摘要
包括流感病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)在内的几种呼吸道病毒会在老年人中产生更严重的疾病,但控制年龄相关易感性的分子机制仍未得到充分研究。高龄与sars相关死亡的增加显著相关,主要是由于早期和晚期急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和肺纤维化的发病。老年而非幼龄小鼠感染含有从早期人类或棕榈果子狸分离株中提取的刺突糖蛋白的重组病毒,可导致死亡,并伴有与ARDS相关的病理改变。在老年小鼠中,差异表达基因的数量比在年轻小鼠中观察到的要多,而年轻小鼠的反应明显延迟。老年小鼠中致死和非致死病毒表型的差异可能归因于宿主反应动力学的差异,而不是病毒动力学的差异。SARS-CoV感染诱导了一系列干扰素、细胞因子和肺伤口愈合基因,以及与ARDS发病相关的几个基因。死亡的小鼠在免疫反应、凋亡、细胞周期控制和应激方面也表现出独特的转录谱。在经历肺部病理和致命疾病的动物中,与ARDS相关的细胞因子显著上调,而同一动物的ACE2受体则下调。这些数据表明,不成比例的强宿主先天免疫反应的量级和动力学有助于严重的呼吸应激和致命性。虽然在老年动物中控制ARDS病理生理学的分子机制仍然未知,但这些研究揭示了一种解剖SARS-CoV感染诱导宿主反应变化并导致死亡的遗传途径的策略。
严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)是一种人畜共患病原体,可能起源于蝙蝠、果子狸和浣熊,于2002年和2003年进入人类,造成全球流行。当时疫情很严重,约有8000人感染,经常发展为严重的急性呼吸道疾病、肺炎和腹泻,最终死亡率高达10% (10).高龄(> ~ 60岁)与快速进行性呼吸损害(急性呼吸窘迫综合征[ARDS])导致的sars相关死亡增加显著相关(13,14).这种肺损伤被认为是由病毒直接作用和免疫病理因素(18).衰老与多种病毒感染(如西尼罗河病毒、流感病毒、SARS-CoV和诺如病毒)的发病率增加有关,这可能是因为与年轻人群相比,老年人对新抗原的反应较差(41,48).此外,老年的一个典型特征是血浆中促炎细胞因子的产生和水平普遍增加,导致与年龄相关的炎症增加(48).然而,由于缺乏在脆弱的老年人群中表现出严重肺部疾病的明确的动物模型,控制SARS-CoV发病的分子机制尚不清楚。
急性呼吸窘迫综合征是最严重的急性肺损伤形式,死亡率接近50%,全世界每年影响约1,000,000人,将其列为重症监护医学中最困难的挑战之一(31).早期ARDS以弥漫性肺泡损伤(DAD)为特征,包括富含蛋白质的水肿、透明膜的渗出期以及导致表面活性物质功能障碍和严重缺氧的炎症,通常发生在急性肺损伤的前10天内。这可能会发展为组织期DAD,进而发展为肺纤维化,这两种情况都发生在SARS-CoV感染之后。sars冠状病毒或流感病毒感染后曾报告急性呼吸窘迫综合征,疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、水痘病毒和汉坦病毒感染后也有零星报告(9,11,30.,39,42,51);然而,很少有明确的ARDS动物模型存在。精选SARS-CoV毒株和H5N1流感病毒是啮齿动物急性呼吸窘迫综合征的可靠模型(47,56),但病毒感染后ARDS发病的分子机制仍不清楚,尤其是在衰老的背景下。因此,尽管进行了深入的研究,但除了支持治疗外,ARDS没有具体的临床治疗方法。
尽管SARS-CoV感染的致病机制尚不明确,但对有限数量的人血清(21,24)和肺(7,8,20.)的样本提供了一些见解。在人类感染SARS-CoV期间,细胞因子和炎症反应失调被认为是导致尸检时肺部病理特征的原因。在这些患者中观察到高水平的I型干扰素和干扰素刺激基因(ISGs),如CXCL10、白细胞介素6 (IL-6)和IL-8基因。其中一些基因,IL-6和IL-8基因,以及其他基因,包括肿瘤坏死因子α (TNF-α)和IL-1β基因,也与ARDS有关(4,37),尽管来自这些患者样本的基因和蛋白质表达谱可能受到临床治疗(类固醇和机械通气)和同时存在的疾病(如慢性心力衰竭、糖尿病和哮喘)的影响。此外,这些患者样本更有可能代表晚期疾病。重现人类急性呼吸窘迫综合征(ARDS)结果的SARS-CoV动物模型,特别是在老年人中看到的,可能揭示导致严重终末期肺病的初始宿主-病毒反应。
我们最近分离了一组具有不同尖突糖蛋白的重组感染性克隆(ic) SARS-CoV株,分别来自人畜共患SARS-CoV株icHC/SZ/61/03,以及在人类流行晚期和早期阶段鉴定的株icUrbani和icGZ02 (47,57).在老年小鼠中,icUrbani感染导致轻度疾病和短暂的体重减轻(44),而icGZ02和icHC/SZ/61/03导致严重肺部感染进展为急性DAD、ARDS和死亡(47).相反,年轻小鼠在没有临床疾病症状和肺部病理的情况下复制病毒,无论S糖蛋白的来源如何。这些数据表明,S糖蛋白基因的变化是SARS-CoV发病机制的主要组成部分。在这里,我们使用基因表达数据比较了非致死和致死SARS-CoV小鼠模型中宿主随时间的反应,以更全面地了解衰老和病毒峰值变异对调节严重疾病表型和ARDS发作的宿主反应的影响。
材料与方法
病毒和细胞。每种重组复合物(icUrbani、icGZ02和icHC/SZ/61/03)的生成和表征已在前面描述(47,57).简单地说,所有重组icSARS-CoV菌株在添加10%胎牛血清(HyClone, Logan, UT)、卡那霉素(0.25 μg/ml)和庆大霉素(0.05 μg/ml)的Eagle's最小必要培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)的Vero E6细胞上培养,37℃的湿气CO中2孵化器。所有工作都在生物安全3级实验室的生物安全柜中进行,该实验室有冗余排气风扇。人员配备了带有高效颗粒空气和有机蒸汽过滤器的动力空气净化呼吸器(3m,圣保罗,明尼苏达州),穿着Tyvek套装(杜邦,三角研究园,北卡罗来纳州),并戴双层手套。
老鼠感染。雌性BALB/cAnNHsd小鼠(幼[8周龄]或龄[12月龄];以50 μl腹腔注射氯胺酮(1.3 mg/只小鼠)-xylazine (0.38 mg/只小鼠)混合物麻醉小鼠。每组20只小鼠鼻内接种磷酸盐缓冲盐水(PBS)(模拟感染)或10只5icUrbani、icGZ02或icHC/SZ/61/03在50 μl卷中的PFU。每天监测小鼠的体重。在感染后3、12、24、48和72 h (p.i),每组4只小鼠安乐死,采集肺和血清样本。因为小鼠在每小时96小时死亡。47),每小时72小时处死小鼠,以确保高质量的RNA用于基因表达研究。对于每只小鼠,一半肺被冷冻在−70°C用于RNA分离。每只小鼠取一半肺进行RNA提取,四分之一肺采用空斑法检测病毒滴度,四分之一肺用于免疫组织化学检测SARS-CoV核衣壳(N)蛋白。所有小鼠都使用SlimLine系统(Tecniplast, Exton, PA)在无菌条件下安置在单独通风的Sealsafe笼子中。实验方案由北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会审查和批准。
组织样本中的病毒滴度肺样本称重并均质于5个等量的PBS中,以生成20%的溶液。在桌面离心机中以13000转/分的速度离心5分钟,用PBS连续稀释澄清的上清液,并将200 μl体积的稀释液置于六孔板的Vero E6细胞单层上。37°C孵育1小时后,细胞覆盖0.8%含琼脂糖的培养基。两天后,用中性红染色并计数斑块。
免疫组织化学。所有组织在4%多聚甲醛PBS (pH值7.4)中固定至少7天,然后提交到组织病理学核心设施(北卡罗来纳大学教堂山分校)进行石蜡包埋。为了检测SARS-CoV抗原,将连续切片脱蜡并复水,用柠檬酸缓冲液在100℃下孵卵15 min, pH为6.0,回收抗原。玻片在相同溶液中置于冰上冷却20分钟。用3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。将载玻片用PBS/0.05% Tween 20短暂清洗,并与感染SARS-CoV的雪貂血清(PBS/0.1%牛血清白蛋白的1/400)或正常雪貂血清(1/400)在室温下孵育1小时。洗净后,切片与山葵过氧化物酶标记的山羊抗雪貂免疫球蛋白G (KPL, Inc., MD)在PBS/0.1%牛血清白蛋白中室温孵育1小时。将载玻片在3-氨基-9-乙基卡唑(Sigma, St. Louis, MO)中孵育10分钟,显示过氧化物酶活性,形成鲜红色沉淀,随后用苏木精反染色。未感染小鼠的组织切片作为阴性对照。以实验性sars - cov接种雪貂的肺切片为阳性对照,每小时24小时安乐死。使用针对SARS-CoV N蛋白的多克隆雪貂血清,可以在不早于每小时24小时的时间内检测到病毒N蛋白作为小鼠肺部复制的衡量标准。
RNA分离和基因组预表征。将每只小鼠的一半肺转移到D溶液中(4 M胍硫氰酸盐+ 25 mM柠檬酸钠、0.5%肌醇和0.1 M巯基乙醇)并均质,按前面所述提取和纯化RNA (25).使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技公司,帕洛阿尔托,加州),从每只小鼠的时间点3、12、24、48和72 h提取的总RNA样本进行了表征,并判断其纯度和完整性。RNA样本随后通过相对定量实时反转录(RT)-PCR(如下所述)检测SARS-CoV N基因和细胞转录物Cxcl9、Cxcl10、Irf7和B2m的存在,以确定是否可以将单个样本合并以生成一个代表性的实验样本用于基因表达分析。大多数样本具有相似的病毒和细胞转录本;因此,从单个样本中提取的等量总RNA被汇集起来,以创建一个实验基因表达样本。在12 h p.i.的小鼠中,病毒转录本显示出相当大的变化,只有四分之一的年轻小鼠和四分之三的老年小鼠可检测到病毒转录本;因此,使用了不同的池化策略。从一个具有病毒转录本的个体样本中提取总RNA,生成一个具有代表性的年轻小鼠样本,显示宿主对病毒在每小时12小时的反应;从三个具有病毒转录本的老年小鼠样本中提取等量的总RNA,生成一个具有代表性的老年小鼠样本,显示宿主对病毒在每小时12小时的反应。相比之下,病毒和细胞转录本在所有其他时间点都是等效的,这使得样本可以集中在一起。
寡核苷酸微阵列分析。cRNA探针使用安捷伦低RNA输入荧光线性扩增试剂盒(安捷伦科技公司,加州帕洛阿尔托)从每个聚合的RNA样本中生成。然后将每个合并的实验RNA样本与其相应的参考样本共杂交,即年轻实验小鼠与年轻模拟感染小鼠,老年实验小鼠与老年模拟感染小鼠。此外,还进行了一个微阵列实验,比较了池中年轻的模拟感染参考和池中老年的模拟感染参考,以直接了解衰老的影响。所有微阵列杂交均采用小鼠寡核苷酸阵列(G4121B;安捷伦科技公司)。切片用安捷伦DNA微阵列扫描仪扫描,图像分析使用安捷伦特征提取软件(安捷伦科技公司)。每个微阵列实验进行4个技术重复,其中2个进行反向染料杂交(28).所有数据输入定制设计的数据库(Expression Array Manager),并使用Resolver 6.0 (Rosetta Biosoftware, Seattle, WA)和Spotfire DecisionSite for Functional Genomics 8.1 (Tibco Spotfire, Somerville, MA)进行分析。使用匠心途径分析6.0(匠心系统,Redwood City, CA)根据生物过程和规范途径对基因进行功能注释。所有的基因分析都是基于绝对表达水平变化是a的两倍或更大的标准P值≤0.01,除非另有说明。
基因集富集分析(GSEA) (53)用于识别基因本体(GO)中相同功能标注的基因集(1)在感染期间表达差异。在此分析的准备工作中,使用罗塞塔解析器系统来确定P与模拟样本相比,每个基因的差异表达值。简而言之,给定单个病毒/时间点组合的基因列表,按−对数递减排序(P值),GSEA允许识别集中在列表顶部的基因集(表示显著差异表达)。对于GO中的每个函数,GSEA应用于每个病毒/时间点组合。采用动态规划方法确定了精度P每个GO函数的值(27).仅测试GO层次结构中深度至少为4的GO函数的显著性,以避免非特定术语。对于每个函数,−log(P值),以跟踪函数在所有时间点上的重要性。
相对定量实时RT-PCR。使用相对定量的实时RT-PCR对单个小鼠样本进行聚合前预表征,以验证聚合样本中微阵列检测到的大量细胞基因表达变化,并进一步表征病毒感染时间延长过程中的转录子子集。总rna样本使用无dna脱氧核糖核酸酶试剂盒(Ambion, Inc.)用脱氧核糖核酸酶处理。奥斯汀,得克萨斯州)。使用RT试剂和随机六聚体生成cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA)。相对定量实时RT-PCR在ABI 7500 PCR系统上进行,使用TaqMan化学(Applied Biosystems, Foster City, CA)。SARS-CoV核蛋白基因特异性引物和探针已在之前描述(12),用于小鼠细胞基因的引物和探针从应用生物系统公司购买,作为“基因表达测定”。目标按照应用生物系统公司(福斯特城,CA)提供的协议进行四次重复试验。
微阵列数据接入号。本报告中描述的所有数据,包括样本信息、强度测量、基因列表、误差分析、微阵列含量和微阵列杂交条件,将在发表后通过Expression Array Manager在公共领域提供http://expression.viromics.washington.edu按照建议标准(6).
结果
S糖蛋白影响感染icSARS-CoV的年轻和老年小鼠的临床结果和病毒复制。如前所述,年轻BALB/c小鼠感染icUrbani、icGZ02或icHC/SZ/61/03后,无论S糖蛋白的来源如何,均不会导致体重减轻或其他临床疾病症状。1) (47).老年BALB/c小鼠感染icUrbani仅导致5%的轻微体重减轻,没有其他临床疾病迹象。相比之下,感染icGZ02或icHC/SZ/61/03的老年小鼠在72小时后体重显著下降>10%。1 b)并表现出临床症状,包括驼背、皱毛和呼吸困难。正如之前在肺中看到的,icGZ02和icHC/SZ/61/03可以观察到DAD、透明膜形成和肺泡炎,但icUrbani感染后则没有(参考文献)47数据未显示)。
在年轻小鼠中,icUrbani复制的滴度峰值为8 ×107肺PFU/g,而icGZ02复制至2 × 10的峰值滴度7PFU/g和icHC/SZ/61/03重复后滴度峰值为6 × 105相同条件下肺组织PFU/g(图。1 c).icGZ02和icHC/SZ/61/03的病毒滴度在24 h p.i.时达到峰值,之后icGZ02滴度下降,而icHC/SZ/61/03滴度保持一致。相反,icUrbani在第一个24小时内复制的效率与icGZ02一样高,但在48小时后继续复制并达到滴度峰值。虽然观察到病毒复制的明显差异,但这并没有延伸到临床差异,在年轻小鼠中没有这种差异。
在老年小鼠中,icGZ02的滴度峰值比年轻小鼠高1个对数单位,icHC/SZ/61/03的滴度峰值比年轻小鼠高2个对数单位。1 d).与年轻小鼠相似,icGZ02和icHC/Z/61/03的病毒复制峰值在每小时24小时,icUrbani的病毒复制峰值在每小时48小时。老年小鼠特有的病毒滴度在达到所有病毒滴度峰值后下降了1到2个对数单位。虽然在非致死icUrbani和致死icGZ02和icHC/SZ/61/03分离株之间观察到明显的临床结果差异,但这些差异不能归因于病毒在受感染的老年小鼠肺部的生长效率,这表明S糖蛋白的固有特性导致了发病机制的差异。
S糖蛋白影响SARS-CoV在感染小鼠肺部复制的趋向性。由于重组SARS-CoV面板是等基因的,除了每个S糖蛋白基因所特有的确定的序列变异外(47),我们接下来确定这些尖刺变化是否改变了年轻和老年动物肺部的病毒倾向,在早期和晚期的时间点。使用针对SARS-CoV N蛋白的多克隆雪貂血清,24小时后,所有感染的年轻和老年小鼠的肺部都能清楚地检测到病毒N蛋白分布的独特模式。2).icUrbani染色显示,年轻和老年动物中少量分散的肺泡上皮细胞,形态与II型肺细胞一致,24小时/年SARS-CoV N蛋白染色呈阳性。在48和72小时,观察到表达病毒N蛋白的肺泡上皮细胞数量增加。2数据未显示)。而icGZ02和icHC/SZ/61/03感染SARS-CoV小鼠的肺部则表现出明显不同的感染模式和细胞向性。病毒N蛋白的表达定位于气道中的少量支气管和细支气管上皮细胞,以及早在12 h时就出现II型肺细胞的散在肺泡细胞(数据未显示)。每小时24小时,病毒N蛋白的表达定位于中等数量的支气管和细支气管上皮细胞和少数分散的肺泡上皮细胞,形态与II型肺细胞一致。每小时48小时,大多数病毒N蛋白在肺泡上皮细胞中检测到,偶尔在支气管细胞、细支气管细胞中检测到,在末端前细支气管中检测到明显的细胞碎片。到72 h p.i时,病毒N蛋白仅在具有II型肺细胞外观的肺泡上皮细胞中检测到,没有支气管或细支气管受累,细胞碎片很少。这些数据表明,SARS-CoV S糖蛋白的改变改变了老年小鼠的嗜性和发病机制。
ACE2表达降低与SARS-CoV感染致死性相关由于SARS-CoV受体ACE2已被SARS-CoV S糖蛋白下调(32),导致肾素-血管紧张素系统的紊乱和急性肺衰竭的夸大,我们假设在致命感染与非致命感染期间ACE2的表达模式会发生差异改变。几次尝试用免疫组化法检测感染小鼠肺部的小鼠ACE2均未成功。作为一种替代方法,我们使用实时RT-PCR检测ACE2在感染肺部的调节(图。3.).在老年小鼠中,每小时48小时,在致命的icGZ02和icHC/SZ/61/03感染期间,ACE2分别下调了3倍和5倍(图2)。3),支持ACE2下调导致急性肺衰竭的观点。相比之下,非致命性icurbani感染小鼠在48小时内ACE2比模拟感染小鼠上调了两倍(图2)。3),与小鼠存活率相关,表明icUrbani S糖蛋白的致病性不如icGZ02或icHC/Sz/61/03 S糖蛋白。在年轻小鼠中,只有在感染icHC/SZ/61/03 72 h后,ACE2的表达才显著下调。3 b).这些数据表明,ACE2的早期下调与致命疾病相关,因此ACE2可能在sars - cov诱导的肺损伤中发挥潜在的保护作用。
与年轻的sars - cov感染小鼠相比,老年sars - cov感染小鼠肺部的整体基因表达显示出更早的宿主对病毒的反应。通过对感染非致死和致死SARS-CoV毒株的年轻小鼠和老年小鼠肺部基因表达的比较,可以识别与致死感染相关的独特表达特征,从而揭示SARS-CoV发病的分子机制。在年轻小鼠中,在每小时72小时观察到对SARS-CoV感染的迟发反应,在每个时间点感染不同SARS-CoV分离株的小鼠之间差异表达的基因数量相似(图2)。4).相比之下,老年小鼠的宿主反应以早期(24小时p.i.)出现差异基因表达为特征,这种差异基因表达持续到72小时p.i.。在老年小鼠中,与非致命分离株相比,在致命的SARS-CoV分离株感染期间,更多的基因发生差异表达,其中致命的icHC/SZ/61/03菌株比致命的icGZ02菌株在24和72小时p.i.诱导更多的基因(约200多)。与先前的结果一样,差异调控基因的数量与致病性相关(47),表明icUrbani不会引起致命疾病,icGZ02会引起致病性疾病,在第4天杀死75%的感染小鼠,icHC/SZ/61/03早在第3天就会在100%的感染小鼠中引起致命疾病。
绘制全局基因表达谱作为热图显示,在年轻和老年小鼠的早期时间点,三种不同病毒之间很少有共同调控的基因,而在72小时/小时时,相似性变得明显。4 b).在老年和年轻小鼠感染的后期阶段,这三种病毒都诱导了大量独特的基因,但也显示了最多的共同基因(图2)。5).值得注意的是,在每小时72小时时,老年小鼠对两种致命病毒感染的特异性差异表达基因的数量比年轻小鼠多大约10倍。这一趋势在24小时p.i时也被注意到,在老年小鼠中,特定于致死分离物的基因反应超过了所有三种分离物在老年小鼠中的共同基因反应。有趣的是,在老年小鼠中,icHC/SZ/61/03致命感染所特有的差异表达基因数量比icGZ02致命感染所特有的差异表达基因数量高3倍。这些数据表明,致死菌株可能通过不同的分子机制产生严重的疾病表型,存活结果可能早在24 h。
为了更好地了解感染早期与肺病理和致死性疾病相关的生物学功能,我们使用GO功能注释分析了微阵列结果。使用GO功能注释数据的GSEA(在材料和方法中描述)来确定特定功能类的基因是否在感染反应中受到差异调节。该分析显示,在24小时/周时,SARS-CoV感染的免疫应答和凋亡功能类相关基因的表达有显著差异。6).淋巴细胞介导的免疫、细胞凋亡和炎症反应功能分类显著相关,感染icGZ02-和icHC/SZ/61/03的老年动物的疾病严重程度在这些分类中表现出最大的统计学相关性。有趣的是,在每小时72小时时,这些功能类别不再与致命疾病相关,而是对SARS-CoV感染表现出共同的反应。当数据绘制成热图时,也可以观察到这些结果:24小时每小时建立的宿主对病毒感染的反应似乎决定了感染致命SARS-CoV毒株的老年小鼠的结局,这与感染非致命毒株的老年小鼠和所有感染的年轻小鼠不同(图2)。6 b).这两种图形格式都表明,由于异常的宿主反应,24小时的反应是疾病结局的重要决定因素。
致死感染后24小时的宿主反应。由于24小时每小时的宿主反应显然是疾病结局的决定因素,因此进一步检查了这一时间点的数据,以确定可能为肺部病理和死亡率提供可能解释的调节途径。通过匠心通路分析,从致死模型中确定24小时p.i.数据集中诱导的顶级典型通路。在icGZ02和icHC/SZ/61/03感染过程中,干扰素信号转导和急性期反应是主要的典型途径。实时RT-PCR证实了干扰素信号通路和急性期反应通路的一个基因子集的动力学(图2)。7).与功能注释一样,这些典型通路中的基因表达与老年小鼠在24小时p.i.时的致病性相关,但在年轻小鼠中不相关(图。8).数据再次显示,在72 h p.i时,不同感染系统之间的相似性变得明显。特别值得注意的是,急性期反应途径包括许多先前被认为在ARDS发展中重要的细胞因子,包括IL-1β, IL-6和TNF (7,8),以及补体级联的几个成员。
此外,在年轻或老年小鼠感染SARS-CoV时,β干扰素(IFN-β)和IFN-γ,但不包括IFN-α,均显著上调,正如先前在其他SARS-CoV感染动物模型中观察到的那样(3.,12).许多isg基因也上调,包括Ifit3和Irf9基因。这些个体细胞因子基因的时间调控反映了宿主反应的整体基因表达动力学;在感染icGZ02和icHC/SZ/61/03的老年小鼠中,这些基因在24小时/周内被强烈上调,但在非致命性icUrbani感染期间,这些相同的反应延迟到72小时/周。这些数据建立了老年小鼠模型作为病毒诱导的ARDS动物模型,并表明干扰素信号通路和急性期反应,包括补体系统,在病毒感染的结果和SARS-CoV发病机制中发挥关键作用。
两种致命sars冠状病毒株宿主反应的差异。为了评估两种致命SARS-CoV毒株之间的宿主反应差异,这可能是疾病结局的潜在决定因素,我们创建了一个与早期宿主反应相关的基因相互作用网络(每小时24小时)。该网络是通过包括在致命的icGZ02和icHC/SZ/61/03感染中表现出独特的差异调控的基因来创建的。9).网络分析有助于评估不同功能过程内部和之间协同作用的基因,并表示由匠心路径分析确定的前两个网络生成的组合交互网络(详细信息见图中的图例)。9).该相互作用网络显示了免疫反应、凋亡、细胞周期控制和翻译控制/内质网(ER)应激的四个广泛功能类别,它们共同作用,并表明icGZ02感染调节基因的一个子集,而icHC/SZ/61/03感染调节网络中的所有基因。这种在24小时每小时对icHC/SZ/61/03感染增强的宿主反应可能解释了之前的死亡率数据(47icGZ02在第4天杀死了75%的动物,而HC/SZ/61/03早在第3天就杀死了100%的动物。24小时p.i.宿主对icHC/SZ/61/03感染的增强反应是特别有趣的,因为在感染的这一阶段,老年小鼠的肺部显示出icHC/SZ/61/03 (6 × 105PFU/g)低于icGZ02病毒载量(2 × 107空斑形成单位/ g)(图1),因此,这种早期和增强的反应可能潜在地代表了宿主免疫病理对SARS发病机制的贡献。
讨论
尽管进行了大量的研究,但目前还没有针对ARDS的特异性治疗方法,特别是在病毒感染后,迫切需要模型系统。虽然已知有几种病毒可引起急性呼吸窘迫综合征,包括sars冠状病毒和流感病毒(9,11,30.,39,42,51),由于可用的动物模型数量有限,病毒诱导的ARDS的分子机制还没有很好地描述。最近在小鼠中重建了两种致命的SARS-CoV感染模型,这些模型概括了人类中注意到的与年龄相关的致病表型(47)为我们提供了描述宿主反应动力学的新机会,并更全面地开发了描述病毒诱导的ARDS分子机制的模型。本文的主要目标是使用系统生物学方法对SARS- cov感染的老年和年轻小鼠(i)将疾病进展描述为可区分的基因表达谱;(ii)验证SARS老年小鼠模型作为ARDS的代表。
在这项研究中,致命和非致命分离株在感染小鼠的肺部都生长到高滴度,但在肺部显示出不同的病毒感染细胞的取向和丰度,这与增加的病理结果相关。调控S糖蛋白向性差异的分子机制尚不清楚。研究表明,S糖蛋白的突变导致了适应过程中受体亲和力的差异(34).本研究中使用的所有S糖蛋白突变体都需要ACE2作为受体。然而,仅表达ACE2不足以在人气道上皮细胞中复制人畜共患病株(47).这些数据表明趋向性的差异可能反映了小鼠ACE2受体或DC/L-Sign共受体的不同亲和力(34).由于I型和II型人类肺细胞以及人类支气管上皮细胞表达ACE2,因此未来的研究必须描述ACE2在小鼠肺细胞类型中的定位和水平(19,50).在人流感病毒株和禽流感病毒株感染之间,也观察到靶细胞的趋向性和疾病严重程度的差异(55).我们推测,与流感病毒一样,SARS-CoV趋向性是一个必要因素,但不足以解释疾病进展严重程度的差异(55).我们观察到ACE2下调与致死率相关,这与早期研究表明SARS-CoV S糖蛋白加重小鼠急性肺衰竭一致(32).ACE2被认为是通过调节肾素-血管紧张素系统、肺血管张力/通透性和上皮细胞存活来夸大急性肺衰竭,从而调节宿主反应(23,31,32,35);因此,在RAS基因家族成员调节过程中评估sars - cov诱导的肺部病理的未来实验将提供信息。
考虑到所有三种病毒分离物在老年动物的肺中复制到相似的滴度,S糖蛋白的特定变化似乎引发了异常的宿主反应。流感病毒血凝素和神经氨酸酶的变异也描述了毒力变化的类似影响,它们也显示出致病性的差异,与凋亡和组织损伤相关基因的上调有关(25).在老年小鼠中,SARS-CoV感染不是通过影响病毒复制动力学,而是通过影响宿主反应动力学来促进快速和致命的疾病。老年小鼠表现出以炎症细胞因子诱导为主的早期宿主反应,并在24小时时出现急性期反应。在感染致命SARS-CoV分离株的老年小鼠的早期时间点上,宿主基因表达、细胞趋同性和病毒复制峰值的差异表明,前24小时对临床结果至关重要。这与观察结果一致,即用中和性单克隆抗体对感染sars - cov的小鼠进行p.i.治疗,在后来的时间点没有病毒复制的情况下,不能保护它们免于死亡(46).疾病结局主要受淋巴细胞介导的免疫、炎症反应、细胞凋亡以及干扰素信号通路和急性期反应的影响。相反,在72小时每小时时,无论疾病结局如何,都发生了共同的调节模式。有趣的是,与icGZ02感染相比,宿主对icHC/SZ/61/03感染的反应增强,这可能解释了之前观察到的icHC/SZ/61/03的致死率增强(47).在icHC/SZ/61/03感染期间,这种增强的宿主反应表现为更多的差异表达基因,这些基因的绝对变化更大,以及更广泛的基因网络协同作用。因为更致命的病毒显示较低的病毒载量,但更大的宿主反应,这些结果表明,通过宿主的早期反应,潜在的免疫病理学对疾病的贡献。这种现象与几种病毒发病机制的动物模型的反应相似(3.,12),包括流感病毒的血凝素/神经氨酸酶变种(25,26),这可以被描述为先前被描述为“细胞因子风暴”现象的一个更广泛的例子(21).
在SARS- cov感染小鼠中观察到的这种“细胞因子风暴”与在SARS患者中观察到的相似,包括ccl -10、IL-1β、IL-6、TNF和IFN-γ (21).小鼠中这些细胞因子和干扰素反应的动力学与人类ARDS病例的动力学相似,包括sars - cov诱导的病例。与幸存者相比,非幸存者的细胞因子在ARDS发病时显著增加,随着时间的推移持续升高预测预后较差(8,37,54).此外,预后较差的sars - cov感染患者在感染早期表现出ISG和免疫球蛋白基因表达偏离,趋化因子水平持续(8).我们的数据清楚地表明,关键的炎症介质,包括IL-1β、IL-6和TNF,在感染致命分离物的早期,所有的反应都更加强烈,这与之前的临床研究一致(8,54).为了支持这项研究,IL-1受体缺陷小鼠在致命的小鼠适应SARS-CoV株感染后存活(49),提示IL-1β在SARS-CoV炎症诱导的发病机制中起作用。这些炎症介质已被证明在ARDS病理生理的渗出期发挥重要作用(43).干扰素也被认为在ARDS病理生理中起作用,但这种作用是什么还不清楚。在这里,小鼠干扰素反应在致命感染早期增加,而非致命SARS-CoV感染后反应延迟。此前,体外数据表明SARS-CoV感染通过几种机制阻断干扰素反应(15,16,29),而来自人类、非人类灵长类动物和小鼠的体内数据表明,早期SARS-CoV感染会导致强有力的I型和II型干扰素反应,以及ISG表达的增加(3.,8,12).在细胞水平上对非人灵长类动物的研究表明,感染SARS-CoV的细胞不能产生干扰素,但能够激活未感染的邻近细胞以产生干扰素反应(12).
除了发现导致致命性的干扰素信号和异常宿主反应的组成部分外,小鼠数据还揭示了补体级联中的差异基因表达,以及一种新的调节网络,可以区分两种致命表型。补体活化已被证明在ARDS中发挥作用(22,58),以及其他病毒的发病机制,包括虫媒病毒、登革病毒和呼吸道合胞病毒(2,38,40).目前,我们实验室正在进行补体系统参与SARS-CoV发病机制的研究。有趣的是,基因表达分析揭示了一个由细胞周期、凋亡、内质网应激和免疫反应基因组成的调节网络,共同影响衰老动物发病机制的进展。两种致死表型都与免疫途径的强调控相关,包括NF-κB信号通路和IFN-β和翻译控制/内质网应激途径的上调,包括DNAJC3 (p58IPK).p58IPK曾被证明是流感感染期间的毒力因子(17),并在病毒诱发的ARDS中发挥类似的作用。在病毒感染期间,翻译控制基因和细胞周期基因有望抑制病毒复制,免疫和凋亡途径杀死感染细胞。然而,如果这种反应发生在这些基因强烈上调的感染细胞早期,未感染的组织也会遭受这种不受控制的免疫反应的影响,类似于在猕猴研究中看到的情况(12).此外,凋亡基因的上调以与两种致命表型一致的方式启动细胞死亡而不是生存。在感染icGZ02的动物中,少量凋亡基因在24小时每小时上调,这种模式与75%的小鼠在第4天死亡有关。相反,感染icHC/SZ/61/03会导致更多凋亡基因在24 h / pi时上调,并且在第3天结束时与100%的死亡率相关。在icHC/SZ/61/03感染小鼠中观察到的额外细胞周期调节似乎是肺损伤增加的结果。在致命感染期间,Klf6的表达唯一上调,并与转化生长因子β相关的组织损伤修复有关(5).尽管这种修复机制在24小时p.i.时被激活,但它不能抵消已经发生的炎症损伤。因此,我们将icHC/SZ/61/03宿主反应描述为“增强的致死率”,这是由于在致死率相关网络中识别出的额外调控成分。
虽然已经描述了其他几种SARS-CoV感染的动物模型(12,33,36,44,45,52),这些模型很少显示出致命性。结果各不相同,从无症状的病毒复制到有明显临床症状的肺部病理。本研究所使用的病毒引起的ARDS小鼠模型可导致小鼠的临床症状,更准确地概括了人群中与年龄相关的致病表型,表明该系统是研究SARS-CoV发病机制急性期和病毒引起的ARDS的相关模型。我们研究的时间过程主要集中在ARDS的渗出期,以DAD和透明膜形成为特征(47),每年3至4天即可致死;因此,纤维化和组织修复的机制尚不明确。然而,由于在我们的模型中诱导了几种参与纤维化的细胞因子,我们预测,通过使用亚致死感染,致命感染的老年小鼠的生存可以延长到ARDS的纤维化期。这个时间过程的延长如何影响宿主反应动力学是非常有趣的。未来的研究将使用敲除小鼠和衰竭研究,研究ards相关细胞因子、转化生长因子β相关修复机制、补体级联、细胞周期调节和caspase介导的凋亡在急性病毒感染中的作用,目的是促进正常组织修复和抑制致命疾病,以确定呼吸道死亡的直接原因。这些研究,包括对患有低致病性和高致病性流感的年轻和老年小鼠的比较工作,可能为衰老对早期和/或异常宿主反应的影响提供相当大的见解。
综上所述,本研究中提供的基因组学数据建立了两种病毒诱导的ARDS新模型。这些数据提供了几种与ARDS发展相关的靶细胞因子,并确定了几种可能在SARS-CoV发病机制中发挥作用的基因和途径。这些基因和途径将作为未来SARS-CoV致死性机制研究的候选基因和治疗的潜在靶点。此外,这些新的病毒诱导的ARDS模型将为与其他病毒诱导的ARDS模型进行比较分析提供宝贵的价值,并可能为了解ARDS病理生理导致死亡的常见机制提供参考。
致谢
我们感谢Marcus J. Korth对手稿的批判性阅读。
这项工作得到了NIH NIAID拨款P01-AI059443和AI059136给R.B.和NIH NHLBI拨款R01-HL080621给M.G.K.的支持
脚注
- 收到了一月十九日。
- 接受四月十六日。
- 版权所有©2009美国微生物学会