文摘
Aclidinium溴是一种新颖有效的,长效吸入毒蕈碱的拮抗剂在治疗慢性阻塞性肺疾病的发展。Aclidinium显示subnanomolar亲和力的五个人类毒蕈碱的受体(M1- m5)。(3从M H] Aclidinium分离稍快2和M3受体比3比[H] tiotropium但更慢3H] ipratropium。其协会的M3受体是类似于3[H] ipratropium和2.6倍3H] tiotropium。住宅的半衰期3在M H] aclidinium2受体是短于M3M受体,展示动能选择性3受体。在孤立的豚鼠气管,aclidinium显示类似效力ipratropium tiotropium,比tiotropium起效快,持续时间的作用类似于tiotropium和显著长于ipratropium。在豚鼠喷雾aclidinium抑制乙酰胆碱引起的支气管收缩浓度的方式行动的速度比tiotropium发作。持续的行动aclidinium (t1/2= 29 h)远远超过ipratropium(8小时),但比tiotropium短(64 h)。在狗,aclidinium诱导更小更瞬态增加心率比tiotropium可比supratherapeutic剂量。因此,在这种情况下,aclidinium显示治疗指数大于tiotropium(4.2和1.6)。这些结果表明,aclidinium是一个强有力的毒蕈碱的拮抗剂,快速行动,开始长时间的效果,良好的心血管安全性。
- (31 - [H] NMS,N-methyl- - - - - -3H]莨菪碱氯甲烷
- 慢性阻塞性肺病,慢性阻塞性肺疾病
- 米,毒蕈碱的受体
- 方差分析,方差分析
- AUC,曲线下的面积
- LAS34273 aclidinium溴3R——(2-hydroxy-2 2-di-thiophen-2-yl-acetoxy) 1 (3-phenoxy-propyl) 1-azonia-bicyclo(2.2.2)溴辛烷。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种进行性炎症性疾病,其特征是慢性气流阻塞归因于长期接触吸入有害气体和颗粒,通常与吸烟有关,是不完全可逆的支气管扩张剂治疗后(www.goldcopd.org)(瑞芭et al ., 2007)。最近世界卫生组织预测,预测COPD将成为第四个最常见的死因,2030年2020年第三慢性残疾的最常见的原因(洛佩兹et al ., 2006;源泉> Loncar, 2006)。乙酰胆碱释放的副交感神经调节气道狭窄,粘液分泌,通过其与毒蕈碱的受体和血管舒张平滑肌本地化,粘膜腺体,肺的肺血管和神经末梢(Belmonte 2005)。
有五个毒蕈碱的受体的亚型,M1M5,总科的成员G-protein-coupled受体(Eglen 2005)。不同的生理功能已被归因于每个亚型根据其组织定位和表达模式(艾布拉姆斯et al ., 2006)。在人类肺癌的表达1,米2,米3,但不是M4和M5,毒蕈碱的受体亚型前面描述的(Belmonte 2005)。米3在气管平滑肌受体,本地化,负责调停支气管收缩的胆碱能神经刺激反应(Roffel et al ., 1990)。米3和M1受体在粘膜腺体也表示,刺激被认为促进粘液分泌(Gwilt et al ., 2007)。米2受体在胆碱能神经末梢本地化presynaptically作为受体,介导反馈抑制乙酰胆碱释放的神经(云煌岩与巴恩斯,1988)。
长效支气管扩张剂的一线治疗慢性阻塞性肺病患者(Hanania Donohue), 2007年;Cazzola马泰拉,2008年)。毒蕈碱的拮抗剂尤其有效,因为副交感胆碱能的语气似乎主要在COPD气道阻塞(可逆的组成部分总值2006;Cazzola马泰拉,2008年)。可用的吸入毒蕈碱的拮抗剂的症状治疗慢性阻塞性肺病有不同持续时间的行动,因此,计量制度。例如,ipratropium溴化是一种短效代理需要几个每天剂量,而tiotropium溴化是一个长效剂给每天一次(Breekveldt-Postma et al ., 2007)。对所有毒蕈碱的受体化合物都有类似的亲和力,但tiotropium M停留时间要长得多3比ipratropium受体(Disse et al ., 1993;总值2006在人类身上),解释了不同给药方案(哈达德et al ., 1994)。这长时间的作用tiotropium在人类中也被观察到在孤立的航空公司准备和动物(Disse et al ., 1993,高桥et al ., 1994)。
鉴于毒蕈碱的受体的分布,系统可用的代理绑定到呼吸道以外的毒蕈碱的受体有可能产生不必要的生理效应,如心动过速,口干,尿潴留、便秘(利伯曼,2004)。而口干是最常见的系统性抗胆碱能与使用相关的副作用ipratropium和tiotropium (Casaburi et al ., 2002;Vincken et al ., 2002),可能最严重的系统性效应是心动过速,结果从心脏的封锁2受体(利伯曼,2004;李et al ., 2008)。
减少潜在的系统性副作用,毒蕈碱的拮抗剂治疗呼吸道疾病已被设计为季铵盐由吸入减少口服生物利用度和穿透血脑屏障(Cereda et al ., 1990)。本地交付到肺部和低胃肠道吸收有助于减少系统性风险,因此,降低潜在的副作用。
额外的但不利用战略进一步减少系统性暴露antimuscarinics是增加其等离子体间隙。溴化Aclidinium 3R——(2-hydroxy-2 2-di-thiophen-2-yl-acetoxy) 1 (3-phenoxy-propyl) 1-azonia-bicyclo[2.2.2]溴辛烷(图1),以前称为LAS34273,是一种新型的吸入毒蕈碱的对手(傻瓜et al ., 2009)目前正在进行III期临床试验的维持治疗慢性阻塞性肺病(NCT00363896 NCT00358436,www.ClinTrials.gov,2008)。与其他现有antimuscarinics包括tiotropium aclidinium已被证明在人血浆进行快速水解,导致非常低的和短暂的系统性风险,建议降低的潜力与课堂有关的系统性副作用在临床设置(Gavalda et al ., 2007,2008年)。
在本文中,我们报告的药理特性aclidinium体外使用人类毒蕈碱的受体和孤立的豚鼠气管和体内,在不同功能的动物模型,包括评估其治疗指数的狗。
材料和方法
材料和药物制剂
Aclidinium溴化溴化和tiotropium(6β,7β-epoxy-3β-hydroxy-8-methyl-1αH5αH溴化-tropanium di-2-thienylglycolate)合成的药物化学(laboratorio Almirall,巴塞罗那,西班牙);ipratropium溴铵、硫酸阿托品、氯化乙酰胆碱、氯化碳酰胆碱,聚氨酯,辣椒素,吲哚美辛,并与钙、镁磷酸盐买来Sigma-Aldrich(三章、西班牙);戊巴比妥钠是来自工业Kern(西班牙巴塞罗那);氯胺酮chlorhydrate (Imalgene)购买的梅里亚(西班牙巴塞罗那);甲苯噻嗪盐酸盐(Rompun)从拜耳购买(西班牙巴塞罗那);马来酸乙酰丙嗪(Calmoneosan)从辉瑞公司购买祝您健康动物(Alcobendas、西班牙);和异丙酚(Lipuro)是获得b·布劳恩(Rubi、西班牙)。
膜准备表达人类M1,米2,米3,米4,米5受体(从转染获得中国仓鼠卵巢细胞K1)膜获得目标系统(PerkinElmer生活和分析科学,波士顿,MA)。1 - (N-methyl- - - - - -3H]莨菪碱氯甲烷([3H] NMS)是获得PerkinElmer生活和分析的科学。(3H] Aclidinium (2.886 TBq /更易),(3H] ipratropium (2.701 TBq /更易)和(3H] tiotropium (3.108 TBq /更易)custom-synthesized由英国通用电气医疗集团有限公司(泥沼,白金汉郡,英国)。
平衡和动态绑定的研究都是在96孔板(Nunc;热费希尔科学、鲁开德、丹麦),所有对手溶解在二甲亚砜。在体外孤立的器官和体内研究,aclidinium是溶解在1%至0.2 (v / v)盐酸,当需要时,在聚乙二醇300的存在。Ipratropium和tiotropium溶解在蒸馏水中,除了小猎犬狗研究使用生理盐水。Krebs-Henseleit解决方案(豚鼠气管研究)是由118毫米氯化钠,氯化钾4.7毫米,1.2毫米MgSO425毫米NaHCO3,1.2毫米KH2阿宝4、葡萄糖5.5毫米和2.6毫米CaCl2。
动物
男性Dunkin-Hartley豚鼠(400 - 600克的实验过程)是获得哈伦(Interfauna Iberica,桑特Feliu de康迪,西班牙)。豚鼠被安置在四、五组在20 - 24°C下12 h光/暗周期。食物(维护饮食豚鼠与维生素C[安全114;安全,法国Augy])和水随意。男性小猎犬狗(9-20公斤实验过程)时由保证商业供应商。狗被安置在15至21°C,湿度40 - 70%,美联储在12 h光/暗周期和维护饮食(麦迪逊,哈伦Teklad WI),免费获得水。所有实验动物伦理委员会的批准,Almirall(西班牙巴塞罗那)。
(3H] NMS放射性配体置换研究
亲和力的人1M5毒蕈碱的受体亚型。
毒蕈碱的拮抗剂的亲和力aclidinium, tiotropium,为不同的人类ipratropium毒蕈碱的受体亚型在平衡是由测量能力取代的绑定3H] NMS细胞膜准备表达人类毒蕈碱的受体亚型之一。
蛋白质浓度分别为8.1,10.0,4.9,4.5和5.0μg / M1,米2,米3,米4,米5分别受体膜制剂。的进行了分析(3H] NMS浓度约等于放射性配体平衡离解常数(Kd不同的毒蕈碱的受体亚型)。(3H] NMS浓度为0.3 nM的M1和M4化验和1海里的M2,米3,米5化验。一系列的拮抗物浓度(10−14到10−5米)在复制生成测试曲线的竞争。非特异性结合确定的阿托品(1μM)。化验试剂溶解在分析绑定缓冲(与钙、镁磷酸盐)的总量200μl。2 -或6小时后潜伏期(M1- m4和M5分别)96年在室温下微量滴定板以确保平衡测试,实现对所有化合物150 -μl整除的反应被转移到GF / C过滤板(微孔,巴塞罗那,西班牙)进行1 h和清洗缓冲(50毫米三,100毫米氯化钠,pH值7.4)包含0.05%的表面进行。束缚和自由3H] NMS然后被快速真空过滤四个洗冰冷的清洗缓冲紧随其后。过滤器被干了30分钟,然后添加30μl OptiPhase Supermix (PerkinElmer生活和分析科学)和放射性量化使用MicroBeta Trilux微型板块闪烁计数器(PerkinElmer生命科学和分析)。
数据分析。
亲和力在平衡被确定为平衡拮抗剂离解常数(K我通过纠正实验IC)值50为每个化合物根据获得的值程和Prusoff (1973)和使用的实验值Kd(3H] NMS对每个受体亚型分析中使用的放射性配体的浓度。K我价值观从至少三个独立的曲线获得10拮抗剂浓度在重复运行。所有的调整进行了使用棱镜(圣地亚哥GraphPad软件公司CA)。
研究放射性标记的毒蕈碱的拮抗剂
饱和度研究在人类M2和M3受体。
放射性配体结合实验标准聚丙烯96孔板在204μl的总量。膜被稀释在绑定缓冲(三羟甲基氨基甲烷25毫米,液pH值7.4)最终测定蛋白质浓度的15μg /毫升。所有的分析都是始于200年通过添加相应的膜μl解决4-μl混合物的放射性配体(稀释获得最终的浓度6.25 - -0.012 nM (3H] aclidinium和[3为[H] tiotropium和25 - 0.012海里3H] ipratropium),要么阿托品实现最终的浓度10μM(非特异性结合)或车辆总数(绑定)。所有放射性配体和阿托品都溶解在二甲亚砜100%股票的解决方案。
孵化后4小时达到平衡,150μl化验的混合物在指定的时间转移到了96 - 200 GF / B之前过滤板处理μl prewet的解决方案(聚乙烯吡咯烷酮0.5%,0.1%渐变20)/ 2 h。束缚和自由放射性配体被快速真空过滤和分离洗6次200μl冰冷的洗缓冲区,和放射性量化。
协会与人类米2和M3毒蕈碱的受体。
协会进行了化验三个放射性配体浓度对应大约3 - 1 -和他们的0.33倍Kd。膜被稀释在绑定缓冲一个最终的蛋白质含量测定15μg /毫升的M2和M3受体。化合物孵化为不同时间间隔(从2到360分钟)使用标准的反应混合物,和绑定放射性决心为每个时间点如前所述。
分离从人类米2和M3毒蕈碱的受体。
在分离实验中,协会第一次在最后分析放射性配体浓度为2.5 nM (3H] aclidinium和[3H] tiotropium和10 nM [3H] ipratropium确保大约90%入住率的结合位点。饱和度和关联研究,膜蛋白的浓度是米15μg /毫升2和M3受体在最后的分析。分析混合物(202μl)是孵化135分钟让放射性配体达到平衡。在这个时间点,添加2μl阿托品是为了获得一个最终化验浓度10μM占领成为可用的结合位点,从而防止重新组合。放射性配体的数量仍然束缚在不同时间点决心以150 -μl样本和处理如前所述。
数据分析。
Kd和B马克斯值(3H] aclidinium, [3H] tiotropium,3在M H] ipratropium2和M3受体被调整的具体计算数据绑定到一个站点绑定双曲线。对于每个放射性配体浓度,单阶段指数关联方程被用来计算相应的观察协会速率常数(Kob),单阶段指数衰减方程被用来计算K从。
协会的速率常数(K在使用方程计算)为每一个对手K在= (Kob−K从)/(对手),K从和Kob得到分离和协会的实验。离解半衰期(t1/2)根据计算方程t1/2= 0.693 /K从(道林和查尔顿,2006年)。
所有报道值代表均值±S.E.M.从三个独立的实验。在的情况下K在决心,每个实验由三个不同的放射性配体的浓度,和报道K在是值的均值得到每个浓度。所有计算都使用GraphPad棱镜执行软件。
豚鼠孤立Trachea-Carbachol刺激化验
Carbachol-induced收缩研究基本上如前所述执行(Cortijo et al ., 1994)。平衡期后,两个控制量效曲线生成的碳酰胆碱(0.1 nM-1毫米)来演示的再现性收缩对这些药物的反应。兴奋剂被冲毁,re-equilibrated组织。对手被增加了30分钟,然后新的碳酰胆碱量效曲线生成。浓度范围的拮抗剂carbachol-induced收缩实验如下:0.1到100海里aclidinium, 1到100 nM ipratropium, 1到10 nM tiotropium。每个对手的力量决定作为一个p一个2通过席尔德情节分析价值。
开始行动的三个对手决心carbachol-induced收缩研究使用10μM卡巴可获得收缩高原。开始行动是评估时间之外的对手达到50 (t1/2)和100% (t马克斯碳酰胆碱的抑制收缩。对手使用的浓度2 nM aclidinium 3 nM ipratropium 6 nM tiotropium,对应于那些生产大约70 - 80%放松。
行动的持续时间(抵消)拮抗剂,定义为从对手冲刷恢复50%的时间(t1/2)或最大恢复(t马克斯)的胆碱能的语气,决心在carbachol-induced收缩研究使用前面描述的方法(Nials et al ., 1993),小的修改。稳定准备承包了10μM碳酰胆碱和允许高原。对手被添加到放松组织(2、3和6 nM aclidinium, ipratropium tiotropium,分别对应浓度产生大约70 - 80%放松)。语气的抑制达到最大后,组织被新鲜Krebs-Henseleit解决方案包含10μM碳酰胆碱,随着时间的推移和语气的复苏被记录。
数据分析。
p一个2值获得carbachol-induced收缩的研究比较使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni-Dunn测试后在适当的地方或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。发病和偏移量t1/2值获得carbachol-induced收缩的研究是由每个量效曲线的插值。发病之间的差异和偏移量乘以克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行了分析。所有使用GraphPad棱镜软件分析。
在麻醉豚鼠效力并开始行动
麻醉豚鼠腹腔内注射1克/公斤的聚氨酯和20毫克/公斤戊巴比妥钠。一个额外的麻醉管理60分钟后是必需的。气管插管,肺是人工通风小啮齿动物呼吸机(Comerio-Varese尤格Basile、生物研究设备,意大利)60中风/分钟的速度和潮汐卷10毫升/公斤。动物是维持在37°C与温血的毯子在整个实验过程。
在空心颈动脉血压测量,乙酰胆碱是通过空心颈静脉注射。肺内的压力和血压测量血压传感器(MLT0699;ADInstruments-Panlab,西班牙巴塞罗那)连接到一个桥放大器(PowerLab / 8 sp;ADInstruments-Panlab)。数据记录使用图5软件(ADInstruments-Panlab)。
诱导麻醉和准备后,动物被允许稳定10分钟前引起的支气管收缩是乙酰胆碱的静脉团。乙酰胆碱是接种一剂(60μg /公斤),基底肺内的压力大约翻了一番。重复丸注射乙酰胆碱在选定的剂量服用,直到两个复制得到的反应;前两个最终响应的均值的拮抗剂与基线反应乙酰胆碱和被用来评估antibronchoconstrictor效应的拮抗剂。
五分钟后乙酰胆碱的最后政府用来计算最大支气管狭窄,测试对手是管理通过喷雾器(5 s持续时间、超声波雾化器;妈妈系统有限公司、英国伦敦)探讨支气管狭窄的逆转。拮抗剂是交付以下浓度范围:0.1到1毫克/毫升aclidinium, 0.03至0.3毫克/毫升ipratropium, 0.03到0.3毫克/毫升tiotropium。乙酰胆碱剂量被管理5、10、20、30、40岁,60岁,80,100,120分钟后拮抗剂的管理评估antibronchoconstrictor的影响。被表示为一个百分比的影响基线对乙酰胆碱的反应。t马克斯被定义为实现最大的对手所花费的时间的抑制acetylcholine-induced支气管狭窄和行动表明发病的化合物。效力的拮抗剂决心作为一个集成电路50值(产生抑制50%)所需的浓度测量的t马克斯。
数据分析。
力量(集成电路50)是决定从一个s形的剂量反应曲线构造使用抑制值t马克斯并使用GraphPad棱镜软件计算。集成电路50使用方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯检验值进行比较。
期间Bronchoprotection在几内亚猪
豚鼠被放置在一个丙烯酸甲酯框和暴露的气溶胶喷雾拮抗剂的解决方案。拮抗剂进行了1分钟3升/分钟的流量,和动物被允许自由呼吸5分钟时间。这个过程被重复。气溶胶通过生成一个超声波雾化器(Devilbiss Ultraneb 2000;日出医疗,萨默塞特郡PA)解决方案的100μg /毫升aclidinium, 30 ipratropiumμg /毫升,10μg /毫升tiotropium。拮抗剂用于本研究得到的浓度从先前的初步研究(数据未显示),被发现产生near-maximal抑制支气管收缩。
接触喷雾拮抗剂后,动物麻醉在不同时间点的肌内注射氯胺酮(43.8毫克/公斤),甲苯噻嗪(3.5毫克/公斤)和乙酰丙嗪(1.1毫克/公斤)。实验期间根据需要额外的麻醉管理。麻醉诱导后,动物人工通风小啮齿动物呼吸机(Comerio-Varese尤格Basile、生物研究设备,意大利)60岁中风/分钟和潮汐卷10毫升/公斤。动物被维持在37°C在整个实验过程中,恒温的毯子。气管插管是聚乙烯管(0.5/1.0毫米)和连接到一个pneumotachograph (Fleisch、Zabona、瑞士)记录气流的变化。食道与PE-60空心管胸腔的水平测量transpulmonary压力。颈动脉和颈静脉插管的血压监测和乙酰胆碱,分别。血压、transpulmonary压力和体积的变化测定使用压力传感器(斯坦森P23XL;奥克斯纳德Spectramed, CA)。通过整合体积随时间的变化,测量流计算为每个呼吸。 The variations in flow, transpulmonary pressure, and blood pressure were registered with Lfr Record software version 7.1 (Mumed Systems Ltd).
准备之后,动物们被允许稳定大约5分钟。当基线值范围内0.1 - 0.2厘米2O /毫升/秒的气道阻力和0.3到0.9 ml / cm H2O动态合规、肺动态测量启动。支气管狭窄single-bolus随后引发剂乙酰胆碱(30μg /公斤增长值)和抑制对手相比,测试车辆的影响。
气道阻力(厘米每毫升的H2O / s)计算系数的定容的点之间的压力和流量的变化在吸气和呼气。气道阻力对车辆和拮抗剂的乙酰胆碱的挑战是计算的公式:=气道阻力(R米−RB)×100 / RB,R米是电阻峰值后的挑战(极大值)和RB基线抵抗挑战之前(10次)。每个对手的抑制作用与各自对照组(车辆)。
antibronchoconstrictor效应的三个对手研究在以下时间点治疗后:1,2,4,18日,24日,48 h。额外乘以6 h ipratropium, 72年和96年aclidinium 36 h, h为tiotropium也被评估。
数据分析。
操作(持续时间t1/2)被定义为时间恢复50%的最大抑制作用通过拮抗物,来自时间进程支气管收缩抑制使用单阶段指数衰减曲线和计算公式。单向方差分析之后,纽曼Keuls测试后被用来确定统计支气管收缩的差异。这些分析使用GraphPad棱镜软件。
抑制支气管狭窄的小猎犬狗
抑制支气管狭窄的评估的方法Konzett和Rossler (1940)修改的根据三泽et al。(1986)。狗禁食18 h与异丙酚麻醉的初始剂量6到8毫克/公斤输液,后跟一个维护注入0.6至0.8毫克/公斤每分钟通过输液泵头静脉(正计划2;BD生物科学、Brezin、法国)。气管插管与气管插管管连接到一个呼吸器(Comerio尤格Basile 5025年,意大利)。动物被人工通风与室内空气的恒压10厘米的H2O 14中风/分钟的呼吸速率和潮汐卷15到20毫升/公斤。支气管的反应肌肉组织的通风溢出被pneumotachograph连续测量(TSD127;Goleta Biopac系统,Inc ., CA)作为气道阻力指数。
诱导麻醉和准备后,动物收到乙酰胆碱丸(5μg /公斤注射。)每隔10分钟,引起支气管收缩。连续两个相似的基线对乙酰胆碱的反应后获得,气溶胶的解决方案5μg /公斤aclidinium或0.25μg /公斤tiotropium由使用喷雾器(AG-AL1100;Aerogen,高威,爱尔兰)呼吸器和气管导管。这些剂量的aclidinium tiotropium选择基于之前的初步研究结果(数据没有显示)和代表剂量产生near-maximal抑制支气管收缩。乙酰胆碱又实施了10和20分钟和3和6 h复合管理后,然后支气管收缩的抑制是计算。动物苏醒后支气管痉挛在20分钟和3 - 6小时后测量。肺阻力不断被记录和分析通过数据采集系统(AcqKnowledge 3.8.1;Biopac系统,Inc .)。
心率评估在小猎犬的狗
对心率的影响评估在狗禁食18 h将心电图记录心电图的DII导数。心率是连续记录整个实验。基线数据,记录了15分钟,得到在动物与异丙酚麻醉注射(6尺11寸毫克/公斤)。气管内管插入气管,动物人工通气,如上描述狗支气管收缩实验。
诱导麻醉和准备后,500μg /公斤aclidinium或25μg /公斤tiotropium由一个喷雾器中描述狗支气管收缩实验。化合物的剂量是100倍高于用于支气管收缩实验。管理复合后,动物脱离呼吸器和允许恢复意识。监测心率的恢复和持续6小时研究期间记录。每个狗收到aclidinium和tiotropium洗脱期至少2周治疗;相同的动物被用来检查两化合物减少色散。治疗的顺序是随机的。
治疗指数计算和数据分析
每个化合物的治疗指数之间的比率被定义为曲线下的面积(AUC)的支气管收缩抑制(每小时的支气管收缩抑制百分比)和心率增加的AUC(心脏每小时增加的百分比)6小时研究期间。双向方差分析后跟Bonferroni测试后被用来确定支气管收缩和心率的统计差异。这些分析使用GraphPad棱镜软件。
结果
使用位移的关联性研究3H] NMS从人类毒蕈碱的受体亚型1M5在平衡。
aclidinium的亲和力,ipratropium, tiotropium人类毒蕈碱的受体是评估使用中国仓鼠ovary-KI膜细胞表达人类的M1M5受体亚型。
B马克斯五个稳定转染克隆和放射性配体Kd使用饱和实验测定。所有的米1,米2,米3,米4,米5受体膜准备了饱和(3H] NMS绑定。意思是(S.E.M.)B马克斯值是1.19(0.07),1.94(0.28),2.26(0.24),1.28(0.02),和2.60 pmol /毫克(0.04)米1,米2,米3,米4,米5受体,分别。意思是(S.E.M.)Kd值是0.4(0.03),0.81(0.08),0.66(0.01),0.28(0.01),和1.68海里(0.17)米1,米2,米3,米4,米5受体,分别。
Aclidinium、ipratropium tiotropium强有力地封锁了特定绑定的3H] NMS人类M1M5受体浓度的方式(表1)。在最高浓度测试(10μM),特定绑定的3H] NMS受体完全被这三个化合物。每一个对手都有类似的亲和力1M5受体亚型。tiotropium Aclidinium大约是均等的,8到16倍更有效比ipratropium所有五个人类毒蕈碱的受体亚型。
饱和度研究在人类M2和M3受体。
特定绑定的3H] aclidinium, [3H] tiotropium,3H] ipratropium人类毒蕈碱的M2和M3受体被发现在实验条件下饱和选择(数据未显示)。饱和曲线的分析表明,三种放射性配体绑定到一个齐次M受体数量2和M3膜的准备工作(数据没有显示)。的Kd和B马克斯所示值表2。的Kd的值(3H] aclidinium人类M2和M3受体亚型是可比的3H] tiotropium,大约四倍低于[3H] ipratropium。
协会与人类米2和M3受体。
协会的比率(3H] aclidinium, [3H] tiotropium,3H] ipratropium与人类3受体亚型所示表3。(3H] Aclidinium和[3H] tiotropium分别为0.11,0.33,和1纳米,而3H] ipratropium化验为0.33,根据相应的1和3海里Kd值。的K在对于[3H] aclidinium 1.42×108/ M / min。这种关联率相似(3H] ipratropium和的2.6倍(3H] tiotropium。的K在三个对手的人类2受体亚型太快是可靠地测量实验条件下使用。
分离从人类米2和M3受体。
结合放射性标记的拮抗剂对人类毒蕈碱的M2和M3膜制剂达到平衡前120分钟的孵化和保持稳定至少52 h。K从值及其派生的住所t1/2所示值表3。(3H] Aclidinium和[3从M H] tiotropium显示缓慢的离解3受体(图2),住宅半衰期约29,62 h,分别。相反的,分离的3H] ipratropium从相同的受体是快得多(图2),导致住宅短半衰期大约60 - 130倍比(3H] aclidinium和[3H] tiotropium,分别。(3M H] aclidinium半衰期2受体是短于3.22倍,获得3H] tiotropium。三个化合物的动力学选择性表达为M3/ M2半衰期比率比较(表3)。
在孤立的豚鼠气管体外功能活动。
氯化氨甲酰胆碱(0.1 nM-1毫米)产生浓度豚鼠气管收缩,这证实了控制实验的重现性(数据没有显示)。与aclidinium点预处理、ipratropium或tiotropium转移碳酰胆碱的浓度响应曲线(图3向右),证明浓度拮抗胆碱能受体激动剂引起的收缩反应。
力量(p一个2)aclidinium ipratropium和tiotropium相似。p之间没有显著差异一个2值观察(表4)。Aclidinium和ipratropium都证明了竞争激烈的对抗,没有激动剂引起的最大收缩的抑制。相比之下,tiotropium证明nonsurmountable对立的减毒受体激动剂的最大收缩最大的浓度。nonsurmountable tiotropium对立的本质是反映在计算边坡的席尔德情节分析,明显大于1 (表4)。aclidinium席尔德情节斜坡和ipratropium没有显著不同于团结。
发病的作用aclidinium也是carbachol-induced收缩试验研究,利用对手浓度产生大约70 - 80%放松(图4)。Aclidinium显示的操作(t1/2= 6.8±1.5分钟,t马克斯比tiotropium快= 35.9±8.2分钟)(t1/2= 13.6±2.7分钟,t马克斯= 61.2±10.6分钟)和类似于ipratropium (t1/2= 5.1±1.5分钟,t马克斯= 24.1±3.5分钟)。
aclidinium作用的持续时间,tiotropium ipratropium评估在carbachol-contracted豚鼠气管化验(表4)。Aclidinium和tiotropium时间的延长表现出明显的行动与ipratropium相比的t1/2和t马克斯(p< 0.05)。无论是aclidinium还是tiotropium允许完全恢复的语气冲刷时期(t马克斯),而显著复苏的基调之后ipratropium冲刷(表4)。每个对手产生类似比例的carbachol-induced收缩的抑制浓度选择(数据未显示)。
强度和发生在麻醉豚鼠。
评价体内吸入aclidinium bronchoprotective效果和比较器对力量和行动开始,三个剂量的每个对手都管理acetylcholine-induced之前不同组的麻醉豚鼠支气管收缩。Aclidinium、ipratropium tiotropium产生bronchoprotection 120 - min研究期间和显示效果(存在剂量依赖的相关性图5)。的集成电路50aclidinium值、ipratropium tiotropium测定时最大bronchoprotective效果观察(图5)所示表5。集成电路之间没有显著差异50值观察(表5)。最大抑制支气管收缩在最高剂量测试是在88年,83年,94%,aclidinium, ipratropium和tiotropium分别。行动的开始(定义为时间达到最大抑制支气管狭窄)aclidinium ipratropium是相同的(30分钟),但速度比tiotropium(80分钟)(表5;图5)。
期间Bronchoprotection在几内亚猪。
评估期间bronchoprotection化合物,轻快的影响高频剂量吸入拮抗剂研究了96 h的acetylcholine-induced在豚鼠支气管收缩模型。剂量选择,aclidinium、ipratropium tiotropium达到顶峰的抑制作用的气道阻力98%到97在1 h,显示一个equieffective acetylcholine-induced抑制支气管狭窄(图6)。所有测试化合物抑制acetylcholine-induced支气管狭窄浓度的方式(IC50在1 h: 5.9, 2.4,和6.9μg aclidinium /毫升,tiotropium和ipratropium分别)。的持续时间(定义为时间采取行动减少最大支气管收缩达到1 h 50% (t1/2)是aclidinium 29 h。这个动作持续时间远远长于ipratropium (t1/2= 8 h),有点短于tiotropium (t1/2= 64 h)。
治疗指数小猎犬的狗。
这些实验进行评估的有效性和安全性比aclidinium tiotropium当由吸入。疗效确定的能力将acetylcholine-induced支气管痉挛的小猎犬狗,和安全评估是对心率的影响在小猎犬的狗。每个化合物的剂量选择产生类似的和持久的bronchoprotective效应显著与车辆在所有时间点6小时研究时期(p< 0.001)。的支气管收缩抑制AUC计算0 - 6 h值aclidinium(462%)和tiotropium(540%)是相似的(图7)。当剂量aclidinium tiotropium 100倍高于功效研究中使用的是由吸入,观察心率的增加化合物(图8)。Aclidinium 500μg /公斤诱导增加最大心率的55%,1 h,最大增加99%与tiotropium 2 h后(25μg /公斤)。Aclidinium对心率的影响是短暂的和没有明显不同的车辆从2.5 h开始。相比之下,心率的增加与后6 h tiotropium坚持政府观察到(增加30%)和显著大于车辆的时间点(从1 h) 6小时研究期间。总的来说,aclidinium对心率的影响相当小而tiotropium超过6小时研究时期(AUC aclidinium心率增加0 - 6 h= 108% tiotropium比例为341%)。治疗指数,计算AUC0 - 6 h支气管收缩抑制(%)/ AUC0 - 6 h心率增加(%),4.2为tiotropium aclidinium和1.6。
讨论
本研究的目的是建立aclidinium溴的药理,小说和长效吸入毒蕈碱的拮抗剂在开发维护治疗慢性阻塞性肺病。
放射性配体结合位移研究进行平衡,aclidinium tiotropium一样,证明subnanomolar亲和力和选择性的五个人类毒蕈碱的受体亚型分析。的亲和力ipratropium低摩尔范围M1M5受体。ipratropium和tiotropium获得的数据与先前报道的一致(哈达德et al ., 1994)。
绑定的动力学的三个放射性标记的化合物的M2和M3受体亚型进行了评估。之间的相互作用的化合物2受体是有趣的超出其潜在含义功效因为抑制心脏M2已知受体诱发心动过速,这可能是最严重的副作用与系统性antimuscarinic代理(Eglen 2005)。M3受体,正如前面提到的,是关键受体亚型的治疗相关的肌肉松弛剂和bronchodilatory antimuscarinic代理进行调节的影响。
实验K从值和相应的离解半衰期应当被视为实际有效的行动时间的下限在受体的化合物。在实验条件下使用,大量的过剩竞争对手,受体拮抗剂的重新组合是不可能的。多余的竞争对手现在会容易占领任何免费绑定网站生成尽快通过测试化合物的分离。这将防止所描述的“邻近效应”科普兰et al。(2006)基于概率的配体分子留下一个受体和再结合受体分子。因此,住宅获得的半衰期为aclidinium M3受体(29.24小时)表明行动的长期体内。
所有三个放射性标记的对手有一个更快的离解的M2比M受体3受体,赋予一定的动能的选择性3与米2受体亚型。住宅的半衰期34 - 6倍以上,在米2受体变化为所有三个化合物。这些数据是一致的与先前报道tiotropium和ipratropium (Disse et al ., 1993;总值2006)。
协会的M2受体没有可测量的实验条件下使用的速度与这种受体拮抗剂协会。协会的M3受体是慢,定量测定,发现aclidinium和ipratropium相似。协会tiotropium M3受体是2.6倍比aclidinium对慢K在值。使用不同的实验方法,以往的研究报道K在值ipratropium和tiotropium在同一范围的报道(道林和查尔顿,2006年)。
毒蕈碱的受体激动剂的支气管收缩的反应隔离肺组织主要是通过介导的M3在气管平滑肌受体,在来自气管平滑肌的准备米3R−−/基因敲除小鼠(韦斯et al ., 2007)。在目前的研究中,在孤立的豚鼠气管aclidinium刺激的效力与卡巴可没有明显不同于ipratropium tiotropium。p一个2值ipratropium和tiotropium这里获得类似于之前报道的豚鼠气管与metacholine刺激(Disse et al ., 1993)。类似的图片50值已报告这两个对手在另一个研究豚鼠气管刺激与碳酰胆碱(Villetti et al ., 2006)。
在carbachol-stimulated豚鼠气管研究、aclidinium和ipratropium证明竞争对抗。然而,产生的对抗tiotropium nonsurmountable,斜率大于1的显示席尔德情节调整和最大衰减的胆碱能收缩,表明与tiotropium孵化后无法达到平衡。席尔德明显更大的阴谋斜率tiotropium也被报道在以前研究孤立豚鼠气管和人类航空公司(Disse et al ., 1993;Villetti et al ., 2006)。
Aclidinium证明快速行动的开始孤立豚鼠气管与卡巴可预约,类似于ipratropium tiotropium两倍。高桥et al。(1994)也有报道ipratropium更快的开始行动而恢复tiotropium电场电极刺激诱发的豚鼠气管收缩的孤立。ipratropium作用的持续时间和tiotropium carbachol-stimulated豚鼠气管实验符合他们的临床资料。Aclidinium演示了一个长时间的行动与tiotropium相比较在这些研究。与aclidinium tiotropium没有洗掉足够让复苏卡巴可实验的语气,类似的描述Villetti et al。(2006)。
在acetylcholine-induced在麻醉豚鼠支气管收缩模型,集成电路50aclidinium是2和3倍ipratropium tiotropium,分别,虽然差异没有统计学意义。aclidinium IC之间的差异50值从体外观察气管化验和体内动物模型可以解释的高敏感性aclidinium通过酯酶水解。Aclidinium水解更快在人血浆ipratropium和tiotropium相比,与人血浆半衰期2分钟Aclidinium和大于60分钟化合物(供参考Gavalda et al ., 2007)。相似的水解率曾被观察到在几内亚猪和狗等离子体(Gavalda et al ., 2008)。aclidinium恢复的开始行动acetylcholine-induced豚鼠支气管收缩是类似于ipratropium和更快的比tiotropium依照结果体外研究发现使用人类M3受体和孤立的豚鼠气管。
Aclidinium也展示了一种长期的行动在麻醉豚鼠(t1/2= 29 h) ipratropium(大约是4倍t1/2= 8 h)和低于tiotropium (t1/2= 64 h)。此外,在麻醉狗,aclidinium演示了一个类似bronchoprotective tiotropium效应,与对手产生显著抑制支气管狭窄6小时研究期间。这些体内数据都同意的体外住宅半衰期值(3H] aclidinium (t1/2人类毒蕈碱的M = 29 h)3受体和体外豚鼠本文研究报道。总之,这些结果表明,aclidinium临床前模型中产生了深远的影响。狗的治疗指数调查评估是否快速等离子体水解aclidinium (Gavalda et al ., 2007)和一个短的M2受体停留时间转化为一种改进的相比tiotropium efficacy-safety比率。
在有意识的狗,吸入aclidinium对心率的影响减少而tiotropium在100倍的剂量需要产生等效antibronchoconstrictor效果在同一物种。在这些实验条件下,aclidinium产生瞬态增加心率、2.5 h政府解决。相比之下,tiotropium导致显著增加心率,持续6小时后政府。这些数据同意近期临床心血管安全研究在几内亚猪和狗,表明aclidinium减少了潜在的心血管副作用而tiotropium (肝et al ., 2008)。在等离子体Aclidinium迅速水解(Gavalda et al ., 2008)和体外K从人类M值2受体tiotropium四倍的速度,这里介绍。这两个特征的组合可以解释较低和更多的瞬态影响发生aclidinium在狗与tiotropium心率。
尽管动能选择性(M3>米2)tiotropium概要描述,其缓慢离解的M3受体也伴随着M上的停留时间的增加2受体(Disse et al ., 1993)。其停留时间更长2受体相比,aclidinium证明这可以解释长期tiotropium对心率的影响在本研究。虽然心动过速没有被报道后,定期使用tiotropium (Tashkin et al ., 2008),这种药物在血浆可以妥协的存在使用tiotropium结合其他作用于心脏的药物。相反,一个复合等离子体快速水解,如aclidinium (Gavalda et al ., 2007),可能是潜在的心血管效应较低,因此会是有利的。
总之,这项研究报告的临床数据表明,aclidinium有效和选择性毒蕈碱的拮抗剂,迅速与毒蕈碱的受体相互作用,提供了一个持续封锁他们的行动。这些属性反映在行动的迅速出现和长期的持续时间在豚鼠aclidinium体外和体内功能模型。
此外,aclidinium具有良好的心血管安全性,这可能归因于其停留时间减少2在等离子体受体和快速水解。在一起,这些数据表明,aclidinium可能有利benefit-to-risk比率在临床设置,因此提供了一个宝贵的COPD患者的治疗选择。
确认
我们愿意承认罗萨里奥Cerrato的重要技术支持,马奈尔·德卢卡,琼鬃毛,玛丽亚罗莎·奥尔蒂斯,伊莎贝尔异教和Nuria托兰(Almirall);马克斯钱和何塞Freire(森林研究所、泽西城、新泽西)审查和优秀的手稿上的建议;和斯图亚特·格兰特博士(完整的医学交流,柴郡,英国),提供医疗援助。谁写信
脚注
这项工作的部分支持由Almirall SA(西班牙巴塞罗那);CICYT(科技部创新,西班牙政府)[saf2006赠款saf2008 - 03113——01002年,saf2005 - 00669] (J.C. E.J.M.);菲德尔(欧洲区域发展基金),从卫生研究所CIBERES卡洛斯三世(西班牙政府)(格兰特CB06/06/0027);CENIT计划(天才制药;西班牙政府);和地方政府(Generalitat Valenciana)(格兰特Prometeu 2008/045)。
这项工作是部分在抽象的形式发表美国胸腔学会和欧洲呼吸协会188bet官网地址会议。
文章、出版日期和引文信息可以发现http://jpet.aspetjournals.org。
doi: 10.1124 / jpet.109.151639
缩写:
↵1目前联系:癌症研究科技有限公司,英国伦敦。
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- 收到了2009年1月29日。
- 接受2009年8月25日。
- ©2009年药理学和实验治疗的美国社会
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