文摘
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特点是肺部炎症,这是吸入型皮质类固醇激素相对不敏感。肺部炎症的程度在慢性阻塞性肺病与疾病严重程度有关,它被认为疾病进展中发挥重要作用。我们已经评估选择性p38α-selective增殖蛋白激酶(MAPK)抑制剂,indole-5-carboxamide (ATP-competitive p38激酶抑制剂)(sd - 282),在烟草烟雾的11天的模型(TS)全身/ J小鼠肺部炎症,通过使用类固醇地塞米松作为参考。两个口服治疗模式进行评估在这个TS模型:预防性日常预处理之前每个日常接触,与日常治疗和治疗后6天开始5天的烟。支气管肺泡灌洗和组织学评价肺部分暴露于TS之后显示炎症反应组成的巨噬细胞和中性粒细胞增多和增强粘蛋白染色。Phospho-p38染色后在巨噬细胞和II型上皮细胞TS暴露也被观察到。考虑到预防性或治疗,地塞米松未能抑制任何TS-induced炎性变化。相比之下,sd - 282抑制TS-induced增加巨噬细胞和中性粒细胞。此外,SD 282 TS-induced增加cyclooxygenase-2减少和白细胞介素- 6的水平,和phospho-p38表达式在肺部。总之,sd - 282显著减少TS-induced炎症反应时预防性或治疗而地塞米松是无效的。 This is the first evidence that a p38α-selective MAPK inhibitor can exert pulmonary anti-inflammatory activity in a TS exposure model when given in a therapeutic mode, establishing the potential of p38 MAPK inhibitors as a therapy for COPD.
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界上第六大死因,和生理上定义的COPD的患病率在≥40岁的成年人∼9至10% (戟et al ., 2006)。慢性阻塞性肺病的特征是气道阻塞和进步的肺部炎症相关的大量炎症细胞(报道,1999名来自;Loppow et al ., 2001;Culpitt et al ., 2003)。慢性阻塞性肺病的主要原因是吸烟,有50%的吸烟者发展疾病通常在城市,与其他识别危险因素年龄增加和继续吸烟Lundback et al ., 2003;艾斯纳et al ., 2006)。炎症在COPD肺存在在这两个小型和大型航空公司,它被认为是疾病的病理学的发展的关键。事实上,炎症的严重程度与疾病严重程度的肺量测定法(给我们et al ., 2001)。在小气道炎症、纤维化,平滑肌肥大,杯状细胞增生,和这些特性增加强度随着疾病的进展。炎症细胞参与的小航空公司由CD4和8+T淋巴细胞、B细胞毛囊,巨噬细胞,在更严重的疾病还包括中性粒细胞(给我们1999;豪格et al ., 2004)。炎症也出现在大型航空公司,包括巨噬细胞、CD8+淋巴细胞和浆细胞(给我们1999)。关键贡献者COPD气道阻塞的进程已被证明是提高组织的体积小气道壁,粘液分泌物的积累,和气道壁的浸润细胞的先天和适应性免疫反应(Turato et al ., 2002;豪格et al ., 2004)。
吸入糖皮质激素的抗炎功效,广泛应用于慢性阻塞性肺病,主要结合吸入β2受体受体激动剂,一直在探索一些研究(Loppow et al ., 2001;Culpitt et al ., 2003)。然而,数据变量,吸入型皮质类固醇激素是否有效抗炎剂在慢性阻塞性肺病仍存在争议高地,2004;萨瑟兰Cherniack, 2004),较强的有效性证据的治疗或预防发作,和较弱的证据对疾病进展的影响。因此,开发更有效的抗炎药治疗慢性阻塞性肺病已经成为药物发现的一个重要目标公司(巴恩斯2005)。
新的抗炎方法目前在临床试验中,并且,如果有效,预计修改疾病的进展。在这种背景下,roflumilast PDE4抑制剂,这是慢性阻塞性肺病的III期临床试验,完全阻止小鼠肺气肿的发展长期暴露于香烟烟雾。这个预防肺破坏与减少肺巨噬细胞的积累有关,尽管影响其他细胞类型没有调查(Martorana et al ., 2005)。然而,PDE4抑制可能与慢性阻塞性肺病的副作用,可能会限制使用(粉丝涌,2006)。有明显的证据来自动物模型链接p38激酶映射到关节炎和1型糖尿病的慢性炎症(Medicherla et al .,2006年,一个,b)和该激酶的抑制剂在临床前和临床发展肺部疾病,包括慢性阻塞性肺病(Tigani et al ., 2003;蔡et al ., 2006)。然而,目前没有相关的临床前数据的潜在作用p38 MAP激酶抑制慢性阻塞性肺病。使用短期暴露TS模型允许评估潜在的抗炎机制和其他治疗方法疗效的比较。研究本文首先比较肺细胞诱导涌入鼠标由五日常接触烟草烟雾(TS)后,看到11日常接触TS。此外,p38α选择性的抗炎行动MAP激酶抑制剂,sd - 282,是与皮质类固醇的影响相比,地塞米松,炎症诱导的11天的烟曝光时间预防性和治疗性治疗方案。这些数据最初提出以抽象的形式(菲茨杰拉德et al ., 2006)。
材料和方法
化学描述、效力和选择剂sd - 282。sd - 282,一个indole-5-carboxamide ATP-competitive p38激酶的抑制剂,及其结构之前被报道(Kapoun et al ., 2006)。它是一种小分子口服活性抑制剂p38αMAPK。先前报道(Lim et al ., 2004;Sweitzer et al ., 2004;Medicherla, 2006), sd - 282表明选择性为14.3倍p38αMAPK (IC50价值0.0011μM)与p38βMAPK (IC50值为0.022μM),而抑制p38γMAP激酶和p38δMAP激酶是不到50%,即使在10μM的浓度。比较的选择性对p38αsd - 282,第二个结构不同的p38抑制剂,sb - 202190,被用作控制这些特性的研究,发现sd - 282但不是某人- 202190是非常特定于p38α(Medicherla et al ., 2006 a)。序列比对显示,95%小鼠和人类之间的身份p38a氨基酸水平,和sd - 282已被证明有效果在其他疾病小鼠模型和抑制药代动力学标记(Nath et al ., 2006;美国Medicherla,未发表的观察)。因此,sd - 282有一个合适的选择性配置文件使用的评价p38 MAP激酶的作用在COPD动物模型。当测试体外的浓度10μM, sd - 282证明没有对小组其他激酶抑制活性,包括细胞外signal-regulated kinase-2, c-Jun NH2终端激酶1,MAPK活性蛋白激酶2。此外,sd - 282说明不影响活动的纯化COX-1或cox - 2酶(Medicherla et al ., 2006 a)。药物动力学研究女性/ J小鼠显示,sd - 282在30和90毫克/公斤了3和8μM循环浓度,分别在30分钟后其管理和槽水平这些剂量微量8 h。因此,老鼠的研究报告是每天两次口服填喂法30和90毫克/公斤sd - 282。
动物。六个女/ J小鼠(哈伦英国有限公司,斯特,奥克,英国)。被批准的临床前动物实验协议Argenta伦理委员会发现,英国。
有限合伙人的研究。老鼠给车辆或地塞米松(0.3毫克/公斤/两次)订单1 h在鼻内(i.n)滴剂的脂多糖(LPS) (大肠杆菌;0.3μg老鼠)和滴剂后6 h (n每组)= 10。收到了PBS i.n虚假的动物。,和they received vehicle 1 h before i.n. instillation of PBS (50 μl per mouse) and 6 h after instillation (n每组)= 5。动物被麻醉过量安乐死(pentobarbitone钠;100毫克/公斤i.p i.n后24 h。有限合伙人的挑战。支气管肺泡灌洗(BAL)进行,总和微分单元数量进行如下描述的部分。
暴露于香烟烟雾中。在预防和治疗的研究中,每日五组小鼠暴露在空气中或TS(使用1生成r1购买香烟烟草研究所的研究中,肯塔基大学,列克星敦肯塔基州)5(基线组)或连续11天。所有的动物每天收到口头车辆或药物治疗前1 h和空气或TS曝光后6 h。在所有的研究中,所使用的车辆是0.5%甲基纤维素。烟草烟雾暴露系统类似于被夏皮罗和同事(某某先生的et al ., 1997)。烟雾暴露逐渐从第一天15分钟增加到50分钟每天5 - 11所示。Sham-exposed控制为一个等价的老鼠暴露在空气中时间使用类似的曝光系统但是没有香烟的使用。这是为了确保虚假的控制受到条件尽可能接近TS-exposed动物。小鼠安乐死后24 h第五空气或TS暴露或24 h后连续11日常接触的最后接触空气或TS。
预防研究。两个独立的实验中,药物治疗是在每个11日之前每日TS曝光(图1)。在第一项研究中,老鼠每天两次口服治疗sd - 282或车辆在预防(每次曝光前)模式从第一天到天11 TS曝光。在这项研究中,每组10小鼠口服治疗之前和90毫克/公斤或车辆1小时,每接触TS后6 h。对照组的老鼠被暴露在空气中每天同等的时间长度,他们收到车辆前口服1 h和暴露后6 h每天11天。在第二项研究中,老鼠每天两次口服治疗0.3毫克/公斤地塞米松或车辆(n前1 h = 10每组),每接触TS后6 h。本研究表现与下面描述的首次治疗研究。这使我们直接比较预防性和治疗性治疗sd - 282。
治疗性研究。两个独立的实验评价sd - 282对炎症的恶化的影响进行肺部炎症的动物(图1)。第一个实验研究了影响sd - 282 30毫克/公斤(低剂量)和90毫克/公斤(高剂量),和第二个实验研究了sd - 282的比较效应在90毫克/公斤,地塞米松在0.3毫克/公斤。在这一系列的实验,每组10老鼠在第一项研究和15每组小鼠在第二项研究中治疗sd - 282或每天两次口服地塞米松从第六TS接触开始,即。6 - 11天。此外,两个额外的小鼠组(n= 10)包含在第二项研究获得基线数据6天。这个基线组被暴露在空气中或TS为5天,和这些老鼠没有接受治疗。在这两项研究,BAL和rt - pcr进行描述的协议后预防研究。在第二项研究中,每组的五个动物的肺原位neutral-buffered 10%福尔马林固定,轻轻和肺膨胀压力25厘米的H2O至少30分钟。肺是固定的,处理,嵌入式纵向和石蜡。串行5-μm-thick 10部分削减每隔250 -μm到达mid-region的肺。部分被苏木精和伊红染色组织学评估肺部炎症、水肿、粘蛋白,肺泡壁增厚和高碘酸希夫染色。Phospho-p38免疫组织化学也是执行;phospho-p38被积极的数量评估染色细胞在肺部和得分为0,表示没有积极染色细胞部分;1,表示强烈的一至五节细胞的染色;2,表示强烈的5至10节细胞的染色;3,表示强烈的10到15节细胞的染色;4,表示强烈的超过15细胞染色部分。使用半定量的规模,肺泡壁厚是得分。
样品分析。在描述的研究,使用磷酸盐落下帷幕了。BAL流体从上层清液离心分离细胞。BAL细胞识别为中性粒细胞和巨噬细胞使用标准形态的技术,和巨噬细胞的身份被确认通过使用coexpression CD45和F4/80。cytospin准备后,细胞形态测量学标准用于中性粒细胞和巨噬细胞的识别。BAL KC(引发的直接同源)量化了酶联免疫吸附试验(研发系统、明尼阿波利斯、MN),总BAL蛋白质是由bicinchoninic酸测定从皮尔斯以组件形式提供化学(罗克福德,IL)。肺的sd - 282研究收获为rt - pcr对cox - 2和il - 6转录水平的评价。
信使rna水平(实时rt - pcr)测定。实时rt - pcr是一个两步的方式来进行。互补脱氧核糖核酸合成和实时检测在ptc - 100进行了热循环(MJ研究,沃尔瑟姆,MA)和ABI棱镜7900序列检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA),分别。随机五个一(试剂盒,瓦伦西亚,CA)被用来生成cDNA从200 ng的RNA应用生物系统公司用户公告2中所述。TaqMan普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司)是用于随后的PCR反应根据制造商的协议。相对定量基因表达都使用了相对标准曲线的方法。所有实时rt - pcr反应进行了一式三份。表达水平正常化18 s rRNA。Sequence-specific引物和探针设计使用底漆Express版本2软件(应用生物系统公司)cox - 2, 5′-CCAGCACTTCACCCATCAGTT-3′,反向5′-GTCCACTCCATGGCCCAGT-3′, 5′6调查fam-agatcataagcgaggacctgggttcacc-tamra-3′;il - 6,向前5′-CTCGGCAAACCTAGTGCGTTA-3′、反向5′-ACAGGATATATTTTCTGACCACAGTGA-3′, 5′6 fam-cctaagcatatcagtttgtggacattc-tamra-3调查′;,18岁,5′-GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG-3′,反向5′-CATTCTTGGCAAATGCTTTCG-3′,探针5′6 fam-accggcgcaagacggaccagtamra-3′。
统计分析。学生的t测试或非参数Mann-Whitney或方差分析与Bonferroni使用多重比较检验,在适用情况下,确定组织之间的显著差异。时被认为是具有统计学意义的差异p< 0.05。所有统计分析都使用Prism 3.02版本(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。
结果
有限合伙人的研究
地塞米松抑制LPS引起的肺嗜中性的挑战。确认的口服抗炎疗效地塞米松在0.3毫克/公斤肺部炎症模型,这个剂量是评估行业标准的鼠标LPS模型。24小时与LPS i.n.挑战后,明显肺嗜中性反应是诱发支气管肺泡灌洗。这显著地抑制了嗜中性口服地塞米松在0.3毫克/公斤(图2),确认这个剂量是适合使用在TS的研究。低剂量有明显的抑制作用与有限合伙人的反应,但他们不是用于TS研究报道,因为他们比的影响在0.3毫克/公斤(数据没有显示)。
预防研究
sd - 282但不是地塞米松预防肺部炎症在预防性治疗模式。连续11天暴露小鼠TS导致肺部炎症测量24小时后最后的烟雾暴露,就是明证增加中性粒细胞(147倍)和巨噬细胞(9倍)支气管肺泡灌洗。烟草烟雾也诱导小但显著增加蛋白质和KC恢复BAL的水平。口服预处理与sd - 282(90毫克/公斤b.i.d。)在1 h和TS曝光后6 h(1和+ 6 h)的11天有效减少烟雾暴露引起的肺部炎症的所有指标(>与vehicle-treated动物相比减少50%;p< 0.01)(表1)。sd - 282在90毫克/公斤治疗也与mRNA水平相比显著减少促炎il - 6基因smoke-exposed车辆(IL-6/18S:空气,1.0±0.51;车,1.18±0.47;和sd - 282, 0.69±0.22;p< 0.01)。cox - 2的表达水平降低与smoke-exposed车辆相比,但变化并不显著(COX-2/18S:空气,1.00±0.41;车,1.16±0.41;和sd - 282, 0.90±0.31)。相比之下的抑制与预防性治疗sd - 282 (表1),口服地塞米松治疗(0.3毫克/公斤b.i.d)未能显著抑制炎症标记物的测量(表1)。大剂量地塞米松不能追究,因为剂量大于0.3毫克/公斤管理连续11天每天两次造成显著的减肥。
治疗的研究
TS 5或11天导致炎症反应,测量24小时后最终的接触。肺部炎症反应后11天吸烟明显大于5天后暴露对巨噬细胞和中性粒细胞数量的增加BAL (图3;表3),这表明有进展的程度与接触TS增加炎症反应,是通过增加每日暴露的持续时间和增加的天数,动物接触。TS暴露11天也诱导增加BAL KC的水平和一个小但是统计上显著的增加蛋白质(尽管不是统计不同于那些见过5天的接触)。Phospho-p38染色在巨噬细胞和II型上皮细胞也观察到在TS-exposed / vehicle-treated组与空气接触相比对照组(数据所示图7)。
sd - 282剂量依赖性逆转肺部炎症治疗治疗模式。治疗治疗小鼠和sd - 282在30或90毫克/公斤6到11天剂量依赖性逆转所有炎症参数测量,包括BAL接触烟草烟雾引起的蛋白质和KC为11天(表2)。此外,sd - 282显著降低cox - 2和il - 6转录水平与smoke-exposed车辆控制(图4)。
sd - 282但不是地塞米松逆转肺部炎症治疗治疗模式。TS-induced增加巨噬细胞11天之后被59%的sd - 282治疗组与车辆组相比,值得注意的是,巨噬细胞的数量在sd - 282治疗组相似的巨噬细胞数量的动物暴露在烟雾中5天(基线)。这表明sd - 282治疗减少了巨噬细胞的号码出现在药物治疗的开始。数据显示在90毫克/公斤,sd - 282治疗地塞米松在0.3毫克/公斤表3。TS诱导中性粒细胞增加11天之后抑制了90%在sd - 282治疗组相比,汽车集团和小于五TS曝光后在基线。因此,治疗治疗sd - 282减少巨噬细胞和中性粒细胞数量回到基线炎症反应后5天暴露在TS。相比之下,与地塞米松治疗治疗未能降低炎症参数BAL的任何显著的方式(表3)。地塞米松但不是sd - 282相比,体重造成重大损失的汽车集团。这种效应的类固醇在动物被描述之前,不是意外(马et al ., 2003)(图5),表明在等离子体接触足以有副作用没有疗效观察。组织学评价肺部分显示炎症反应组成的巨噬细胞和中性粒细胞增多和增强的细支气管壁增厚和粘蛋白染色,和这些特性显著减少治疗剂量与sd - 282 (图6)。Phospho-p38位于肺ⅱ型上皮细胞和巨噬细胞渗透。sd - 282在90毫克/公斤显著降低phospho-p38 MAPK表达在上皮细胞和巨噬细胞(图7)。
讨论
p38αMAPK的MAPK的家庭成员结构相关激酶表达的多种细胞类型,包括炎症细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B和CD4细胞+T细胞和内皮细胞。p38α激活MAPK的氧化损伤、缺血等诱发的细胞压力(李et al ., 1994;獾et al ., 1996;韩新,1998)。作为不可分割的一部分,白细胞激活在急性和慢性炎症状态,p38αMAPK介导促炎细胞因子的生产(李et al ., 1994;獾et al ., 1996;新汉,1998;Medicherla et al ., 2006 a)。的选择性抑制剂p38αMAPK, sd - 282块的合成体外肿瘤坏死factor-α,血管内皮生长因子,il - 6, cox - 2, IL-1β以及减少肿瘤坏死factor-α活动(Lim et al ., 2004)。所有的这些介质在肺部炎症被认为发挥重要作用。治疗sd - 282在本研究中使用的剂量曾被证明在cytokine-driven显著降低疾病进展为慢性关节炎动物模型(Medicherla et al ., 2006 a)。
在标准LPS-induced肺嗜中性模型中,口服地塞米松在0.3毫克/公斤,从文学,预计将减少了73%的球炎症。使用的剂量是最低的口服剂量,有超过50%的抑制作用,并因此被视为适用于TS的研究。
在目前COPD的小鼠炎症模型,BAL和组织学评价肺部分暴露于TS 11天之后显示炎症反应组成的巨噬细胞和中性粒细胞增多和增强粘蛋白染色。Phospho-p38染色在巨噬细胞和II型上皮细胞也被观察到。预防性治疗模式,说明了sd - 282的抗炎活性的抑制巨噬细胞和中性粒细胞大量招聘,这是与减少BAL水平相关的蛋白质和KC。相比之下,地塞米松给予预防性未能显著抑制任何TS-induced增加炎症标记物。治疗治疗sd - 282减少巨噬细胞和中性粒细胞数量恢复到基线水平。此外,sd - 282剂量依赖性降低烟雾诱发cox - 2和il - 6的转录水平预防或治疗模式。抗炎功效的sd - 282在这个模型中类似于其他p38抑制剂的影响在急性肺损伤的模型(Arcaroli et al ., 2001;徐et al ., 2005)。然而,它还没有专门建立了sd - 282如何发挥其抗炎作用在细胞招聘这个模型。这些影响可能是直接由影响细胞趋化作用或通过减少炎症趋化因子激活细胞的释放。支持后者减少BAL KC sd - 282水平,这可能发挥作用在BAL嗜中性粒细胞减少的数字。缺乏剂量依赖的两剂sd - 282可能反映了24小时时间点后TS暴露在这项研究中使用。KC释放高峰出现在4和6 h后TS曝光,而细胞数量在最大曝光后24小时。需要进一步的研究来探讨剂量依赖的KC应对p38激酶抑制地图。然而,它是可能的,抗炎活动中观察到这种模式是由于组合的结果p38 MAP激酶抑制的结果。相比之下,与地塞米松治疗治疗未能减少任何炎症参数以显著的方式落下帷幕。BAL嗜中性的增强作用地塞米松是一个有趣的观察,这类似于在COPD患者的肺活检吸入fluticasone (考克斯1995年;米格尔et al ., 1996;Gizycki et al ., 2002)这些研究地塞米松的这种效应可能反映了延迟凋亡中性粒细胞的地塞米松,所观察到的影响体外(Zhang et al ., 2001)。
类固醇的相对不敏感这一模式是类似报道似乎在患者抗炎作用有限,依赖于剂量和治疗持续时间(氮化镓et al ., 2005)。此外,相对缺乏类固醇的疗效研究报告是在其他报告类似的COPD动物模型(博雷尔et al ., 2005;勒克莱尔et al ., 2006),这可能反映了TS暴露组蛋白脱乙酰酶活动的影响(巴恩斯2005 b)。在老鼠中,高剂量的地塞米松(10毫克/公斤)适度抑制嗜中性TS引起烟雾暴露,而在PDE4抑制剂,cilomilast,大大降低了这种反应的剂量范围(Grootendorst et al ., 2005)。
最广泛的抗炎机制研究在慢性阻塞性肺病是PDE4抑制动物模型。Roflumilast,目前在三期慢性阻塞性肺病,已表现出抑制TS-induced炎症小鼠和豚鼠和防止肺气肿发展在老鼠身上Martorana et al ., 2005)。这个效果类似于sd - 282年报道,并支持评估p38激酶抑制剂临床地图。在COPD患者中,roflumilast也已被证明能够降低痰炎症生物标记,包括中性粒细胞,治疗4周后,这表明炎症在慢性阻塞性肺病不是所有疗法(耐火材料勒克莱尔et al ., 2006)。尽管承诺数据与PDE4抑制剂,没有药物的作用机理尚未被批准用于慢性阻塞性肺病,和寻找有效的抗炎治疗慢性阻塞性肺病药物发现行业仍然是一个主要研究目标(戟et al ., 2006)。
sd - 282细胞积累的影响在这个炎症模型与数据在小鼠哮喘模型,p38激酶抑制剂地图无法抑制antigen-induced嗜酸性粒细胞(Chialda et al ., 2005;Nath et al ., 2006),这表明抑制激酶可能不是一个有效的方法来针对哮喘炎症。这种差异的原因还不清楚,值得进一步研究。
总之,我们报告一个p38激酶抑制剂α-selective地图,sd - 282,显著降低TS-induced预防性或治疗模型中炎症反应时,地塞米松是无效的。这是第一个证据表明p38激酶抑制剂地图可以发挥抗炎治疗的肺的活动设置,建立地图p38激酶抑制剂在慢性阻塞性肺病的治疗潜力。
脚注
文章、出版日期和引文信息可以发现http://jpet.aspetjournals.org。
doi: 10.1124 / jpet.107.127092。
缩写:慢性阻塞性肺病,慢性阻塞性肺疾病;PDE,磷酸二酯酶;MAPK、增殖蛋白激酶;地图,增殖作用;TS,烟草烟雾;sd - 282, indole-5-carboxamide (ATP-competitive p38激酶抑制剂);sb - 202190, 4 - (4-fluorophenyl) 2 - (4-hydroxyphenyl) 5 - (4-pyridyl) 1H咪唑;考克斯,环氧酶;有限合伙人,脂多糖;i.n。,intranasal; PBS, phosphate-buffered saline; BAL, bronchoalveolar lavage; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; IL, interleukin; FAM, 5-carboxyfluorescein; TAMRA, 6-carboxytetramethylrhodamine; KC, keratinocyte-derived chemokine.
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- 收到了2007年6月28日。
- 接受2007年11月28日。
- 美国社会的药理学和实验性疗法