文摘
皮质类固醇不敏感是一个主要障碍的治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)和严重的哮喘。是由氧化应激引起的,导致减少了组蛋白deacetylase-2 (HDAC2)函数通过激活phosphoinositide-3-kinase-δ(PI3Kδ)。在高通量的三环抗抑郁药去甲替林已被确认屏幕作为代理,增加响应性类固醇激素。本研究的目的是确定的分子机制去甲替林增加皮质类固醇敏感。一种蛋白激酶的磷酸化,激活PI3K的足迹,和HDAC活性被西方墨点法和荧光活动分析评估U937单核细胞的细胞。皮质类固醇敏感性评价的抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)全身白介素8(引发)生产布地奈德。过氧化氢(H2O2)或香烟烟雾提取物(CSE)增加磷酸化水平的一种蛋白激酶(pAkt)和HDAC活性降低。预处理与去甲替林抑制pAkt CSE和H2O2以及恢复HDAC活性,减少了H2O2和CSE。此外,去甲替林抑制PI3Kδ活动,但没有影响PI3Kα和PI3Kγ亚型。虽然CSE布地奈德的影响减少TNFα-induced引发生产U937细胞,去甲替林逆转CSE-induced皮质类固醇不敏感。去甲替林恢复皮质类固醇敏感引起的氧化应激通过直接抑制corticosteroid-insensitive PI3Kδ和是一个潜在的治疗的疾病,如慢性阻塞性肺病和严重的哮喘。
介绍
糖皮质激素是最有效的治疗许多炎症和免疫疾病。然而,在慢性阻塞性肺病(COPD)患者和严重的哮喘和哮喘病人吸烟,糖皮质激素在很大程度上是无效的(巴恩斯和爱德考克,2009年)。皮质类固醇不敏感是一个巨大的管理问题,迫切需要新疗法治疗这些疾病。糖皮质激素的抗炎作用与糖皮质激素受体结合介导的(GRs)和随后的核易位。GR抑制促炎基因转录激活核factor-κB-associated通过抑制组蛋白乙酰化作用的直接压抑CREB-binding相关蛋白组蛋白乙酰转移酶的活动和招聘组蛋白脱乙酰酶2 (HDAC2)积极转录炎症基因的启动子(Ito et al ., 2006 a)。HDAC2表达和活动减少支气管活检,支气管肺泡灌洗巨噬细胞,和外围COPD患者肺组织获得,并减少与疾病严重程度Ito et al ., 2005)。HDAC2活动也被证明是减少一些严重的哮喘病患者和吸烟的哮喘患者(伊藤和达2009)。此外,击倒HDAC2表达式的支气管肺泡灌洗巨噬细胞诱导皮质类固醇不敏感,而HDAC2过度还原皮质类固醇函数(Ito et al ., 2006 b)。活性氧由香烟烟雾直接或间接来自香烟的炎症反应有明显影响HDAC2表达和功能和发展的关键因素之一皮质类固醇不敏感(Marwick et al ., 2007)。例如,HDAC2抑制转录后修饰,如硝化和氧化(巴恩斯2009与过氧化氢)治疗后(H2O2),peroxynitrate生成器3-morpholinosydnonimine (Osoata et al ., 2009),或者香烟(Adenuga et al ., 2009)。在这些研究中,预处理抗氧化剂,如NgydF4y2Ba乙酰半胱氨酸(NAC)及谷胱甘肽,防止翻译修饰和HDAC2下调(Adenuga et al ., 2009;Osoata et al ., 2009)。我们已经表明,氧化应激诱导磷酸化通过激活和失活HDAC2 phosphoinositide-3-kinase PI3K / Akt通路(et al ., 2010)。
去甲替林是一种第二代三环抗抑郁药,也被用于治疗尼古丁加法和COPD患者戒烟,也显示出明显改善某些呼吸道症状(Borson et al ., 1992)。大规模筛选已被用于识别药物表现出协同效应与糖皮质激素在肿瘤坏死因子α(TNFα)生产在外周血单核细胞(Lehar et al ., 2009)。去甲替林被确认为一种意外的药物增加强的松的抗炎效果。然而,去甲替林的影响尚未评估在临床模型,和去甲替林恢复皮质类固醇敏感的分子机制尚不清楚。本研究的目的是验证去甲替林能否恢复皮质类固醇敏感的体外模型皮质类固醇不敏感引起的活性氧和香烟烟雾和识别的分子机制。
材料和方法
细胞培养和刺激。
人类单核细胞的U937细胞维持在连续细胞培养在37°C和5%的股份有限公司21640年RPMI介质含10%胎牛血清谷氨酰胺和15毫米。为刺激H2O2(σ化学,普尔,多塞特郡,英国)或香烟烟雾提取物(CSE) U937细胞被播种(0.5×106细胞/毫升)使用饥饿中等RPMI 1640(无酚红)与1%胎牛血清和15毫米l谷氨酰胺在37°C和5%的股份有限公司2。
香烟烟雾提取物的准备工作。
CSE准备用两个吸高浓度的万宝路香烟过滤器移除(菲利普·莫里斯,弗吉尼亚州里士满),是通过修改燃烧60毫升注射器设备到20毫升的RPMI 1640如前所述(媒介沃尔特斯et al ., 2005)。CSE然后通过0.25 -μm过滤消毒和去除颗粒物,并立即使用。光密度测量在320波长λ,实现价值和价值被稀释0.15提供一个集中,刺激细胞没有诱导细胞死亡。
pAkt化验。
U937s被播种(0.5×106细胞/毫升)在媒体饥饿,一夜之间在37°C公司为5%2。细胞培养与去甲替林(σ化学;1、3.3、10和33μM)或非选择性PI3K抑制剂2 - (4-morpholinyl) 8-phenyl-4H1-benzopyran-4-one (LY294002)(σ化学;0.033,0.1,0.33,1μM) 30分钟,然后刺激与H2O2(200μM) 15分钟或5分钟。磷酸酶抑制剂CSE(活动主题Inc ., Rixensar,比利时)温暖在37°C添加5%最后集中到每个停止反应。全细胞提取进行裂解缓冲从核萃取设备(活动主题Inc .)和40μg蛋白质样本分开使用10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳/免疫印迹(表达载体,佩斯利,英国)。丝氨酸在473年发现了一种蛋白激酶的磷酸化和总Akt1用鼠标单克隆anti-S473 Akt(细胞信号,哈特金、英国)和兔多克隆anti-Akt1(细胞信号),分别。乐队S473Akt密度是总Akt1规范化。
HDAC活性。
细胞播种0.5×106细胞/毫升饥饿媒体与去甲替林治疗(1 0、3.3和10μM) 30分钟,然后刺激与H2O2(200μM) 15分钟或CSE(33%和100)为2 h。核提取准备如前所述Ito et al ., 2002),HDAC活性测定10-μl样本核提取物和规范化的蛋白质浓度。
HDAC2表达式。
核提取解决10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳、免疫印迹,并使用鼠标发现HDAC2单克隆anti-HDAC2(σ化学)。乐队密度是规范化的核纤层蛋白A / C(圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国)。
皮质类固醇敏感性分析。
U937细胞(播种为0.5×106细胞/毫升)和去甲替林治疗(克莱恩et al ., 1991)(1和3.3μM)(σ化学),南京(10毫米),LY294002 (Gharbi et al ., 2007μM)(1)(σ化学)、哌唑嗪(Faridbod et al ., 2010)(0.1μM)(σ化学),mepyramine (吻et al ., 2004μM)(1)(σ化学)和ketanserin (赫恩登et al ., 1992)(0.1μM)(σ化学)前30分钟的刺激CSE (33%) 2 h。细胞是通过离心收集的,媒体和球团resuspended饥饿。细胞被播种在96 -孔板的布地奈德(阿斯利康制药、隆德、瑞典;10−12到10−7米)与TNFα隔夜刺激前45分钟(10 ng / ml;欧洲有限公司研发系统,阿宾顿,英国牛津郡)。收集上清液,interleukin-8(引发)表达式是通过ELISA(研发系统)来衡量的。抑制引发的布地奈德的百分比计算,EC和皮质类固醇敏感性测定50。
PI3K活动分析。
PI3K酶抑制活性取决于时间分辨荧光共振能量转移(HTRFPI3K酶测定;微孔,沃特福德,英国)。去甲替林或LY294002添加所需的最终浓度的混合磷脂酰肌醇酮糖底物和重组PI3Kα,δ,或γ酶(微孔),混合物在室温下是孵化2 h。潜伏期之后,ATP酶(20μM)添加到/复合/混合磷脂酰肌醇酮糖底物,以及由此产生的混合物在室温下孵化了30分钟。每个反应的抑制百分比计算相对于vehicle-treated控制和集成电路50从量效曲线值的计算。
统计分析。
数据表示为意味着±S.E.M.使用成对的结果进行了分析t测试或单向方差分析与Dunnett测试后重复措施为多个比较。电子商务50布地奈德的值确定引发concentration-inhibitory响应曲线的生产,和EC的差异50布地奈德的价值评估使用Bonferroni的多重比较检验。棱镜软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)是用于统计计算。实验至少重复三次。P< 0.05被认为是具有统计学意义。协同作用,分析了两种化合物isobologram的方法周和Talalay (1977)使用CalcuSyn软件(BISOFT,剑桥,英国)。
结果
去甲替林阻止CSE, H2O2全身的一种蛋白激酶的磷酸化。
一种蛋白激酶的磷酸化丝氨酸473年是用来测量PI3K激活。S473Akt磷酸化增加了H2O2(3.4±0.2倍增加与控制;p< 0.01)和CSE(3.3±0.2倍增加与控制;p< 0.01)(图1)。预培养与去甲替林(1 - 10μM;p< 0.01)显著预防一种蛋白激酶磷酸化的H2O2(图1一)和CSE (p< 0.01),IC50值计算是1.67μM (图1B)。LY294002也产生浓度抑制CSE-induced pAkt IC500.25μM(补充图1)。因此,在抑制去甲替林只有6.7倍低于LY294002 CSE-induced PI3K激活。体外酶反应的措施PI3Kα,γ和δ活动,去甲替林,concentration-dependently抑制PI3Kδ活动(IC500.82μM),效果类似于LY294002 (IC500.98μM),而对PI3Kα或PI3Kγ(去甲替林没有影响表1)。
去甲替林阻止CSE-Induced皮质类固醇不敏感。
布地奈德concentration-dependently抑制TNFα-induced引发U937细胞释放EC50值为9.3×10−10M和E马克斯的56%。预处理对CSE(33%)导致减少布地奈德(EC的敏感性501.2×10−9M;p< 0.05与Nt)和减少E马克斯(24%;p< 0.05和Nt) (表2)。这是被预处理与南汽(10毫米)(EC506.1×10−10与南汽),表明布地奈德敏感性的降低是由氧化应激(图3)去甲替林也阻止CSE-induced皮质类固醇不敏感。CSE (EC505.9纳米;E马克斯24±2%)诱导布地奈德不敏感而控制(EC500.85纳米,p< 0.01和Nt;E马克斯56±5%,p< 0.05和Nt) (图3B)。去甲替林逆转布地奈德不敏感,CSE (EC501μM: 0.54海里,p< 0.001和CSE;电子商务503.3μM: 1.00海里,p< 0.001对CSE)。E马克斯然而,也减少了去甲替林不显著(E马克斯1μM: 33±6%和3.3μM: 32±8%)。LY294002(1μM)也逆转CSE-induced布地奈德不敏感(EC50布地奈德的1.07 nM LY294002的CSE与2.67 nM CSE控制;p< 0.05),但没有任何影响E马克斯(图3C)。
去甲替林也是一个强有力的组胺H1受体拮抗剂(泰勒和Richelson, 1980年)以及部分抑制剂α1肾上腺素能受体(布朗et al ., 1980)和5-HT2受体(桑切斯和Hyttel, 1999)。因此,我们测量的抑制作用为H1受体拮抗剂(mepyramine) 5-HT2受体(ketanserin)和α1肾上腺素能受体(哌唑嗪)在我们CSE-induced皮质类固醇不敏感模型。使用各种各样的对手没有对电子商务产生影响50或E马克斯(补充表1),而去甲替林恢复EC50。
去甲替林和布地奈德表现出协同效应。
U937细胞治疗H2O260分钟,然后用TNFα刺激。上层清液收集24 h后刺激,引发由ELISA决定。布地奈德和/或去甲替林TNFα刺激前有30分钟。布地奈德和去甲替林concentration-dependently抑制引发释放。不同组合的布地奈德去甲替林显示更大的抑制效果比单独化合物,和isobologram分析表明,这种组合显示协同作用(图4)。
讨论
氧化应激,如H2O2和CSE,可能发挥重要作用的发展皮质类固醇不敏感在慢性阻塞性肺病和严重哮喘(爱德考克和巴恩斯,2008)。所示图3,CSE布地奈德的影响减少TNFα-induced引发U937细胞释放先前报道(Ito et al ., 2001;Cosio et al ., 2004)。因为南汽,一种抗氧化剂,扭转了CSE-induced减少布地奈德效应,这表明氧化应激直接导致激素不敏感。氧化应激激素不敏感的分子机制已经被阐明。H2O2据报道,在高浓度时抑制核易位的GR (Okamoto et al ., 1999)。然而,另一个机制是减少HDAC2活动和表达,这是糖皮质激素所需关闭激活炎症基因(巴恩斯2009 b)。活动、蛋白表达和mRNA的表达HDAC2是减少慢性阻塞性肺病细胞和肺组织(Ito et al ., 2005)。氧化应激诱导的低氧诱导因子1α被证明能减少HDAC2基因表达的启动子区域(Charron et al ., 2009)。然而,在这项研究中,氧化应激减少HDAC活动15分钟和2 h之间没有任何HDAC2蛋白质表达的变化。因此,减少转录HDAC2不参与本研究模型所示。相反,翻译修饰可能是参与HDAC2活动的减少。HDAC2 Nitrative应力导致硝化酪氨酸残基,导致减少活动(Osoata et al ., 2009)。PI3K-dependent Akt通路报道诱导HDAC2磷酸化并减少活动(Adenuga et al ., 2009)。事实上,这两个H2O2473,CSE诱导一种蛋白激酶的磷酸化丝氨酸(Lahair et al ., 2006)(图1),同时减少HDAC活动(图2)(et al ., 2010)。LY294002、非选择性PI3K抑制剂concentration-dependently抑制CSE-induced一种蛋白激酶磷酸化(补充图。1)。我们以前报道,LY294002抑制U937细胞一种蛋白激酶磷酸化和逆转HDAC活性体外和体内小鼠暴露于香烟烟雾(et al ., 2010)。
四个不同亚型的PI3K已确定,α,β,γ和δ(Ito et al ., 2007)。研究发现,pAkt增加COPD肺组织和细胞,这是由于增加的激活PI3Kδ同种型(et al ., 2010)。另一项研究发现,PI3Kδ(−−)零老鼠免受香烟烟雾诱发皮质类固醇的阻力和下调HDAC2活动(Marwick et al ., 2009)。此外,2 - (6-aminopurin-9-ylmethyl) 3 - 6 (2-chlorophenyl) 7-dimethoxy-3H-quinazoli-n-4-one (IC87114),选择性PI3Kδ抑制剂(苦行僧et al ., 2003),皮质类固醇的影响增加小鼠暴露于吸烟(et al ., 2010)。此外,细胞与未装配的PI3Kδ通过RNA干扰没有出现皮质类固醇在H反应不敏感2O2(et al ., 2010)。因此,在调节皮质类固醇PI3Kδ似乎是至关重要的HDAC2通过减少氧化应激活动后不敏感。
去甲替林是一个三环类药物阿米替林的主要代谢物和已经使用了很长一段时间的治疗抑郁症和尼古丁上瘾(Wagena et al ., 2005)。大规模筛选已被用于识别药物与糖皮质激素的抗炎作用有协同效应抑制TNFα版本(Lehar et al ., 2009)。Isobologram分析表明去甲替林和强的松的协同抗炎作用。我们证实了布地奈德之间的协同作用,在抑制去甲替林TNFα-induced引发释放U937细胞暴露于H2O220分钟使用isobologram分析(图4)。在这项研究中,去甲替林也有选择性地抑制CSE, H2O2全身的一种蛋白激酶磷酸化和选择性地抑制PI3Kδ酶活性(表1)。在低浓度去甲替林也恢复后HDAC活性的降低水平H2O2和CSE曝光。因此,去甲替林能够恢复皮质类固醇不敏感通过抑制PI3Kδ酶激活氧化应激。
所示表2和图3,尽管去甲替林逆转布地奈德不敏感的条件下氧化应激,它不产生重大影响E马克斯。LY294002也未能扭转降低E马克斯CSE后,建议减少E马克斯不是PI3K-dependent。我们以前报道,EC LY294002修改50但不是E马克斯来自COPD患者外周血单核细胞(et al ., 2010)。去甲替林也是抑制组胺(H1) (泰勒和Richelson, 1980年),α1肾上腺素(布朗et al ., 1980)和5-HT2受体(桑切斯和Hyttel, 1999)。使用这些受体的拮抗剂对EC没有任何影响50或E马克斯,这表明去甲替林恢复的皮质类固醇敏感是独立于这些途径。
另一个广泛使用的药物,茶碱,也能够恢复皮质类固醇响应条件下氧化应激增加HDAC2通过选择性抑制PI3Kδ(Ito et al ., 2002;Cosio et al ., 2004;et al ., 2010)。茶碱的抑制作用PI3Kδ由氧化应激显著增强,表明一些酶的变构效应,而去甲替林似乎直接作用的酶,这表明它比茶碱可能在不同的网站。
总之,去甲替林被发现直接PI3Kδ抑制剂,从而能够逆转皮质类固醇不敏感引起的氧化应激通过恢复HDAC活性。因此,去甲替林的联合治疗,糖皮质激素可能是一个有用的治疗corticosteroid-insensitive疾病,如严重的哮喘和慢性阻塞性肺病。因为许多COPD患者和严重哮喘患有临床抑郁症(希尔et al ., 2008;Ng et al ., 2009这可能是一个有用的治疗组合。慢性阻塞性肺病患者的临床试验去甲替林现在表示,因为这种药物的抑制作用的药物浓度范围内目前用于治疗抑郁症。
作者的贡献
参与研究设计:梅尔卡多、Ito和巴恩斯。
进行实验:梅尔卡多和。
执行数据分析:梅尔卡多和。
或导致写作手稿中写道:梅尔卡多、Ito和巴恩斯。
脚注
这项工作是由CombinatoRx格兰特,剑桥,MA,威康信托基金会(076472 / Z / 05 / Z]。
文章、出版日期和引文信息可以发现http://jpet.aspetjournals.org。
doi: 10.1124 / jpet.110.175950。
↵ 本文的网络版(可用http://jpet.aspetjournals.org)包含补充材料。
缩写:
- 慢性阻塞性肺病
- 慢性阻塞性肺疾病
- CSE
- 香烟烟雾提取物
- GR
- 糖皮质激素受体
- HDAC
- 组蛋白脱乙酰酶
- H2O2
- 过氧化氢
- 引发
- interleukin-8
- 南汽
- NgydF4y2Ba乙酰半胱氨酸
- PI3K
- phosphoinositide-3-kinase
- TNFα
- 肿瘤坏死因子α
- pAkt
- 磷酸化Akt
- ELISA
- 酶联免疫吸附试验
- Nt
- 去甲替林
- 5青灵
- 5-hydroxtryptamine 2型
- LY294002
- (2)- 4-morpholinyl 8-phenyl-4H1-benzopyran-4-one
- IC87114
- (2)- 6-aminopurin-9-ylmethyl 3 - (2-chlorophenyl) 6、7-dimethoxy-3H-quinazoli-n-4-one。
- 收到了2010年10月18日。
- 接受2011年2月4日。
- 版权©2011年药理学和实验治疗的美国社会