摘要gydF4y2Ba
流感病毒爆发仍然是对公众健康的严重威胁。对病毒靶向细胞如何对感染作出反应的更深入了解可以为疾病的发病机制提供见解。在这里,我们研究了gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba流感病毒感染小鼠肺部感染和未感染的2型肺泡上皮细胞(AEC)我们首次展示了由细菌诱导的独特的基因表达谱gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2BaAEC感染以及未感染的旁观者细胞的转录反应。这项工作使我们能够在细胞水平上区分感染的直接和间接影响。转录组分析显示,尽管与未感染动物的AEC相比,来自感染动物的直接感染AEC和旁观者AEC有许多转录组变化,但与未感染的旁观者AEC相比,直接感染的细胞产生更多的干扰素,表达更低水平的Wnt信号相关转录物,同时表达更多与细胞死亡途径相关的转录物。Wnt信号通路在两者中均下调gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba-感染的AEC和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba被感染的人肺上皮A549细胞Wnt信号不影响感染A549细胞产生I型和III型干扰素。我们的研究结果揭示了感染AEC内发生的独特转录变化,并表明流感病毒下调Wnt信号。鉴于最近发现Wnt信号对肺上皮干细胞至关重要,我们的研究结果揭示了流感病毒可能影响宿主肺修复的机制。gydF4y2Ba
重要性gydF4y2Ba流感病毒感染仍然是一个主要的公共卫生问题。利用重组绿色荧光蛋白表达流感病毒,我们比较了gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba从感染小鼠肺部直接感染和未感染的旁观者细胞的转录组,并发现了许多在每个群体中独特调节的途径。Wnt信号通路在直接感染的细胞中下调,并被证明影响病毒但不影响干扰素的产生。我们的研究是第一个发现gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba与仅仅暴露于肺部炎症环境相比,直接病毒感染诱导的转录组变化突出了Wnt信号的下调。这种下调对于理解流感病毒的发病机制具有重要意义,因为Wnt信号对肺上皮干细胞和肺上皮细胞分化至关重要。我们的研究结果揭示了流感病毒可能影响宿主肺修复的机制,并提出了预防损伤或加速肺恢复的干预措施。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
在美国,每年有5%至20%的人口受到季节性流感病毒爆发的影响(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).该疾病的严重程度是由病毒的细胞病变作用以及促炎细胞的肺浸润和炎性细胞因子的产生引起的。到目前为止,已经确定了三种流感病毒,即A、B和C型(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).最常见的是甲型流感病毒(IAV),感染呼吸道细胞,典型的是肺泡上皮细胞(AEC)和肺泡巨噬细胞。2型AEC的感染会导致新的感染性病毒粒子的大量复制和出芽,从而使病毒感染在肺内扩散(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).之前的研究表明gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaIAV感染人肺上皮细胞导致RNA转录组的变化(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)和蛋白质组学(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).研究gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba对感染iav的患者、小鼠和鸟类的肺组织进行检查也显示出感染引起的肺基因表达变化(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).然而,这些观察到的来自整个肺组织的基因转录物的改变是iav感染细胞、旁观者未感染细胞和浸润性免疫细胞共同作用的结果。因此,感染细胞和旁观者细胞之间的变化gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba仍待调查。gydF4y2Ba
先前的研究表明Wnt信号在肺部发育和疾病中的重要作用。即使是单一的Wnt配体操作也被证明对肺部发育有不利影响,因为Wnt7b的缺失会导致围产期死亡,这归因于呼吸衰竭,早期发育的肺部表现为发育不全(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba).其他研究显示了Wnt信号的重要性,因为无论是Wnt信号的完全缺乏还是Wnt信号的增强都能够影响肺形态和AEC分化。单独缺失Wnt5a可显著改变肺发育和AEC分化(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba).而过表达Wnt5a则达到相反的效果,导致AEC分化增加(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba).Wnt信号在成人中的作用尚不清楚。由于在移植肺组织中检测到许多Wnt信号成分的表达,因此Wnt信号可能是成人肺稳态所必需的(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba).先前的研究表明,Wnt信号控制干细胞壁龛,AEC转换发生在正常的内稳态中;因此,这些Wnt通路表达的波动可能反映了细胞更新和对肺损伤的反应(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).最近,Wnt信号被证明可以维持成体肺上皮干细胞的生态位,并且下调是II型AEC向I型AEC分化所必需的,这突出了Wnt信号在肺稳态和损伤中的微妙平衡(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).然而,在流感病毒感染等肺部感染过程中,Wnt信号是如何受到影响的,以及它在感染过程中可能发挥的作用尚不清楚。gydF4y2Ba
来直接决定gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在IAV感染的AEC中诱导RNA表达的变化,以及在IAV感染期间旁观者未感染的AEC中间接发生的变化,我们对从感染表达重组绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠肺部分离的感染和未感染的旁观者2型AEC进行了RNA测序(RNA-seq)gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)和未感染小鼠的2型AEC。我们的研究结果揭示了一些独特的差异表达的基因和途径在流感病毒感染以及旁观者未感染的上皮细胞。参与抗病毒免疫反应的许多途径在GFP阳性(GFP)中都得到了很好的体现gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)直接感染AEC和GFP阴性(GFP)gydF4y2Ba−gydF4y2Ba旁观者AEC转录组。独特的是,与旁观者AEC相比,直接感染的AEC表现出减少的Wnt信号和许多与细胞组织和极性相关的途径,同时显示出增加的细胞死亡途径和凋亡。这些结果为直接感染的AEC与旁观者AEC的独特转录表达谱提供了证据,可以用来靶向病毒感染的细胞,以降低流感病毒引起的发病率和死亡率。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
直接感染的iav和旁观者AEC有不同的转录组。gydF4y2Ba为了确定直接感染流感病毒的细胞与暴露于病毒感染的肺部炎症环境的旁站细胞之间转录组的差异,我们在C57BL/6小鼠鼻内感染表达gfp的a /Puerto Rico/8/1934 IAV (PR8-GFP) (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba).PR8-GFP感染后第3天,直接感染肺泡上皮细胞(CD45)gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD326gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)以及旁观者未感染细胞(CD45)gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD326gydF4y2Ba+gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)用荧光活化细胞分选器(FACS)从感染小鼠(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba).2型AEC (CD45)gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD326gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)作为对照。从这些细胞中分离RNA,并进行RNA测序。从这些单独分类的种群中,我们首先对流感病毒基因和绿色荧光蛋白进行了初步筛选。正如预期的那样,这些转录本的水平在感染细胞中最高,在未感染细胞中检测不到。然而,旁观者细胞群测序显示了一些流感病毒转录物。虽然存在于旁观者细胞中,但我们发现旁观者AEC中的IAV RNA和GFP RNA读数水平比感染AEC低10- 20倍,这对应于旁观者细胞样本中感染细胞的污染约5 - 10% (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba).这些感染相关转录本可以解释为新感染的细胞(GFP蛋白阴性和病毒RNA阳性)被GFP分类gydF4y2Ba−gydF4y2Ba旁观者人口。gydF4y2Ba
不同AEC转录组的主成分分析(PCA)显示,不同感染状态的AEC转录组存在明显的分离(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba).这些发现揭示了一个独特而独特的转录组,其特征是直接感染IAV的AEC和那些未感染但暴露于由IAV感染引起的炎性肺环境的AEC。这两种AEC的转录谱彼此不同,也不同于从未感染肺部分离的AEC (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
在直接感染的AEC中,干扰素反应和抗病毒转录物更为丰富。gydF4y2Ba对受感染细胞和旁观者AECs中基因相对丰度的分析显示,这些细胞对IAV感染的反应存在显著差异(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba来gydF4y2BaDgydF4y2Ba).当比较感染AEC与未感染AEC以及旁观者与未感染AEC的相对mRNA丰度时,mRNA丰度的变化程度在感染AEC与未感染AEC的比较中更为明显(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba).正如预期的那样,与未感染的AEC相比,在感染AEC中检测到的前25个最丰富的转录本大量富集抗病毒和干扰素相关基因。干扰素- 1 (gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba)是最富代表性的基因,被诱导了1842倍,其他与干扰素信号相关的基因的丰度也增加了,包括干扰素刺激基因15 (gydF4y2BaIsg15gydF4y2Ba)(433倍),IFN-λ3 (gydF4y2BaIfnl3gydF4y2Ba)(360倍),MX动力蛋白样GTPase 1 (gydF4y2Bamx₁gydF4y2Ba)(136倍),2 ' -5 ' -低聚腺苷酸合成酶3 (gydF4y2BaOas3gydF4y2Ba)(128倍诱导),IFN-λ2 (gydF4y2BaIfnl2gydF4y2Ba)(120倍),干扰素诱导的含有四肽重复序列1 (gydF4y2BaIfit1gydF4y2Ba)(113倍)。感染AEC中丰度增加的其他转录物在抗流感免疫应答中具有不同的功能特性,包括趋化因子配体5 (gydF4y2BaCcl5gydF4y2Ba)(1237倍),作为CD8的化学引诱剂gydF4y2Ba+gydF4y2Ba肺中的T细胞(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).载脂蛋白(gydF4y2BaApol9agydF4y2Ba和gydF4y2BaApol9bgydF4y2Ba[分别为245倍和214倍])被认为除具有抗病毒活性外,还具有组织修复作用(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba).Z-DNA结合蛋白1 (gydF4y2BaZbp1gydF4y2Ba(159倍)作为I型IFN生产的细胞质DNA免疫传感器,而viperin,也被称为自由基gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-腺苷甲硫氨酸结构域含2 (gydF4y2BaRsad2gydF4y2Ba(154倍),是一种干扰素诱导的铁硫簇结合蛋白,能够抑制病毒复制(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba).蛋白聚糖2 (gydF4y2BaPrg2为例gydF4y2Ba(101倍),也被称为自然杀伤细胞激活剂,首次从T细胞杂交瘤中纯化,并显示增强NK细胞功能(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba).当将旁观者AEC的转录组与未感染的AEC进行比较时,干扰素和抗病毒基因的水平也有所增加,尽管程度较轻(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba).从上述数据来看,很明显,在感染AEC和旁观者AEC中最丰富的基因涉及干扰素、干扰素反应基因和其他抗病毒基因。gydF4y2Ba
如上所述,流感病毒感染后上皮细胞中抗病毒基因和干扰素反应增强。然而,当GFPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba将感染的AEC与GFP进行比较gydF4y2Ba−gydF4y2Ba更明显的是,哪些基因最容易受到流感病毒直接感染或肺部炎症环境感染的影响(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba(左)。在这些基因中,某些具有共同定义功能的基因在感染的AEC (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba,对吧)。许多与Wnt信号有关的基因(gydF4y2BaWnt3gydF4y2Ba,gydF4y2BaWnt16gydF4y2Ba,gydF4y2BaWnt6gydF4y2Ba,gydF4y2BaDkk3gydF4y2Ba)是GFP中减少最多的转录本之一gydF4y2Ba+gydF4y2Ba被感染的原子能委员会。一些参与细胞粘附和形态的基因也可以在这个列表中找到,包括gydF4y2BaFgf14gydF4y2Ba(成纤维细胞生长因子14);gydF4y2BaPcdh9gydF4y2Ba(protocadherin 9),gydF4y2BaDscaml1gydF4y2Ba(唐氏综合症细胞粘附分子1),gydF4y2BaSerpina3igydF4y2Ba(丝氨酸肽酶抑制剂)gydF4y2BaCnpy1gydF4y2Ba(冠层同源物1);gydF4y2BaCol8a1gydF4y2Ba(VIII型α链1),和gydF4y2BaCol17a1gydF4y2Ba(胶原型XVII α链1)等。这些数据表明,流感病毒的直接感染在感染期间改变Wnt信号以及细胞形态和粘附方面发挥作用。gydF4y2Ba
流感病毒直接感染AEC可影响不同的信号通路。gydF4y2Ba与未感染的AEC相比,感染的AEC显示出最多的RNA转录增加或减少,丰度比旁观者AEC高2至3倍。与未感染AEC相比,感染AEC和旁观者AEC共有914个显著增加的基因和989个显著减少的基因,差异超过2倍(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba).然而,也有2199个基因在感染AEC中唯一增加,525个基因仅在旁观者AEC中增加(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba).感染AEC也有1731个基因独特减少,而旁观者AEC有237个基因独特减少(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba).因此,在流感病毒直接感染AEC时,与旁观者AEC相比,感染AEC唯一增加的转录本在流感病毒感染期间受到影响的基因数量要多得多。gydF4y2Ba
为了了解差异表达基因如何适应典型的细胞途径,使用独创性途径分析(IPA)分别分析了感染AEC与未感染AEC、感染AEC与旁观者AEC、旁观者AEC与未感染AEC的两两比较中的5,833、3,367和2,665个基因。这些基因是根据>2倍变化,>5标准化计数每千碱基基因(NCPKG)和调整后的标准选择的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值<0.05。利用IPA进一步丰富对受流感病毒感染影响的途径的分析,利用IPA分配的趋势和分数(激活或抑制的z分数)的组合,根据来自每个两两比较的差异表达基因对途径进行排序(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).在直接感染和旁观者AEC中,免疫应答过程中预期增加的途径是受影响最大的途径之一,包括干扰素信号传导、细菌和病毒的模式识别受体(PRR)的作用、白细胞介素-8 (IL-8)信号传导、NF-κB信号传导、rig - i样受体在抗病毒先天免疫中的作用,以及细胞质模式识别受体(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).与未感染AEC相比,直接感染AEC和旁观者AEC中死亡受体信号和凋亡信号等通路也增加(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).这些途径很可能代表了AEC对流感病毒感染的肺部炎症环境的反应。gydF4y2Ba
为了可视化受流感病毒直接感染影响的生物学趋势,基于途径激活或抑制结合Z-score和a构建了Treemap图像gydF4y2BaPgydF4y2BaIPA根据直接感染和旁观者AEC两两比较中差异表达的个体特征产生的值。根据维恩图,这表明在直接感染的AEC中转录本的丰度降低(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba),即基于GFP对比构建的Treemap图像gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与GFP相比,直接感染AECgydF4y2Ba−gydF4y2Ba旁观者AEC表明,直接流感病毒感染对许多细胞功能和信号通路具有负面影响gydF4y2BaPgydF4y2Ba值(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba;另见补充材料表S1)。减少的生物过程包括与细胞形态、运动、组装和组织以及生长和增殖有关的生物过程,而相关功能与细胞分化、细胞骨架组织、细胞质组织和细胞活力有关。只有少数途径受到流感病毒感染的积极影响,这些途径是细胞死亡和存活以及机体损伤和异常,它们都与细胞死亡、坏死和凋亡有关(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba表S1)。这些数据表明,直接感染的AEC有效地关闭了细胞功能并启动了程序性细胞死亡。gydF4y2Ba
如上所述,IFN通路基因在感染动物的AEC中增加最多。在感染AEC中10个最丰富的转录本中,与未感染的AEC相比,我们观察到的转录本数量增加了1842倍gydF4y2BaIfnb1gydF4y2BamRNA的丰度,以及360倍的增加gydF4y2BaIfnl3gydF4y2BaIRF7转录物表达量增加152倍(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba) (gfp -流感数据库)。相比之下,在旁观者AEC中,增加了551倍gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba转录本,增加118倍gydF4y2BaIfnl3gydF4y2Ba转录,并且增加了91倍gydF4y2BaIrf7gydF4y2Ba发现抄本(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba) (gfp -流感数据库)。独特的是,IFN-α16(也称为IFN-α6T)的丰度在感染的AEC中增加,比未感染细胞的丰度增加42倍(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba).旁观者AEC中IFN-α16的丰度没有增加。目前尚不清楚IFN-α16基因是否对病毒感染有反应,因为先前的研究表明,IFN-α16的启动子序列包含预测的IRF结合基序的突变,因此,该IFN的启动子可能不被IRF7结合(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba).这些结果表明,受感染的细胞,在每个细胞的基础上,比旁观者细胞产生更多的抗病毒细胞因子。gydF4y2Ba
流感病毒直接感染AEC可选择性地降低Wnt通路。gydF4y2BaIPA发现,直接感染AEC与旁观者AEC相比,Wnt信号通路受到不同的调控。Wnt/CagydF4y2Ba+gydF4y2Ba通路(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)和平面细胞极性(PCP)通路(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)与旁观者AEC相比,直接感染的AEC(见补充材料中的表S1)减少。与未感染的AEC相比,旁观者AEC中的这些通路未受影响(表S1)。以前的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究表明Wnt信号通路与病毒感染有交叉,不同的Wnt配体对干扰素的产生有不同的影响(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba).与旁观者AEC相比,感染AEC中的两个Wnt相关信号通路(Wnt/Ca)减少gydF4y2Ba+gydF4y2Ba途径和PCP途径(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2Ba),而编码β-catenin的CTNNB1被认为是受抑制的上游调节因子之一(表S2)。顶部上游调控分析确定了一个共同的转录因子或信号分子,可以解释在全球基因转录中观察到的变化。在这些途径中,与未感染的旁观细胞相比,gfp阳性直接感染细胞内的配体、受体和激活因子的丰度都降低了。当仅考虑Wnt配体时,与旁观者AEC相比,许多发现感染AEC中的丰度降低,包括gydF4y2BaWnt3gydF4y2Ba(39倍),gydF4y2BaWnt16gydF4y2Ba(30倍),gydF4y2BaWnt6gydF4y2Ba(23倍),gydF4y2BaWnt10agydF4y2Ba(9倍)gydF4y2BaWnt4gydF4y2Ba(2.6倍)。此外,已知Wnt配体受体的丰度,包括frizzled10 (gydF4y2BaFzd10gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),gydF4y2BaRor2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba),与旁观者AEC相比,感染AEC也分别减少了17倍和4倍。gydF4y2Ba
为了证实这些发现gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在人类流感病毒感染模型中,我们用PR8-GFP流感病毒感染了A549人肺上皮细胞。利用流式细胞术定量蛋白表达,我们检测了pr8 - gfp感染的A549细胞培养物中Wnt配体Wnt3a和Wnt受体Fzd10的表达。gfp阳性感染细胞与gfp阴性未感染细胞相比,Wnt3a蛋白水平降低(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)及Fzd10 (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),证实了我们的转录组结果。这些细胞中Wnt信号的减少是通过下游Wnt相关转录物,轴蛋白2 (gydF4y2BaAxin2gydF4y2Ba)及基质金属蛋白酶2 (gydF4y2BaMmp2gydF4y2Ba),在受感染的A549细胞(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba).由于PR8-GFP是一种实验室适应菌株,我们也用原代季节性流感病毒分离株感染了A549细胞,发现感染后wnt依赖性转录物出现了类似的下调(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba).为了进一步证实Wnt信号的主动下调,我们用含有Wnt3a的条件培养基处理pr8 - gfp感染的A549细胞。将外源性Wnt3a添加到未感染细胞中上调Wnt/β-catenin相关转录本gydF4y2BaAxin2gydF4y2Ba和gydF4y2BaMmp2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba).然而,当将外源性Wnt3a添加到PR8-GFP或原代季节性流感病毒分离株感染的A549细胞中时,感染细胞未能上调Wnt/β-catenin相关转录物gydF4y2BaAxin2gydF4y2Ba和gydF4y2BaMmp2gydF4y2Ba与未受感染的同类同等程度(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba).此外,为了确认流感病毒感染的A549细胞中Wnt信号的活性下调,根据GFP表达对感染细胞进行了分类,以确定感染细胞是否具有较少的β-catenin依赖性转录物。gfp阳性直接感染的A549细胞在感染后12小时的wnt依赖性转录物水平低于来自相同培养的gfp阴性A549细胞。该试验的一个局限性是,新感染的细胞在感染后12小时可能不表达GFP,因此可能严重污染真正GFP阴性的未感染群体(gydF4y2Ba图5克gydF4y2Ba).值得注意的是,在这些培养物中,gfp阴性和gfp阳性的A549细胞的wnt依赖性转录物显著下调,其丰度比未感染培养物中的A549细胞少40%(数据未显示)。先前的研究表明,转染1918年大流行病毒PB2蛋白,以及在较小程度上转染禽类PB2蛋白,能够在添加重组Wnt3a (gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).这一观察结果与先前的文献一起证明了Wnt信号可以增强干扰素反应(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)导致先前提出流感病毒可能通过Wnt途径作为逃避机制调节I型IFN的产生(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba).为了验证这一点,我们进行了检查gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIsg15gydF4y2BaWnt3a处理A549细胞后的转录物水平。然而,我们没有发现差异gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba或gydF4y2BaIsg15gydF4y2Ba外源Wnt3a加入感染培养物后的转录本(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba).这一观察结果也适用于其他I型和III型干扰素(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba).因此,流感病毒感染期间Wnt信号的任何影响似乎都与干扰素无关。这一结果可能是由于Wnt受体的下调,为了避免这一问题,我们在A549细胞中逆转录表达了一个组成活性的β-catenin分子来激活典型的Wnt信号通路。当我们用流感病毒感染这些细胞时,我们发现各组之间的传染性没有差异,这是由感染培养物中GFP阳性细胞的频率决定的,其中超过60%的细胞为GFP阳性(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba),我们也没有发现gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba干扰素刺激基因的转录本或诱导(gydF4y2BaIsg15gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba).然而,通过感染细胞培养上清的空斑测定,用组成型活性β-catenin分子转导的细胞产生的传染性病毒比对照转导和未转导的A549细胞少(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba).然而,β-连环蛋白信号传导如何影响感染性病毒的产生仍有待阐明(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba).上述观察结果表明,Wnt信号对病毒产生的负面影响独立于对病毒的影响gydF4y2BaIfnb1gydF4y2Ba.从这些研究和其他研究中(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),很明显Wnt信号在流感病毒感染后减少。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们的研究已经确定了感染AEC和旁观者未感染AEC的转录组gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba小鼠IAV感染,首次显示了由IAV直接感染诱导的独特基因表达谱。从感染肺部分离的AEC的转录组谱显示,参与IAV早期免疫应答的途径(包括干扰素信号、趋化因子信号和细胞死亡)的转录丰度普遍增加。肺部的炎症环境和病毒产物诱导了旁观者未感染细胞的基因表达变化,但感染AEC中病毒的存在诱导了更有效和独特的变化。gydF4y2Ba
在受流感病毒影响的途径中,干扰素、Wnt和细胞死亡途径特别令人感兴趣。这些途径似乎在gfp阴性的旁观者细胞和gfp阳性的感染细胞之间受到流感病毒感染的不同影响。干扰素信号通路主要表现为许多干扰素转录物的增加,这很可能是由于细胞质内的病毒产物激活了PRR,从而增加了干扰素的产生。有趣的是,在直接感染的AEC中,独特的干扰素诱导,如IFN-α16,表明不同的干扰素亚型可能在调节感染细胞的免疫反应中发挥作用,因为不同的干扰素亚型已被证明具有不同的刺激干扰素调节基因的能力(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
尽管上述与抗病毒应答相关的途径在感染AEC中有所增加,但与未感染AEC的旁观者相比,大多数途径都有所减少。这些减少的信号通路包括Wnt和NF-κB信号通路。Wnt信号通路涉及细胞发育、增殖、结构、极化和分化等多个方面(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).Wnt信号传导包括许多分子和转录靶点,但本质上分为三种途径:典型的Wnt信号传导途径(依赖于β-catenin)和两个非典型途径,Wnt/钙途径和PCP途径(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba).用Wnt3a刺激细胞是通过典型通路发出信号的最常用方法。流感病毒与Wnt通路之间的相互作用尚不清楚(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba).Shapira等人使用细胞报告系统量化干扰素刺激反应元件(ISRE)启动子活性,发现当细胞被病毒RNA转染或被ns1缺失的流感病毒感染时,Wnt3a预处理可以增强干扰素应答(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).其他使用A549细胞的研究表明,当细胞短暂转染具有组成性活性的β-连环蛋白分子时,感染禽流感病毒的病毒子代减少(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba).相反,Karlas等人发现,通过小干扰RNA (siRNA)介导的Wnt配体的敲低,对流感病毒复制有很强的抑制作用(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba).然而,这些研究并没有解决Wnt信号如何受到流感病毒感染的影响gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba感染。我们的数据首次显示,流感病毒感染的细胞与相同感染肺部的旁观者细胞相比,独特地下调Wnt受体和配体。我们的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究进一步证实,感染A549细胞可下调Wnt通路信号。此外,我们的研究证实,感染表达组成型活性β-catenin的A549细胞产生的病毒比对照细胞少。尽管干扰素转录和干扰素刺激基因的诱导不受组成型Wnt信号的影响,但这种情况仍然发生。这三种Wnt信号通路均下调gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba这可能表明对流感病毒感染的反应更为复杂。gydF4y2Ba
虽然先前的研究表明Wnt信号在病毒感染期间受到影响,并可能影响抗病毒反应(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),这些研究大多集中在典型的Wnt信号,但我们是第一个在一个gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba模拟PCP和Wnt/Ca的降低gydF4y2Ba+gydF4y2Ba流感病毒感染的途径。据报道Fzd10在气道上皮中表达(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),但其作用尚不清楚,而另一受体Ror2是一种受体酪氨酸激酶,参与调节肺中典型和非典型Wnt信号之间的平衡(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).多项研究表明,Wnt信号通路可增强I型IFN信号通路,而据报道流感病毒可抑制Wnt信号通路(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba).因此,在流感病毒感染的AEC中特异性发现Wnt通路的表达减少,反映了IAV采用的一种策略来减轻IFN信号及其抗病毒作用。然而,我们的研究使用具有组成性活性β-catenin的细胞和wnt3a处理的细胞表明,在流感感染期间,Wnt信号传导不影响I型IFN的产生和信号传导。Wnt信号,特别是Wnt/钙通路和PCP通路,负责细胞内部结构和组织。这些通路的缺失会损害细胞的定向和功能,并导致JNK诱导的细胞死亡(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba).此外,连接蛋白的表达和功能已被证明在细胞凋亡中起主要作用,一些蛋白质(如连接蛋白)被发现与凋亡相关蛋白(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba).在正常细胞中,NF-κB信号的同时激活可阻止该细胞死亡通路的激活(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba).有趣的是,我们发现与gfp阴性的AEC相比,gfp阳性的AEC中NF-κB信号也下调,这表明直接感染的细胞正在启动程序性细胞死亡途径。事实上,在感染期间增加的少数生物学功能中,包括那些与细胞死亡和凋亡有关的功能。由于PR8感染模拟了严重的流感病毒感染,肺泡上皮细胞引起的肺损伤是相当大的,而Wnt信号的下调可能在流感病毒的致病性中起作用,如其他人所见(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba).参与维持细胞结构和定位的所有三种Wnt信号通路的下调预计会损害肺功能和上皮修复,并可能导致流感病毒感染期间肺部观察到的致病性。与我们的结论一致,先前的研究也发现氯化锂增强β-catenin信号导致病毒子代减少,相反,由于成纤维细胞生长因子受体2b的下调,上皮修复减少(gydF4y2Bafgfr2bgydF4y2Ba上皮细胞(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba).事实上,在我们的数据集中,gydF4y2Bafgfr2bgydF4y2Ba在流感病毒感染的AEC中显著下调约1.6倍(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba).因此,除了Wnt信号可能对病毒产生的抑制作用外,它还在上皮修复中发挥作用。Wnt信号下调可能一方面有利于病毒,但也会影响组织修复和损伤。因此,靶向Wnt信号可以作为减轻损伤和抑制病毒复制的手段。gydF4y2Ba
最近的研究表明,2型AEC亚群中的Wnt信号传导维持了它们的干细胞样特性,而这种信号传导的减少促进了它们向1型AEC的分化(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).因此,我们在流感病毒感染中观察到的Wnt信号下调也可能是一种宿主反应,目的是促进2型AEC向1型AEC分化,以补充流感病毒感染期间受损的细胞池。有趣的是,在慢性阻塞性肺疾病小鼠模型中进行的研究发现,Wnt5a会损害肺愈合(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba),这是我们在数据集中发现下调的主要Wnt蛋白之一(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba).该通路的下调,特别是在感染细胞内,可能会促进流感致病性,因为Wnt信号是2型AEC更新所必需的(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba).因此,流感病毒对Wnt信号的下调可能在短期内补充1型AEC,但在长期内通过消耗2型AEC的更新而损害宿主肺修复程序。鉴于Wnt信号对AEC和肺的复杂作用,需要进一步的研究来确定Wnt是否可以改善或加速流感病毒后的肺恢复。gydF4y2Ba
我们的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba转录组研究进一步深入了解宿主对IAV感染的反应,使我们能够在感染动物的肺部分离出许多直接感染和旁观者AEC的个体贡献。我们的发现确定了流感病毒感染细胞中受影响的信号通路和基因,并可能提供干预目标,以降低与IAV感染相关的发病率和死亡率。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
动物。gydF4y2Ba根据美国实验动物护理认证协会(AAALAC)的标准,所有小鼠都被安置在德雷塞尔大学经过认证的屏障设施中。所有动物实验均由德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准。动物实验在IACUC批准的210108方案下进行。使用9天龄的胚胎鸡蛋不受IACUC的审查。无特定病原体(SPF)胚蛋从商业供应商(B&E eggs, PA)购买。所有的动物实验都是按照美国政府的规定进行的,包括《动物福利法》和《动物保护法》gydF4y2Ba公共卫生服务政策对实验动物的人道关怀和使用gydF4y2Ba(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
病毒和细胞。gydF4y2Ba重组A/Puerto Rico/8/34/GFP流感病毒(GFP-流感H1N1毒株,来自A. García-Sastre)在9日龄的鸡蛋中繁殖,并采用前面描述的空斑测定法进行滴定(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba).季节性流感病毒株A/Brisbane/10/2007和A/Netherlands/602/2009是Guus Rimmelzwaan(鹿特丹大学医学中心Erasmus MC病毒学系)的慷慨馈赠。人肺上皮细胞系A549 (ATCC, Manassas, VA)在Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM;Gibco)含10%胎牛血清(FBS;Gibco), 2 mM谷氨酰胺(Gibco), 100 U/ml青霉素(Gibco)和100 U/ml链霉素(Gibco), 37℃,5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba.流感病毒感染在感染的多重性(MOI)为1时进行,并在指定的时间点收获细胞用于下游分析。gydF4y2Ba
动物感染和细胞分类。gydF4y2Ba无特异性病原体的雌性C57BL/6小鼠购自Jackson实验室。小鼠以2,2,2-三溴乙醇(250 mg/kg体重,腹腔注射)麻醉(Avertin;以亚致死剂量(1 × 10)经鼻感染gydF4y2Ba6gydF4y2Bagfp -流感的PFU)。感染后3天,采集感染和未感染对照小鼠的肺,加工成单细胞悬液。细胞在抗cd16 /32 (Fc Block, 2.4G2;BD Biosciences)和抗cd45 (30-F11;BD Biosciences)抗体包被培养皿富集2型AEC。然后按前面描述的方法对洗过的细胞进行染色(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),使用单克隆抗cd45.2 (104;eBioscience)和抗cd326 (G8.8;eBioscience)抗体,然后在FACSAria仪器(BD Biosciences)上分选。分选后的2型AEC在TRIzol LS试剂(Life Technologies)中冷冻,温度为- 80℃。gydF4y2Ba
2型AEC RNA提取、文库制备及测序。gydF4y2Ba从分选的2型AEC中提取RNA,用紫外分光光度法(NanoDrop)定量。生物分析仪(Agilent)用于测定提取RNA的完整性。使用TruSeq链mRNA试剂盒(Illumina)生成条形码测序文库。通过生物分析仪评估文库的质量。采用Kapa定量PCR (qPCR)对两端有转接头的片段进行定量。采用固相可逆固定化(SPRI)微球对含bb0 ~ 5%适配器二聚体的样品进行再纯化。然后将样品稀释并运往北京基因研究所(华大基因)(中国香港)。在聚类生成和100 bp单端测序之前,通过生物分析仪和Kapa qPCR重新评估文库的质量和完整性。利用HTSeq2000 Illumina技术对文库进行测序。gydF4y2Ba
RNA-seq文库的处理和基因组定位。gydF4y2Ba使用Trim Galore(0.3.5版)从库准备适配器和低质量末端修剪RNA-seq库。gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/gydF4y2Ba]),使用默认参数。小鼠mm10基因组版本(mus_musus . grcm38)利用Tophat2 (gydF4y2Ba42gydF4y2Ba) (v2.0.11,带-p 6 -g 1参数),提供Mus_musculus.GRCm38.70。gtf注释。gydF4y2Ba
差异转录物丰度分析,基因大小的读取计数正常化,以及下游分析。gydF4y2Ba沿HTSeq基因(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba),使用默认参数和-s反向选项。Mus_musculus.GRCm38.75。gtf一个nnotation was used for counting. Differential expression analysis and normalization of read counts of all the libraries together were done with DESeq2 (v 1.4.5) (43gydF4y2Ba).不同两两比较的结果用对比参数提取。每个基因的归一化读取计数通过基因大小(Mus_musculus.GRCm38.75中所有外显子的总和)进行校正。使用R和GenomicFeatures (gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)文库,表示为NCPKG(仅考虑外显子区域)。NCPKG用于筛选低表达基因(<5 NCPKG)。两两比较有统计学意义的基因列表(调整)gydF4y2BaPgydF4y2Ba值<0.05,>2和>5 NCPKG的倍数变化)用于独创性途径分析(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)选择显著的典型途径和分子网络;美国试剂盒)。通路富集gydF4y2BaPgydF4y2Ba值(Fisher精确检验)和激活z分数由IPA计算,并用于对显著通路进行排序。gydF4y2Ba
A549感染。gydF4y2BaA549细胞以1.0 × 10的浓度在6孔板(康宁生命科学)上镀gydF4y2Ba6gydF4y2Ba每孔细胞数。对于多轮感染,细胞与重组PR8-GFP流感病毒或季节性流感病毒在37°C下以感染的多重性(MOI)为1孵育2小时,洗涤后在胰酶- edta (Fisher Scientific)存在的无血清培养基中孵育48小时。对于单轮感染,细胞以上述相同的方式感染,不同的是,感染后更换含血清的培养基。或将细胞与含有Wnt3a的条件培养基或对照条件培养基孵育至指定时间点。随后用TRIzol试剂(Life Technologies)重悬细胞。gydF4y2Ba
RNA提取和实时PCR。gydF4y2Ba使用RNeasy minikit (Qiagen)提取原代小鼠2型AEC或A549细胞RNA。提取的RNA使用高容量cDNA试剂盒(Applied Biosystems)进行逆转录,并使用7900HT快速实时PCR机(Applied Biosystems)进行分析。TaqMan基因表达检测试剂盒为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (Hs00610344_m1)、Axin-2 (Axin2) (Hs00610344_m1)、基质金属蛋白酶2 (Mmp2) (Hs01548727_m1)、IFN-β (Ifnb1) (Hs01077958_s1)、IFN-α2 (Ifna2) (Hs00265051_s1)、IFN-λ2 (Ifnl2) (Hs00820125_g1)和干扰素刺激基因15 (Isg15) (Hs01921425_s1)。采用GraphPad Prism软件进行统计分析。gydF4y2Ba
A549细胞染色及分析。gydF4y2Ba按前面描述的方法对细胞进行染色(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba).对于膜联蛋白V染色,所有缓冲液含有2.5 mM氯化钙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.根据eBioscience IC固定缓冲液方案对细胞进行渗透,并与以下单克隆抗体孵育:抗wnt3a(克隆217804;R&D Systems)或大鼠IgG2A异藻蓝蛋白(APC)同型对照(克隆54447;研发系统)。或者,细胞用抗卷曲10 (Fzd10)(兔多克隆,目录号sc-368103;Santa Cruz)。细胞用渗透缓冲液洗涤,与山羊抗兔IgG植红蛋白(PE)偶联交叉吸附二抗(目录号4052-09;南方生物技术)。所有孵育后冲洗细胞,将细胞固定在含有2.5 mM氯化钙的1%多聚甲醛(PFA)中gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,并利用LSR Fortessa仪器进行分析。所有数据均采用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。gydF4y2Ba
MDCK空斑测定。gydF4y2Ba从感染细胞培养物中收集上清液,在定量前在- 80°C冷冻。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞(ATCC)以3.0 × 10的浓度接种gydF4y2Ba6gydF4y2Ba感染前一天6孔板中每孔细胞数。用无血清培养液洗涤细胞,用稀释的感染上清液混合孵育1小时。除去含有病毒的培养基,用30ml 1.8%琼脂糖混合物的预热混合物分层细胞;30毫升Lonzo Leibovitz L-15改良培养基(目录号21083-027);Life Technologies),添加碳酸氢钠(目录号25080060;Life Technologies), HEPES缓冲液(目录号15630-056;Life Technologies)和青霉素-链霉素(目录号15070063;生命技术);和120 μl的a。%胰蛋白酶-甲磺酰基苯丙酰氯甲基酮(TPCK)(目录号LS003740; Worthington Biochemical)-treated solution. Cells were then incubated at 37°C for 72 h prior to fixation with 10% paraformaldehyde (catalogue number 15710; Brunschwig Chemie) for 30 min and staining with a 0.5% crystal violet (catalogue number 204330050; ThermoFisher Scientific)–methanol solution for 30 min. Plaques were then quantified, and PFU were back-calculated based upon the dilution.
加入数量(年代)。gydF4y2BaRNA-seq数据保存在Gene Expression Omnibus (GEO)中gydF4y2BaGSE119123gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
E.M.-C。,年代。l。,米。T.were supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council. This work was partially supported by NIAID grant U19AI106754 and by CRIP (Center for Research in Influenza Pathogenesis), an NIAID-funded Center of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS) (contract number HHSN272201400008C) (to A.G.-S.). This work was supported by funds from the Drexel University College of Medicine and Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam (to P.D.K.).
鹿特丹大学医学中心Erasmus MC病毒学部门,特别是Theo Bestebroer和Guus Rimmelzwaan,提供了初级流感病毒分离和感染帮助。Wnt3a条件培养基是来自Tokameh Mahmoudi, Elise de Crignis和Shahla Romal(鹿特丹大学医学中心Erasmus MC生物化学系)的慷慨馈赠。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2018年8月6日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2018年8月12日。gydF4y2Ba
- 已接受的稿件在网上发布gydF4y2Ba2018年8月15日。gydF4y2Ba
本文的补充材料可在gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1128/JVI.01325-18gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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- 版权所有©2018美国微生物学会。gydF4y2Ba
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