效力pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值也是sub-nM (pAgydF4y2Ba2gydF4y2BaM3 mAChR = 10.6)。向右平行变化和适度的改变最大响应(浓度10海里)的Ach-induced增加细胞内钙拮抗剂的存在表明制定的竞争对抗。席尔德分析证实了此事,斜率本质上是统一的,例如,M3 mAChR = 0.963。颞FLIPR强加的限制技术,即。,the duration of the antagonist exposure (30 minutes) with the receptor was markedly greater than that for the agonist (peak Ach response occurs within 4–5 seconds in the absence of drug), may not have afforded an opportunity for equilibrium, especially at the higher concentrations of the antagonist. At the higher concentrations of GSK573719, there was partial suppression of the maximal response. The impact of incubation conditions and duration on pharmacological activity of long-acting muscarinic antagonists, such as tiotropium, has been brought out by previous investigations (Disse et al ., 1993gydF4y2Ba;gydF4y2BaCasarosa et al ., 2009gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2010年gydF4y2Ba)。这些研究者认为,这些药物的亲和力和最大mAChR-mediated效应可能被低估的孵化时间应该选择试验系统中的缩写。gydF4y2Ba
最大的部分抑制carbachol-induced收缩反应,尽管只有10 - 25%,也导致GSK573719接触时的孤立的人类支气管。在这种情况下,抑制无关的量添加到静态组织浴。然而,获得的力量符合其他体外系统,计算pAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba值为9.5。相比之下,简单的毒蕈碱的竞争对手阿托品对最大反应没有影响。Ipratropium阻塞紧张开发的方式类似于阿托品,equi-effective 10纳米。Tiotropium在这些研究中使用的最低有效浓度,即。,1n米,reduced the maximal response to about 30% of that produced by carbachol alone, and this pattern deviated little at the higher concentration (10 nM). The latter effects likely represent an allosteric modulation of the receptor conformation. These chemically distinct mAChR antagonists display quite varied responses, from competitive to noncompetitive, in complex human biologic systems. Taken together, the data suggest that the mode of antagonism provided by GSK573719 is competitive, although the possibility of insurmountable characteristics cannot be ruled out.
解离的gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719从人类重组M3 mAChR缓慢。时间的50% (gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] GSK573719仍然绑定到受体是82分钟。离解的M3 mAChR比从M2 mAChR缓慢发生,即。半衰期是9分钟。在我们的手中,gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] tiotropium也慢慢的从两个受体;然而,半衰期长,即。,273和39分钟。化合物都热切地绑定到每个受体不到一个日志不同绑定两个受体之间的亲和力。因此,力量本身不可能依据不同的受体离解。符合目前的发现,gydF4y2BaCasarosa et al。(2009)gydF4y2Ba报道,tiotropium相像更慢的M3比M2 mAChR mAChR;然而,半衰期是27岁,2.6小时,分别。虽然这两项研究使用人类受体在CHO细胞稳定表达,方法论的差异可能会影响实际值(例如,gydF4y2Ba3gydF4y2BaH] -gydF4y2BaNgydF4y2Ba-methyl-scopolamine竞争动力学研究中它被用来获得后者报告中的值,而不是比较经典的方法在目前的研究中使用)。这些作者还指出,在M3 mAChR停留时间超过,M2 mAChR其他对手,即。、ipratropium aclidinium, glycopyrolate。在这组化合物,ipratropium的半衰期是最短的。最近,gydF4y2Ba赛克斯et al。(2012)gydF4y2Ba建议“生理”试验条件,特别是孵化的钠离子浓度介质,可以显著减少M3 mAChR住宅乘以10倍之多,例如,tiotropium的半衰期从462分钟没有减少钠46分钟的钠。尽管如此,M3的趋势与M2 mAChR离解似乎是一个常见的这群药效团特征。gydF4y2Ba
洞察力有关antagonist-mAChR交互的机制提供了使用M2和M3 mAChRs配体晶体结构(gydF4y2Ba哈加et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba克鲁斯et al ., 2012gydF4y2Ba)。即使五mAChR亚型分为两个主要的类按照它们的选择性G proteins-M1, M3, M5相关的GgydF4y2Baq / 11gydF4y2Ba家庭和M2和M4 GgydF4y2Bai / ogydF4y2Ba类型的蛋白质(见,例如,gydF4y2Ba·考尔菲德,Birdsall 1998gydF4y2Ba)——显示高水平的序列同源性和整体结构相似的细胞内和细胞外蛋白(内循环gydF4y2Ba克鲁斯et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba哈加et al ., 2012gydF4y2Ba)。保护orthosteric绑定的口袋也存在在M亚型;然而,结构性差异M2和M3 mAChR可能在于三维结合位点的架构,和这个特性可能影响不同的分离率的各种各样的对手(gydF4y2Ba克鲁斯et al ., 2012gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba克鲁斯et al。(2012)gydF4y2Ba表明,随着tiotropium结合和M3 mAChR分离,它停在另一个,别构部位细胞外前庭。部分细胞外环(回路2)最近的绑定的M2 mAChR可能更多的移动,和tiotropium噻吩环的相互作用,从而促进其出口从orthosteric结合位点到细胞外前庭和克服最大的能量屏障绑定和离解的道路。没有额外的晶体信息对于其他M2和M3 mAChR-antagonist复合物,分裂的分子机制(s)仍有待完全理解,尽管这一领域的最新进展的药物设计。gydF4y2Ba
在目前的研究中,慢性受体离解GSK573719和持久的功能是一致的封锁中观察到其他体外试验系统。例如,大量洗完好的CHO细胞与antagonist-free媒体透露,封锁Ach-induced增加细胞内钙明显GSK573719和tiotropium ipratropium但不是。有趣的是,最大的抑制反应,观察前洗GSK573719或tiotropium没有明显的在这段“难治性”时期。此外,GSK573719,但不是tiotropium,耐火材料对抗是浓度水平,即Ach CRC,向右位移。这些配体(或比例)在多大程度上保持绑定到orthosteric或变构网站不能确定从目前的实验;然而,他们清楚地表明,反应由ipratropium展出,GSK573719, tiotropium在曝光和间隙是复杂的,提供一系列不同的receptor-ligand交互。gydF4y2Ba
不同恢复模式的对手也证实的恢复carbachol-induced孤立的人类支气管的收缩带后把化合物从过冷洗澡媒体。在这些研究中,低浓度的时间响应后间隙(1纳米)ipratropium或GSK573719阿托品后获得的近似,在这种情况下,有完整的恢复紧张开发(10 nM供参考;未公开的数据)。浓度(1 - 100 nM) ipratropium的紧张开发冲刷期间返回。另一方面,取消中间(10 nM),尤其是高(100海里)的浓度GSK573719和tiotropium继续抑制组织应对碳酰胆碱甚至在10个小时的间隙。这漫长的时间后两个化合物的抑制作用也明显当接种小鼠或豚鼠。gydF4y2Ba
与其同源受体,参与GSK573719 mAChRs位于气道,负责其药理作用在动物模型。毒蕈碱的受体填充的航空公司不同的物种,包括人类,并存在神经终端,气道平滑肌、血管内皮和粘膜下腺体(gydF4y2Ba库尔森和油炸锅,2003gydF4y2Ba)。尽管M2 mAChRs位于prejunctional神经终端,M2和M3 mAChRs是位于气管平滑肌细胞,这是M3 mAChR主导从副交感神经释放乙酰胆碱的作用。gydF4y2Ba费舍尔et al。(2004)gydF4y2Ba表明,在小鼠体内缺乏的M2 mAChR,迷走神经刺激或醋甲胆碱挑战产生增强支气管收缩的活动,而在那些缺乏M3 mAChR,支气管收缩被废除。GSK573719治疗预防支气管收缩在小鼠和豚鼠模型。给定的分离效能,虽然适度差异,和动能离解M2和M3 mAChRs之间的差异,也可以辩称,在动物模型中获得的bronchoprotection主要源于M3 mAChR的封锁。获得的力量值在老鼠模型中,即,艾德gydF4y2Ba50gydF4y2Ba= 0.02gydF4y2BaμgydF4y2Bag /鼠标,符合效能的水平获得体外使用重组人类受体和人类呼吸道的样本。一剂后的保护作用是长寿的动物,与同tiotropium,然而GSK573719并不似乎积聚在肺部和创建药物耐受后连续数天的管理。极少量的数据凸显了视图GSK573719必须保持气道通畅进行气体交换。这些动物模型模拟气道阻塞性事件,但并不等同于肺重塑发生几十年来在肺部疾病,如慢性阻塞性肺病患者。尽管如此,如果在人类疾病有一个推论bronchoprotection发现在这些动物模型,GSK573719应提供每天一次控制Ach-driven增强气道的语气在临床设置。gydF4y2Ba
最后,活动的M2 mAChR由封锁Ach-induced心率下降以豚鼠没有观察到在有效剂量范围内使用在目前的调查。应该注意,扩散复合的肺实质的大型等离子体体积的体循环稀释药物浓度几倍,从而减少任何潜在的M2 mAChR-mediated心脏的影响。改变心脏和肺迷走神经的基调被发现在许多病理生理条件,包括慢性阻塞性肺病。目前临床使用mAChR拮抗剂如tiotropium治疗这类患者在接受。在最近的COPD患者的临床研究,治疗GSK573719是耐受性良好,没有明显的治疗相关的生命体征的变化,包括脉搏率,显著改善肺功能(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,在一秒钟用力呼气量)剂量获得(gydF4y2BaDecramer et al ., 2013gydF4y2Ba)。目前调查的药理研究使用定义agonist-antagonist条件似乎在临床中发现一个必然的结果。因此,这些结果治疗的相关性。GSK573719可能作为一种长效的竞争对手提供bronchodilatory缓解肺部疾病,如慢性阻塞性肺病患者。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
参与研究设计:gydF4y2Ba缅甸人,DeHaas,鲑鱼,莱恩,施密特Sarau,干草,福利,松弛,巴雷特Palovich,巴克利,Luttmann,拉姆齐。gydF4y2Ba
进行实验:gydF4y2Ba缅甸语、DeHaas施密特,福利,松弛,巴雷特,巴克利,Luttmann,科孜,韦伯。gydF4y2Ba
了新试剂或分析工具:gydF4y2Ba莱恩,Palovich Luttmann。gydF4y2Ba
执行数据分析:gydF4y2Ba缅甸语、DeHaas施密特,福利,松弛,巴雷特,巴克利,Luttmann,科孜,韦伯,Palovich。gydF4y2Ba
写或导致了写作的手稿gydF4y2Ba:拉姆齐,鲑鱼,Palovich,巴雷特,松弛,Luttmann,韦伯。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2012年11月28日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2013年2月21日。gydF4y2Ba
缩写gydF4y2Ba
- 呵呀gydF4y2Ba
- 乙酰胆碱gydF4y2Ba
- CchgydF4y2Ba
- 氯化氨甲酰胆碱gydF4y2Ba
- 赵gydF4y2Ba
- 中国仓鼠卵巢gydF4y2Ba
- 慢性阻塞性肺病gydF4y2Ba
- 慢性阻塞性肺疾病gydF4y2Ba
- 儿童权利公约gydF4y2Ba
- 量效曲线gydF4y2Ba
- DMSO溶液gydF4y2Ba
- 二甲亚砜gydF4y2Ba
- FLIPRgydF4y2Ba
- 荧光成像板读者gydF4y2Ba
- GSK573719gydF4y2Ba
- 4 -羟基(二苯)甲基][1 - {2 - [(phenylmethyl)氧]乙基}1-azoniabicyclo[2.2.2]辛烷gydF4y2Ba
- M1-M5gydF4y2Ba
- 毒蕈碱的亚型1 - 5gydF4y2Ba
- mAChRgydF4y2Ba
- 毒蕈碱的乙酰胆碱受体gydF4y2Ba
- 妇幼保健gydF4y2Ba
- 醋甲胆碱gydF4y2Ba
- MEMgydF4y2Ba
- 最低必要的媒介gydF4y2Ba
- 在tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba
- 50%的最大放松的时间gydF4y2Ba
- 从tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba
- 抵消紧张复苏的半场gydF4y2Ba
- 在金边gydF4y2Ba
- 增强的暂停gydF4y2Ba
- tgydF4y2Ba1/2gydF4y2Ba
- 半衰期gydF4y2Ba
- 版权©2013年药理学和实验治疗的美国社会gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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