文摘gydF4y2Ba
EPI-hNE4 (depelstat)是一种人类的有效抑制剂源自人类inter-α-trypsin中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂和旨在控制多余的蛋白水解活性在囊性纤维化患者的痰。我们分析了其抗蛋白水解作用很可能遇到体内炎症地点。由中性粒细胞矩阵metalloproteases EPI-hNE4抵抗水解(MMPs)和丝氨酸蛋白酶释放激活中性粒细胞炎性肺分泌物,包括MMP-8和MMP-9, elastase-related蛋白酶3和组织蛋白酶g .它还拒绝肺上皮细胞降解MMP-7但被分解gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Bametalloelastase pseudolysin,当用于纯化系统,但当这个蛋白酶与中性粒细胞弹性蛋白酶的克分子数相等的金额。我们也调查了EPI-hNE4的抑制性能的表面净化血液中性粒细胞和囊性纤维化患者的痰中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在可溶性和凝胶阶段。中性粒细胞弹性蛋白酶的表面完全被EPI-hNE4和可溶性复合物形成的。囊性纤维化痰上层清液的弹性蛋白酶抑制EPI-hNE4化学计量量,使滴定的蛋白酶。但抑制的比例在整个痰匀浆不同从50 - 100%,根据样品测试。EPI-hNE4迅速胃蛋白酶消化蛋白酶劈裂体外。因此,EPI-hNE4似乎是一个弹性蛋白酶抑制剂适用于治疗囊性纤维化患者的气溶胶。gydF4y2Ba
反复发作的炎症和感染,发生在囊性纤维化(CF)导致肺功能下降,呼吸衰竭,最终死亡。许多激活的中性粒细胞进入CF呼吸道液体,他们参与病原体宿主防御和导致慢性炎症和肺破坏(gydF4y2Ba夏皮罗,2002gydF4y2Ba)。中性粒细胞炎症网站招募了丝氨酸蛋白酶释放活性氧和活跃,其中一个,中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),直到现在产生了最大的利益。中性粒细胞释放相关的丝氨酸蛋白酶,蛋白酶3 (Pr3)和组织蛋白酶G(猫G),所以,整个蛋白水解活性击溃了细胞外抑制剂在CF肺。放任自流HNE和相关蛋白酶降解细胞外基质分子(gydF4y2Ba欧文和坎贝尔,1995gydF4y2Ba)。HNE还参与多种功能,延长炎症反应,使其抗炎化合物一个有吸引力的目标。HNE负担刺激引发生产和肺渗透率interendothelial退化和interepithelial结蛋白,从而促进持续招募中性粒细胞和轮回(综述gydF4y2Ba莫拉et al ., 2003gydF4y2Ba)。HNE也是一个有效的促分泌素,导致航空公司成为插入CF (gydF4y2BaFahy et al ., 1992gydF4y2Ba)。最后,它损害mucocilia功能(gydF4y2Babaillie gifford et al ., 1997gydF4y2Ba)和减少凋亡中性粒细胞的吞噬作用被裂开的磷脂酰丝氨酸在巨噬细胞受体(gydF4y2BaVandivier et al ., 2002gydF4y2Ba),从而加剧了有缺陷的细胞间隙和粘液。gydF4y2Ba
已经几次使用自然和重组蛋白抑制剂antiproteases治疗肺部炎症的CF (McElvaney et al .,gydF4y2Ba1991年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba1992年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGriese et al ., 2001gydF4y2Ba)。合成antielastase酰基酶抑制剂等分子和过渡态抑制剂也被测试(gydF4y2BaOhbayashi 2002gydF4y2Ba),但是没有还没有获得令人满意的结果,因为合成抑制剂的毒性和副作用或体内的蛋白质分子的不适合使用(gydF4y2BaKonstan和戴维斯,2002年gydF4y2Ba;gydF4y2BaChughtai baillie gifford, 2004gydF4y2Ba)。然而,大多数的抑制剂检测有好处,鼓励进一步的研究(gydF4y2BaChughtai baillie gifford, 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
EPI-hNE4 (dx - 890)是一种低分子质量(6237 Da)抑制剂的发现和获得专利的HNE Dyax集团(Cambridge, MA)。这是使用噬菌体展示工程(gydF4y2Ba罗伯茨et al ., 1992gydF4y2Ba)和表达gydF4y2Ba毕赤酵母属pastorisgydF4y2Ba。它来源于第二Kunitz域的轻链(bikunin)人类天然的蛋白酶抑制剂,inter-α-trypsin抑制剂(残留285 - 340;加入Swiss-Prot PO2760数量),在五个不同位置(gydF4y2Ba比彻et al ., 2006gydF4y2Ba)。更换关键P1参数gydF4y2Ba297年gydF4y2Ba残留的Ile残留所带来的中性粒细胞弹性蛋白酶的专一性,使它一个强有力的HNE抑制剂gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba值为5.45×10gydF4y2Ba-12年gydF4y2Ba米和gydF4y2BakgydF4y2Ba在gydF4y2Ba8×10的价值gydF4y2Ba6gydF4y2Ba米gydF4y2Ba1gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(gydF4y2BaDelacourt et al ., 2002gydF4y2Ba)。它对HNE保护大鼠的肺和CF痰可溶性部分灌输到给定的气管内的或注射时气管。(gydF4y2BaDelacourt et al ., 2002gydF4y2Ba);它还保护大鼠的肺对重复伤害(gydF4y2Ba欧诺瑞et al ., 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们之前显示EPI-hNE4保留其抑制能力在雾化(gydF4y2BaGrimbert et al ., 2003gydF4y2Ba)。我们现在化验其抵抗这些蛋白酶会遇到体内时作为气溶胶。这些测试使用相关的丝氨酸蛋白酶HNE (Pr3和猫G)和矩阵metalloproteases (MMP-8和MMP-9)分泌激活中性粒细胞或坏死细胞释放炎性网站,MMP-7,矩阵metalloprotease溶胶原的活动释放肺上皮细胞和细菌metalloprotease pseudolysin分泌gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba。我们也测试的能力EPI-hNE4抑制膜结合HNE表面的净化整个CF痰中性粒细胞和HNE因为痰弹性蛋白酶存在可溶性和异构凝胶阶段。最后,我们决定在EPI-hNE4胃蛋白酶的影响,因为雾化药物迅速到达消化道。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
材料。gydF4y2Ba从Debiopharm S.A. EPI-hNE4得到(瑞士洛桑)。人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(EC 3.4.21.37)、蛋白酶3 (EC 3.4.21.76),αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba从雅典-π,antichymotrypsin得到研究和技术(雅典,GA)。组织蛋白酶G (EC 3.4.21.20)是从ICN制药(法国奥赛的)。MMP-7 (EC 3.4.24.33), proMMP-8 (EC 3.4.24.34), proMMP-9 (EC 3.4.24.35),及其各自fluorogenic基质dinitrophenyl-RPLALWRS-OH, dinitrophenyl-PLAYWAR-OH, dinitrophenyl-PLGMWSR-OH来自Calbiochem (VWR,斯特拉斯堡,法国)。Pseudolysin (EC 3.4.24.26)请提供教授Jean瓦拉赫(大学克劳德·伯纳德,里昂,法国)或购买从Calbiochem (VWR)。猪胃蛋白酶(EC 3.4.23.1),牛胰蛋白酶(EC 3.4.21.4),gydF4y2BaNgydF4y2Ba-chlorosuccinimide, peroxidase-coupled山羊anti-rabbit-IgG来自σ(圣昆汀Fallavier法国)。Lymphoprep和PBS钙和镁是英杰公司(英国佩斯利)。gydF4y2Ba
病人。gydF4y2Ba痰液样本收集从12知情同意后成人CF患者慢性感染gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba。获得伦理委员会批准的机构。gydF4y2Ba
痰标本的处理。gydF4y2Ba样本均质在10毫米PBS, pH值7.4 (3 ml / g痰里)和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟在4°C。颗粒悬浮在PBS,和上层清液离心10分钟,享年20000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba进行进一步分析。gydF4y2Ba
隔离的血液中性粒细胞。gydF4y2Ba人类中性粒细胞从健康的志愿者,谁给了他们的知情同意,纯化基本上如前所述(gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2005gydF4y2Ba)。底部的中性粒细胞恢复Lymphoprep梯度的悬浮在200μl PBS。红细胞被放置在5毫升细胞溶解的无菌蒸馏水20年代;渗透性恢复通过添加5毫升的2×集中包含8毫米EGTA PBS。暂停然后离心机,享年500岁gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟25°C。嗜中性粒细胞颗粒在PBS包含4 mM EGTA洗两次,悬浮在这个缓冲区和中性粒细胞约3×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba细胞/μl与温和搅拌室温保存。最后的颗粒悬浮被直接显微观察评估包括中性粒细胞> 99%。这是使用几小时的净化。gydF4y2Ba
HNE化验。gydF4y2Ba免费HNE活动以37°C 50 mM消息灵通的缓冲区,pH值7.4,0.75 M氯化钠,0.05% Igepal ca - 630 (v / v)使用荧光共振能量转移肽底物Abz-APEEIMRRQ-EDDnp (gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba)。HNE与α滴定gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π的效价,这已经确定用牛胰蛋白酶滴定gydF4y2BapgydF4y2Ba-nitrophenyl -gydF4y2BapgydF4y2Ba-guanidinobenzoate。所有HNE浓度报道整个文本指的活性蛋白酶反应混合物。Abz-peptidyl-EDDnp底物的水解之后通过测量荧光在λgydF4y2Ba前女友gydF4y2Ba= 320 nm和λgydF4y2Ba新兴市场gydF4y2Ba= 420 nm日立f - 2000荧光谱仪。系统使用Abz-FR-OH标准化准备从总Abz-FR -胰蛋白酶水解gydF4y2BapgydF4y2Ba-nitroanilide解决方案;其浓度测定的吸光度在410 nm,假设ϵgydF4y2Ba410海里gydF4y2Ba= 8800gydF4y2Ba1gydF4y2Bacm -gydF4y2Ba1gydF4y2Ba为gydF4y2BapgydF4y2Ba硝基苯胺。Abz-peptidyl-EDDnp底物的浓度测量吸光度的测定使用ϵ365海里gydF4y2Ba365海里gydF4y2Ba= 17300gydF4y2Ba1gydF4y2Ba厘米gydF4y2Ba1gydF4y2BaEDDnp。膜结合HNE活动量化比较的水解速度与滴定Abz-APEEIMRRQ-EDDnp HNE不用洗涤剂的缓冲区中(10毫米PBS, pH值7.4)28°C。gydF4y2Ba
滴定HNE用于滴定股票的解决方案(10毫克/毫升10毫米醋酸缓冲,pH值4.0)EPI-hNE4。100倍稀释的一个30μl EPI-hNE4原液在50 mM消息灵通的缓冲区,pH值7.4,150毫米氯化钠,孵化了一个常数(10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米决赛)300年HNEμl反应缓冲10分钟37°C。剩余HNE活动测量通过添加5μl衬底(15μM决赛)。EPI-hNE4摩尔浓度计算值的等值点(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba/gydF4y2BaEgydF4y2Ba摩尔比率= 1)。gydF4y2Ba
EPI-hNE4 HNE-Related抑制中性粒细胞丝氨酸蛋白酶。gydF4y2Ba自由Pr3和猫G与α滴定gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π和αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba分别-antichymotrypsin (gydF4y2BaAttucci et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba)。活动以50 mM消息灵通的缓冲区,pH值7.4,0.75 M氯化钠,0.05% (v / v)为Pr3 Igepal ca - 630和50 mM消息灵通的缓冲区,pH值7.4,0.1 M氯化钠,0.01% (v / v)猫Igepal ca - 630 G,使用专门的Abz-VADCADQ-EDDnp和Abz-TPFSGQ-EDDnp Pr3劈裂和猫G,分别为(gydF4y2BaAttucci et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Pr3猫或G (10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米决赛)孵化10分钟37°C的浓度EPI-hNE4抑制剂/ 100蛋白酶摩尔比率。每个蛋白酶的剩余活动测量。Pr3的影响和猫G在抑制HNE EPI-hNE4 subsaturating浓度的测试EPI-hNE4 ([EPI-hNE4] / [HNE] = 0.75)使用蛋白酶的克分子数相等的浓度(4.7×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米决赛)。gydF4y2Ba
电阻EPI-hNE4主机和细菌Metalloproteases。gydF4y2BaProMMP-8和proMMP-9被激活(gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba),MMP-8的活动和MMP-9 (10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米决赛)测定20μM(最终)dinitrophenyl-PLAYWAR-OH dinitrophenyl-PLGMWSR-OH fluorogenic基质,分别MMP的缓冲区(50毫米Tricine, pH值7.5,0.2 M氯化钠,CaCl 10毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,50μM ZnClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在37°C)。MMP-7活动测量20μM(最终)dinitrophenyl-RPLALWRS-OH HNE-Pr3缓冲区在37°C。在10 Pseudolysin活动测量gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(最终)浓度与15μM(最终)fluorogenic衬底Abz-VADCAPQ-EDDnp HNE-Pr3缓冲区在37°C。gydF4y2Ba
MMP-7、MMP-8 MMP-9和pseudolysin (10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba8gydF4y2Ba用2×10米决赛)孵化gydF4y2Ba6gydF4y2BaM EPI-hNE4,各自活动的缓冲区,在30分钟37°C。混合物进行调整,这样的最终浓度EPI-hNE4 2×10gydF4y2Ba8gydF4y2BaM和化验对HNE的克分子数相等的金额。HNE当时的剩余活动测量。gydF4y2Ba
的可能影响metalloproteases对HNE EPI-hNE4绑定被混合克分子数相等的金额(10检查gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米)每个metalloprotease HNE和孵化混合10gydF4y2Ba8gydF4y2BaM EPI-hNE4。剩余HNE活动测量和比较与没有metalloprotease混合物。gydF4y2Ba
的敏感性HNE-EPI-hNE4复杂降解每个metalloprotease化验如下。克分子数相等的金额(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba米)HNE和EPI-hNE4孵化10分钟37°C,然后10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(最终)metalloprotease为30分钟37°C。剩余HNE活动测量。gydF4y2Ba
EPI-hNE4治疗gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Chlorosuccinimide。gydF4y2BaEPI-hNE4和αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π(控制)处理gydF4y2BaNgydF4y2Ba-chlorosuccinimide (gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2005gydF4y2Ba)。的抑制能力和原生形式的抑制剂是治疗化验孵化后克分子数相等的金额(10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米)HNE 10分钟37°C。gydF4y2Ba
抑制HNE EPI-hNE4净化血液中性粒细胞表面的。gydF4y2Ba膜结合的抑制HNE (mHNE) EPI-hNE4测量通过孵化净化血液中性粒细胞的数量调整,积极HNE 2×10的浓度gydF4y2Ba9gydF4y2BaM (1 - 5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞),EPI-hNE4的克分子数相等的金额。纯化中性粒细胞或纯化蛋白酶(控制)孵化15μM Abz-APEEIMRRQ-EDDnp在聚丙烯微型板块井选择的绑定属性低(删除stylus薄壁微型板块;乔丹的研究中,沃尔瑟姆,MA)。荧光记录之前使用一个微型板块荧光读者(光谱马克斯双子座;分子器件、桑尼维尔CA)在连续搅拌。抑制时间曲线记录使用克分子数相等的大量EPI-hNE4和膜结合HNE (2×10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba米决赛)。抑制剂和底物同时添加到中性粒细胞。gydF4y2Ba
mHNE-EPI-hNE4复合物的命运进行了分析通过孵化50倍的中性粒细胞(10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba化学计量的EPI-hNE4 mHNE) (gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2005gydF4y2Ba在室温下)5分钟。悬架是离心机,分析了上层清液SDS-polyacrylamide凝胶电泳nonreducing条件下为0.02% (w / v) SDS在示例缓冲区。蛋白质被涂抹上硝基和检测兔多克隆抗体anti-EPI-hNE4(1:1000)和peroxidase-coupled山羊anti-rabbit-IgG (1:15,000)。检测进行的ECL工具包(Amersham淀粉微球的生物技术、奥赛、法国)。gydF4y2Ba
抑制HNE EPI-hNE4痰液样本。gydF4y2Ba整个痰痰匀浆和上层清液的量进行调整,以便积极HNE浓度反应介质是10gydF4y2Ba8gydF4y2Bam .样本孵化与一系列EPI-hNE4浓度在PBS 10分钟28°C,和残余HNE活动是化验。gydF4y2Ba
交互EPI-hNE4与胃蛋白酶。gydF4y2BaEPI-hNE4 (1.35×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米决赛)与5.6×10孵化gydF4y2Ba6gydF4y2Ba猪胃蛋白酶在100 mM柠檬酸缓冲,pH值4.1,在37°C;整除分别在不同时期对其抑制能力HNE:[弹性蛋白酶(E)] =[抑制剂(I)] = 3.6×10gydF4y2Ba8gydF4y2Bam .分解产物进行了分析通过反相高效液相色谱法(gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
阻力EPI-hNE4蛋白酶3和组织蛋白酶G蛋白水解作用。gydF4y2BaHNE是最好的研究的三个中立丝氨酸蛋白酶主要存储在中性粒细胞颗粒,但猫Pr3 G也分泌,激活细胞,存在于肺分泌物(gydF4y2Ba苏特et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2BaWitko-Sarsat et al ., 1999gydF4y2Ba)。因为HNE Pr3,猫G可以争夺衬底和/或抑制剂结合生理、我们首先测量了每一种纯化蛋白酶的抑制作用在不同的抑制剂/ EPI-hNE4蛋白酶摩尔比率。HNE (10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米)完全被EPI-HNE4的克分子数相等的金额,在协议的低gydF4y2BaKgydF4y2Ba我gydF4y2Ba这种交互(gydF4y2BaDelacourt et al ., 2002gydF4y2Ba),但是猫Pr3 G没有显著抑制在这些条件下,甚至100倍摩尔过剩的抑制剂(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
因为猫Pr3 G没有被EPI-hNE4,我们检查他们没有干扰抑制剂结合HNE当所有三个蛋白酶在CF痰。我们测量了抑制的HNE EPI-hNE4的克分子数相等的数量的猫Pr3 G (gydF4y2Ba图2gydF4y2BaHNE),调整浓度和抑制EPI-hNE4获得75%。EPI-hNE4的抑制能力没有明显改变了Pr3猫或g两种蛋白酶水解抑制剂,即使经过长时间孵化;抑制剂的高效液相色谱配置文件保持不变5 h后37°C(没有显示)。因此,猫Pr3 G不会改变的能力EPI-hNE4抑制HNE当所有三个蛋白酶存在炎症生物流体。gydF4y2Ba
电阻的EPI-hNE4内生Metalloproteases Pseudolysin, MetalloproteasegydF4y2Ba铜绿假单胞菌。gydF4y2Ba天然抑制剂的蛋白水解失活导致肺部炎症的protease-antiprotease不平衡(gydF4y2Ba莫拉et al ., 2003gydF4y2Ba)。中性粒细胞metalloproteases MMP-8 MMP-9,上皮MMP-7,细菌metalloprotease pseudolysingydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba是可以分解的主要蛋白酶抑制剂在CF痰。我们EPI-hNE4孵化(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba与10米)gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba8gydF4y2BaM这些metalloproteases浓度为30分钟37°C和测量的剩余活动HNE孵化与克分子数相等的金额(2×10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba米决赛)抑制剂治疗。EPI-hNE4完全抵抗所有的蛋白酶除了pseudolysin,降级使用时大约50%的抑制剂在10gydF4y2Ba8gydF4y2Bam .假设这个pseudolysin浓度可以出现在肺分泌物,我们孵化克分子数相等的大量HNE和pseudolysin (10gydF4y2Ba8gydF4y2Ba添加抑制剂之前米)。EPI-hNE4仍然完全活跃在这些条件下由于其快速绑定HNE和复杂的抗metalloprotease退化。使用MMP-7得到相同的结果,MMP-8, MMP-9蛋白酶竞争。gydF4y2Ba
抗氧化。gydF4y2Ba肺分泌物与天然蛋白酶抑制剂对氧化敏感,因为他们都有一个可氧化的methionyl残留在位置P1或P1′的抑制循环(gydF4y2Ba罗森博格et al ., 1984gydF4y2Ba;gydF4y2BaHeinzel-Wieland et al ., 1991gydF4y2Ba;gydF4y2Ba舒斯特尔et al ., 1996gydF4y2Ba),EPI-hNE4没有遇到渣以后,可能会改变其抑制特性。尽管如此,我们检查其抗氧化剂通过比较失活的抑制与α的属性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π孵化后gydF4y2BaNgydF4y2Ba-chlorosuccinimide。EPI-hNE4仍然完全活跃,而αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π失去了它所有的抑制能力。肺部炎性分泌物的氧化环境,因此不太可能影响EPI-hNE4活动。gydF4y2Ba
抑制血液中性粒细胞的膜结合HNE EPI-hNE4。gydF4y2Ba的一部分发布的丝氨酸蛋白酶激活中性粒细胞炎症地点仍然是绑定到激活或死亡细胞的表面(gydF4y2Ba欧文et al ., 1995gydF4y2Ba;gydF4y2Ba坎贝尔et al ., 2000gydF4y2Ba)。任何抗炎治疗,使用抑制剂必须确保抑制剂,抑制活性蛋白酶,可以降解细胞外基质成分或其他目标蛋白质。我们测量了抑制mHNE EPI-hNE4使用净化血液中性粒细胞。自由HNE和mHNE (2×10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba米决赛)被抑制了由化学计量的EPI-hNE4以同样的速度(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。因此,mHNE是完全可访问的抑制剂,并没有其他目标为EPI-hNE4蛋白酶嗜中性粒细胞表面。我们还表明,mHNE没有留在细胞后的细胞表面与EPI-hNE4被孵化。西方滴细胞上清液离心后获得抑制剂中性粒细胞悬架(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)表明,EPI-hNE4形成可溶性复合物,这表明EPI-hNE4删除绑定蛋白酶从细胞表面,α一样gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π(gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2005gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
抑制HNE在EPI-hNE4 CF痰。gydF4y2BaHNE活动在整个痰匀浆12患者长期殖民gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba在痰上层清液和悬浮颗粒测量使用Abz-APEEIMRRQ-EDDnp作为底物(gydF4y2BaKorkmaz et al ., 2004gydF4y2Ba)。浓度分别为0.4,4.9×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米(平均2.3×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米),0.2 - 3.6×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米(平均1.3×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米),0.4到4.6×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米(平均2.9×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba米)。总HNE活动分次痰总是高于原油痰,表明隔离HNE分子被释放颗粒悬浮时的缓冲区。痰的HNE上层清液的样品被化学计量的EPI-hNE4完全抑制,表明抑制剂没有其他目标分子的痰液可溶性部分(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。然而,抑制在整个痰不同从50 - 100%,取决于所使用的样本(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。这表明要么EPI-hNE4被身份不明的组件部分灭活(s)在一些样品或者HNE分区的痰样本不同,部分被困和抵抗抑制。这个分区同意发现总HNE活动上层清液+颗粒分数高于原油匀浆。我们还表明,EPI-hNE4稳定原油痰匀浆:多余的抑制剂与匀浆的孵化HNE活动被EPI-hNE4化学计量的抑制。任何多余EPI-hNE4当时与纯化HNE滴定。EPI-hNE4仍充分活跃在这些条件下(没有显示),表明痰中没有改变其抑制特性,它可能仍然是完全积极的体内。gydF4y2Ba
交互EPI-hNE4与胃蛋白酶。gydF4y2BaCF患者患有外分泌胰腺功能不全,这削弱了脂肪和蛋白质的消化。药物迅速到达消化道气溶胶后管理。因此,积极EPI-hNE4由气溶胶可能暴露在胃蛋白酶。因此,我们分析了其HNE-inhibiting能力孵化后胃蛋白酶。抑制剂(1.35×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba米)完全灭活的孵化与胃蛋白酶(5.6×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba米)在37°C(30分钟gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。分馏相应的混合物通过反相高效液相色谱法显示完整的蛋白质水解的本机EPI-hNE4 (gydF4y2Ba图5 BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
CF肺部炎症和感染的特点是周期,渐进破坏的组织和肺功能的丧失。因为炎症发生在生命的早期,可能之前致病性感染(gydF4y2Ba德罗斯,2002gydF4y2Ba),其早期控制可以CF治疗的一个关键因素。然而,经典的抗炎分子,包括布洛芬口服皮质类固醇和高剂量,副作用,限制他们使用(gydF4y2BaKonstan和戴维斯,2002年gydF4y2Ba)。恢复protease-antiprotease平衡的蛋白酶抑制剂(McElvaney et al .,gydF4y2Ba1991年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba1992年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGriese et al ., 2001gydF4y2Ba)是一个不错的选择,因为大量的多形核白细胞激活CF肺细胞外蛋白酶的浓度显著增加,特别是HNE (gydF4y2Babir et al ., 1994gydF4y2Ba)。这些逃离控制的天然抑制剂、αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π,SLPI和弹力素抑制剂通过蛋白质水解和氧化(灭活gydF4y2Ba1991年苏特和舍瓦gydF4y2Ba;gydF4y2Babir et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2Ba舒斯特尔et al ., 1996gydF4y2Ba)。自然和重组蛋白抑制剂已经在CF患者(McElvaney et al .,gydF4y2Ba1991年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba1992年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGriese et al ., 2001gydF4y2Ba),但没有一个满足需求的常规使用CF疗法。以前曾试图调查EPI-hNE4作为治疗的潜在抑制剂已经表明,气管内的或静脉输液管理保护大鼠的肺(gydF4y2BaDelacourt et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba欧诺瑞et al ., 2004gydF4y2Ba)。EPI-hNE4也抵制雾化的物理约束(gydF4y2BaGrimbert et al ., 2003gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
目前的研究表明,EPI-hNE4不是退化HNE-related蛋白酶Pr3和猫G现在和活跃在CF痰。同样,MMP-7 MMP-8 MMP-9,都出现在显著高于正常数量在CF (gydF4y2BaDunsmore et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2BaRatjen et al ., 2002gydF4y2Ba),不裂开EPI-hNE4实验条件下使用。然而,细菌metalloprotease和主要的抗原gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Bapseudolysin,降低EPI-hNE4孵化单独与抑制剂时,但当它与HNE的克分子数相等的浓度。这可能是由于快速HNE-inhibitor复合物的形成,对metalloprotease进一步退化。按照先前的结果(gydF4y2BaVenaille et al ., 1998gydF4y2Ba),我们测量无显著pseudolysin活动慢性CF患者的痰,这表明细菌蛋白酶不会干扰EPI-hNE4活动CF痰。但退化形式的自然antiproteases出现在CF痰(gydF4y2Ba1991年苏特和舍瓦gydF4y2Ba;gydF4y2Babir et al ., 1994gydF4y2Ba)。负责这个的蛋白酶降解尚未确定,尽管体外实验表明,主机和细菌蛋白酶可以分裂αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-πSLPI,改变他们的抑制功能(gydF4y2BaSponer et al ., 1991gydF4y2Ba;gydF4y2BaDesrochers et al ., 1992gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雄et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaRapala-Kozik et al ., 1999gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
药物管理为气溶胶必须抵制氧化炎症地点。在位置遇到- 358 P1的氧化的活性抑制环路αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π(gydF4y2Ba罗森博格et al ., 1984gydF4y2Ba)和满足- 73 P1 SLPI′(gydF4y2BaHeinzel-Wieland et al ., 1991gydF4y2Ba在P1′)和满足25抑弹性酶蛋白(gydF4y2BaZani et al ., 2004gydF4y2Ba)极大地损害他们的antielastase活动和氧化形式的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba蛋白质水解-π和SLPI更敏感比本机抑制剂(gydF4y2BaRapala-Kozik et al ., 1999gydF4y2Ba)。因此,氧化和蛋白水解作用共同促进局部炎症。EPI-hNE4仍然充分活跃的氧化条件下,完全废除αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π活动因为它没有残留在其主要结构。gydF4y2Ba
关键特性的抑制剂用于治疗是否吸入抑制剂可以抑制凝胶phase-entrapped和膜结合蛋白酶,蛋白酶的肺部分泌物中可溶性和凝胶阶段。陈等人。gydF4y2Ba2003年gydF4y2Ba)表明,在可溶性阶段HNE粘液的支气管分泌物的原发性支气管扩张患者不存在一样自由酶但proteolytically超分子复杂的活跃成员,包括乙酰肝素硫酸盐,syndecan-1,其生理监管者αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π和SLPI。HNE也可能被困在中性粒细胞胞外陷阱(gydF4y2BaBrinkmann et al ., 2004gydF4y2Ba)或与macrophage-derived脂质复合物(gydF4y2BaFujita et al ., 1999gydF4y2Ba)。我们发现EPI-hNE4化学计量的抑制HNE绑定到膜净化血液中性粒细胞,形成可溶性EPI-hNE4-HNE复合物稳定。这个化学抑制发生在一些但不是全部的原油痰匀浆,表明,身份不明的,因素参与调控的蛋白水解活性的CF痰的一些人。gydF4y2Ba
然而,低分子量蛋白质抑制剂似乎比高gydF4y2Ba米gydF4y2BargydF4y2Ba在达到蛋白酶抑制剂肺分泌物。这是强调的观察SLPI抑制HNE超分子复合物在痰中可溶部分,而αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π(不gydF4y2Ba陈et al ., 2003gydF4y2Ba)。尽管雾化αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π,然而,显著降低了活性HNE上皮衬液浓度(gydF4y2BaMcElvaney et al ., 1991gydF4y2Ba)和整体蛋白质水解的支气管肺泡灌洗液(gydF4y2BaGriese et al ., 2001gydF4y2Ba)的CF患者,其效果在肺部疾病的恶化CF尚不得而知。抗氧化变异[- 358→Val的αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π(gydF4y2Ba罗森博格et al ., 1984gydF4y2BarSLPI)和(- 73→低浓缩铀,并满足- 73,-82,-94,-96→低浓缩铀)(gydF4y2BaHeinzel-Wieland et al ., 1991gydF4y2Ba)也被构造来抵消氧化的有害影响,但他们尚未在人类。合成化学抑制剂可能是有吸引力的替代控制多余的蛋白质水解,但大多数临床试验已经结束了,因为他们的毒性和副作用(gydF4y2BaChughtai baillie gifford, 2004gydF4y2Ba)。小蛋白抑制剂应该首选CF治疗。gydF4y2Ba
蛋白酶抑制剂用于治疗静脉输液管理或气溶胶。雾化抑制剂可能是更有效地达到肺组织,只要他们抵制雾化的物理化学条件,沉积在上皮细胞表面的航空公司,并且不加重胰腺功能不全的CF患者消化道当多余的到达。重组EPI-hNE4因此似乎是一种很有前途的分子:抵制蛋白质水解,氧化,由政府作为气溶胶的物理约束。它还能抑制大部分活跃HNE全部CF痰和胃蛋白酶迅速分解,防止其积累后所需的重复政府对待CF。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢弗朗索瓦丝博士Varaigne和Christele Barbarin-Costes CF患者招募,Dyax集团(Cambridge, MA)允许研究EPI-hNE4教授Jean瓦拉赫pseudolysin的慷慨的礼物和欧文Parkes编辑英语文本。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这项工作是支持的协会“Vaincre La Mucoviscidose”(法国)和Debiopharm S.A.(瑞士洛桑)。gydF4y2Ba
文章、出版日期和引文信息可以发现gydF4y2Bahttp://jpet.aspetjournals.orggydF4y2Ba。gydF4y2Ba
doi: 10.1124 / jpet.106.103440。gydF4y2Ba
缩写:gydF4y2BaCF,囊性纤维化;HNE,人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶;Pr3、蛋白酶3;猫G,组织蛋白酶G;IL,白介素;MMP矩阵metalloprotease;αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba-π,αgydF4y2Ba1gydF4y2Ba蛋白酶抑制剂;PBS,磷酸盐;Abz,gydF4y2Ba昊图公司gydF4y2Ba氨基苯酸;EDDnp,gydF4y2BaNgydF4y2Ba- (2,4-dinitrophenyl)乙二胺;Tricine,gydF4y2BaNgydF4y2Ba——[2-hydroxy-1,一号乙(羟甲基)乙基)甘氨酸;膜结合HNE mHNE;高效液相色谱法,高效液相色谱法;SLPI分泌白细胞蛋白酶抑制剂;EPI-hNE4 depelstat。gydF4y2Ba
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- 收到了gydF4y2Ba2006年2月24日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2006年4月19日。gydF4y2Ba
- 美国社会的药理学和实验性疗法gydF4y2Ba
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