文摘
当前研究的目的是寻求证据相关性介质存在于肺癌微环境和子集的树突状细胞(dc)渗透这些肿瘤。
免疫组织化学和最近的抗体被用来定义DCs的表型出现在肺癌癌患者手术活检从12,和当地的趋化因子的表达可能参与这些细胞的招聘评估,信使rna和蛋白质含量。实时PCR用于分析mRNA的表达编码细胞因子影响dc的成熟在体外。
不同子集的骨髓DCs中肺癌,但没有确定plasmocytoid DCs。朗格汉斯细胞和CD1a + / Langerin细胞都散布在肿瘤细胞中,在数字相关产生的大量20 CC趋化因子配体在这些肿瘤。在大多数标本,DC-specific细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin-postive DCs也出席肿瘤床的边缘。没有识别和相关膜蛋白阳性DC-lysosomal DCs CD83 + DCs很少出现在肿瘤间质。所有肿瘤表达白介素(IL) -10年将增长factor-β和血管内皮生长因子,而IL - 12几乎缺席。
因此,各种类型的树突细胞浸润肺癌和显示一个不成熟的表型,大概是因为抑制细胞因子的微环境。
有前景的结果之前报道使用树突状细胞(DC)的疫苗接种尤其是免疫原性转移性黑色素瘤和肾脏癌等恶性肿瘤1,2。随后,大量临床试验评价各种策略的使用DCs为晚期癌症患者免疫治疗,包括肺癌3- - - - - -5。尽管一再T-cell-mediated免疫反应这些病人所示,这些治疗方法的临床疗效一般都是有限的3。因此,问题提出了关于人类DCs的类型和激活状态,应该用于诱导一个有效antitumoural免疫力。
事实上,DCs是高度异质细胞群,和无数的子集DCs与不同的功能能力已确定3,6。因此,骨髓DCs可以派生在体外从CD34 +前体或血液单核细胞,这些DCs可以分化成朗格汉斯细胞(LCs),特别是在转化生长因子(TGF) -β的存在3,6。血浆DCs来源于淋巴前兆,表达白介素(IL) 3受体(R;CD123)在他们的表面,为他们的成长依赖IL-3的存在3,6。DCs功能异构也根据他们的成熟状态3,6。因此,未成熟dc(如骨髓DCs通常出现在外围组织和LCs的表皮或呼吸道粘膜)捕获抗原,但弱刺激T淋巴细胞。在特定的信号,如脂多糖(LPS)或各种细胞因子,这些细胞成长为强大的lymphostimulatory细胞,这一过程与老年病costimulatory分子(CD80、CD86 CD40, DC-lysosomal相关膜蛋白(dc灯具)、CD83),并在其表面趋化因子受体表达的变化。不成熟的dc,尤其是LCs, CC趋化因子受体(CCR) 6-positive和应对CC趋化因子配体(CCL) 20(巨噬细胞炎性蛋白质(MIP) 3α),而成熟的DCs CCL19所吸引(MIP-3β)或CCL21(二级淋巴趋化因子)趋化因子新创CCR7表达7。应该强调,然而,即使是这些表型成熟dc可以引起致耐受性优先激活调控t细胞免疫反应8。事实上,完全成熟dc的一个关键特征是促炎细胞因子的生产,尤其是白介素,发挥了至关重要的作用诱导的一种有效辅助细胞1免疫反应,包括抗肿瘤细胞毒性免疫3,9。
DCs存在的微环境具有重要影响的成熟过程,因此影响免疫反应的最终结果8。因此,il - 10, TGF-β,血管内皮生长因子(VEGF)和前列腺素类抑制dc的成熟在不同的水平,而其他因素,如有限合伙人,干扰素(IFN) -γ或早期与CD40 ligand-expressing t细胞刺激他们的交互功能的能力3,6,8。
众所周知,肿瘤逃避免疫系统的监视通过各种机制,包括招聘的抑制和/或主机DCs的功能,和当地生产的免疫抑制因素10,11。因此,肿瘤微环境的精确知识,不同肿瘤类型之间的不同,是重要的设计最优的华盛顿对癌症治疗策略。
当前作者曾报道,各种数字的DCs渗入肺癌和表明这些细胞功能不成熟12。最近,新的标记出现在组织部分,使识别更广泛范围的DC的亚种群以及更好地评估他们的功能状态。在目前的研究中,这些新工具被用来进一步描述DC数量出现在nonsmall肺细胞癌,并评估当地的趋化因子的表达,可能在这些细胞的招聘中发挥作用。使用实时PCR、生产因素的肿瘤微环境已知的有关键影响DC函数也进行了分析。
方法
组织标本
活检得到了原发性肺癌癌12例(9个男性;三个女性;平均年龄64±8年,所有吸烟者)胸外科的时候。肿瘤的组织学类型是:鳞状细胞癌(n = 5),腺癌(n = 5);未分化的大细胞癌(n = 2)。没有病人接受化疗或放疗时的评估。这项研究是通过路易友谊医院的机构审查委员会。
处理组织和形态学评估
肺部肿瘤活检是立即快速冷冻和储存在液氮直到所需隔离的RNA或免疫组织化学评估。冷冻标本的组织病理学特征进行评估使用低温恒温器部分沾苏木精伊红结束。整个tumoural表面的每个部分量化使用图像分析系统(维视;Histolab,埃夫里市,法国)。在所有情况下,第二个组织片段固定在Bouin-Hollande解决方案,由常规处理技术和用于诊断目的。两个石蜡包埋标本也用于免疫染色anti-CCR6抗体。
隔离的RNA和互补脱氧核糖核酸的合成
从每个样本总RNA孤立使用Rneasy迷你包(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)根据制造商′年代指令和量化的测量吸光度在260海里。互补DNA合成(互补)是使用一个Omniscript逆转录酶工具包(试剂盒)根据制造商′s指令。
互补脱氧核糖核酸的定量实时PCR
10μL整除的cDNA样本放大的25μL Taqman普遍PCR反应混合液(美国优秀的,促进城市,CA), 2.5μL Assays-on-Demand(优秀)包含特定的引物和探针为每个基因目标评估(CCL20 CCL19,集落刺激因子(gm - csf)、白介素,IFN-γ,il - 10, TGF-β,il - 4, VEGF)和22.5μL水(50μL最终体积)。放大的反应混合物内部积极控制(减少磷酸甘油醛脱氢酶)包含25μL Taqman普遍PCR大师混合,10μL cDNA、200 nM每个特定向前(5′acc有条件现金援助GGC CAA GGT猫C)和反向(5′gg GGC猫CCA CAG TCT TC)引物,200 nM Taqman探针(5′- (6-carboxyfluorescein (FAM) gg猫广汽CAC AGT CCA TGC猫行动(小沟粘合剂(MGB)))和水(50μL最终体积)。在所有情况下,循环参数如下:50°C 2分钟,10分钟95°C,紧随其后的是40在95°C周期为1分钟15秒和60°C。放大的具体cDNA和内部积极控制总是在同一时间执行,所有样品的并行。Gene-specific PCR的方法,测量了产品ABI棱镜7000序列检测系统(优秀)。所需要的周期数达到阈值荧光(Ct)确定,序列最初出现的数量被外推到标准曲线计算。所有反应都是在重复执行,两个值的均值是用于计算。目标基因表达不同样本之间的正常化是基于表达式的值的内部标准。
免疫组织化学技术
单克隆抗体在这项研究中的应用是:anti-CD11c (BU15;Immunotech,马赛,法国);anti-CD1a (BL6;Immunotech);anti-Langerin (DCGM4;Immunotech);anti-CCR6 (53103.111;研发系统,阿宾顿、英国);anti-DC-LAMP (104. g4;Immunotech); anti-CD83 (HB15a; Immunotech); anti-IL-3R (S-12; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-CD3 (UCHT1; Immunotech); anti-CD19 (J4.119; Immunotech). Immunoglobulin (Ig)G1 (679.1Mc7; Immunotech) and IgG2b (MOPC-195; Immunotech) control antibodies were used to assess nonspecific binding. Purified goat polyclonal antibodies used were: anti-MIP-3α (CCL20); anti-MIP-3β (CCL19); anti-DC-specific intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin (anti-DC-specific intracellular adhesion molecule grabbing nonintergin (SIGN)) and anti-CCR7 (all from Santa Cruz).
免疫组织化学染色进行如前所述12系统,使用Vectastain ABC-alkaline磷酸酶(美国向量,伯林盖姆,CA)和快速红底物。疣状CCR6在两个石蜡包埋标本进行如前所述13。免疫染色强度分级从-(缺席)+ + +(强烈积极的)。完整协议得分之间获得了两个独立的观察者。确定CD1a +和Langerin +细胞的数量在一个给定的活组织检查,阳性细胞数使用光学显微镜的放大400×(40×客观和10×目镜),和整个串行部分表面沾有两种抗体是评估。结果表示为细胞·毫米2组织切片。Inter-observer变异< 10%。
统计分析
结果意味着±sd,除非另有说明。比较了使用Mann-Whitney紫外线测试,除了组织学类型和淋巴结分期用Fisher精确检验。数量之间的相关性分析CD1a +细胞浸润肿瘤标本和趋化因子和细胞因子使用斯皮尔曼相关系数进行了研究。的假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
表面表型的树突细胞浸润nonsmall肺细胞癌
不同数量的CD11c + DCs (即。骨髓DCs)是存在于所有nonsmall细胞癌标本。相比之下,没有CD123 + (IL-3R) DCs (即。血浆DCs)观察肿瘤组织评估在目前的研究中,虽然有些内皮细胞CD123 +,证实了anti-CD31疣状在串行部分(没有显示)。
肺部肿瘤标本被CD1a + DCs不定地渗透。这些CD1a +细胞的分布是不均匀的在一个给定的肿瘤和阳性细胞在本质上是局部的肿瘤结节内点缀在肿瘤细胞(图1⇓)。有趣的是,12个样品评估可以分为两组根据CD1a +细胞浸润组织的数字部分:六个样品被CD1a + DCs严重渗透,而一些CD1a +细胞被确定在剩下的六个标本(表1⇓;18.9±8.4,2.3±1.2细胞·毫米2分别;两组比较p < 0.01)。CD1a +细胞的数量呈现在一个组织标本和组织学类型没有联系或淋巴结分期的肿瘤手术后(表1获得⇓;p > 0.2)。Langerin +细胞被明确观察到在一些肿瘤组织标本和有相同的分布,CD1a +细胞(图1 b⇓)。引人注目的是,然而,在串行组织部分,Langerin +细胞的数量总是低于CD1a +细胞(表1⇓)。此外,很少或根本没有Langerin +细胞被发现在五个标本,其中包括两肺肿瘤严重渗透CD1a +细胞(表1⇓)。
表型的树突状细胞(dc)肺浸润癌。一)包含许多CD1a +细胞腺癌肿瘤结节。b)一段相同的肿瘤显示由Langerin +细胞浸润。c)鳞状细胞癌显示存在DC-specific细胞间粘附molecule-grabbing nonintegrin-positive细胞周围的肿瘤结节。酒吧= 100μm规模。d)从标本连续切片图1 c所示⇓是负anti-CD68抗体。e) DC-lysosomal相关膜蛋白免疫染色。没有观察到积极的DCs。注意,上皮细胞肿瘤结节附近强烈积极的。f)几个CD83 +细胞腺癌存在。模拟)比例尺条= 100µm, e)比例尺= 180 = 75µmµm和f)规模酒吧。
有趣的是,DC-SIGN +细胞也被观察到在七个肺肿瘤活检(表1所示⇑)。串行组织部分,这些细胞被证明是CD1a,局部地区立即肿瘤浸润周围(图1 c⇑)。此外,这些DC-SIGN +细胞,没有例外,CD68(图1 d⇑)。相反,没有观察到任何DC灯具+ DC 12肺肿瘤评估,虽然在五个肿瘤,II型pneumocytes邻近肿瘤结节与anti-DC-LAMP抗体反应强烈(图1 e⇑)。几个CD83 + DCs中观察到10的12个肿瘤,基本上在肿瘤周围的结缔组织间质结节(图1 f⇑)。这些细胞树突形态特征和CD3 -和CD19 -(没有显示)。
趋化因子和趋化因子受体的表达在肺部癌
信使rna编码CCL20被发现在所有组织标本,尽管在变量数量。引人注目的是,CCL20信使rna的含量高出定量的6个标本大量CD1a渗入+细胞与测量在剩下的六个样品包含几个CD1a +细胞(分别为14.1±13.3,2.4±1.6;p < 0.05;表2⇓和图2⇓)。疣状与anti-MIP-3α抗体表明肿瘤细胞表达CCL20的主要细胞类型,虽然这个表达式的强度差异很大从一个肿瘤标本到另一个地方。肿瘤严重渗透的CD1a + DCs强烈积极CCL20及分级从+ +(适度积极的)+ + +(强烈积极)由两个独立的观察员(图3⇓),而5 6包含几个CD1a +细胞的活检阴性(-)趋化因子和剩余的标本反应弱与anti-CCL20抗体(+)(图3 d⇓和图3 e⇓)。此外,CD1a +细胞在肿瘤标本的数量和大量的信使rna编码CCL20强烈相关(r = 0.95;p < 0.001)。令人惊讶的是,然而,CD1a + dc肿瘤标本中总是CCR6负,尽管CCR6 +淋巴细胞显然是存在于相同的样本(图3 b⇓)。没有CCR6 + DCs中观察到两个肿瘤石蜡包埋标本表达大量的CCL20 mRNA(数据没有显示)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/6/1170/F2.medium.gif)
)CC趋化因子配体的表达(CCL) 20和b)集落刺激因子(gm - csf) mrna在肿瘤严重渗透,由CD1a +细胞(░)和肿瘤包含几个CD1a +细胞(□)。实时PCR的结果表示为最初的副本数量。两组比较p < 0.05的肿瘤。
比较生产CC趋化因子配体(CCL) 20肺癌和CD1a +细胞的存在。一)鳞状细胞癌显示强阳性反应与anti-CCL20肿瘤细胞的抗体。b)虽然没有CC趋化因子受体(CCR) 6-positive树突细胞,淋巴细胞,即。淋巴agugates, CCR6 +同样的样本。c)连续切片的组织标本包含众多CD1a +细胞在肿瘤细胞中。d)腺癌弱阳性CCL20 immunodetection。e)几个CD1a +细胞从肿瘤出现在连续组织切片d所示,一部)比例尺条= 200µm, b) = 25µm规模酒吧。
信使rna编码CCL19也发现在所有标本进行了研究。没有区别观察CCL19 mRNA的表达水平,然而,在比较肿瘤严重渗透,通过CD1a +细胞标本包含几个CD1a +细胞(分别为8.6±10.6,5.2±4.7;p > 0.2;表2⇑)。疣状与anti-CCL19抗体进行了11个肺肿瘤活组织检查,并积极在五标本(图4⇓)。除了肿瘤细胞,细支气管上皮细胞、内皮细胞和一些淋巴细胞趋化因子也积极。没有CCL19 mRNA表达之间的相关性观察或疣状和CD83 + DCs或DC-SIGN +细胞。最后,CCR7 +细胞只出现在四个肿瘤标本内皮细胞形态分析证实了和CD31免疫染色(图4 b⇓)。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/28/6/1170/F4.medium.gif)
CC趋化因子配体19的)疣状腺癌显示阳性的肿瘤结节。酒吧= 200μm规模。b)鳞状细胞癌沾anti-CC趋化因子受体抗体。注意,只有内皮细胞是积极的。酒吧= 150μm规模。
细胞因子表达模式在tumoural微环境
评估的潜在影响肿瘤微环境在DCs在肺癌癌、实时PCR用于测量mrna的表达编码gm - csf, IFN-γ,il - 12、il - 4、il - 10, TGF-β和VEGF的12肺肿瘤活检。根据当前作者之前报道,gm - csf mRNA的所有样本中,检测出,但出现在大量的肿瘤活检大量CD1a渗入+细胞(分别为18.2±16.6,1.5±1.6册,;p < 0.05;表2⇑和图2⇑)。CD1a +细胞的数量有密切关系的信使rna编码gm - csf表达所有12个样品(r = 0.94;p < 0.001)。VEGF mrna编码,TGF-β,il - 10和IFN-γ表示在所有标本,无论数量和表型的DCs肿瘤(表2中⇑),没有观察到的相关性与CD1a +细胞在肿瘤标本的数量(所有细胞因子r < 0.3, p > 0.3)。il - 4和il - 12 mrna在12中只有两个标本中发现了每个细胞因子(表2⇑)。值得注意的是,il - 4 mRNA的表达与DC-SIGN +的存在无关DCs在同一肿瘤活检。
讨论
目前的研究表明:1)不同成熟骨髓DCs的子集,但不是血浆DCs渗透nonsmall细胞癌;2)MIP-3α(CCL20)当地生产可能发挥作用的招聘CD1a +这些肿瘤细胞;和3)肺癌产生几个因素已知的抑制DCs的功能。
表型的DCs肺浸润癌
所有肿瘤标本进行本研究包含CD1a + DCs,尽管在变量数据从一个肿瘤转移到另一个。正如前面目前报告的作者14,这些细胞在肿瘤结节在本质上是局部的,点缀在肿瘤细胞。目前,表明这个人口DCs可以进一步分为CD1a + Langerin +细胞(即。LCs)和CD1a + Langerin -细胞。类似CD1a +子集还发现了在乳房癌15,16。CD1a + Langerin -细胞可以LCs的前身,或炎症树突intratumoural同行的表皮细胞中描述的一些皮肤疾病6,17。
还识别目前是另一个人口的DCs CD1a表示DC-SIGN, c型凝集素参与捕获抗原,与t淋巴球的交互18。这些细胞出现在七12肺癌和总是局部肿瘤床的边缘。除了他们的树突形态,DC-SIGN总是CD68 +细胞,作为评估使用串行组织部分,进一步确认他们没有巨噬细胞。DC-SIGN + DCs在甲状腺癌、黑色素瘤,最近发现和这些细胞也局部肿瘤的边缘19,20.。最后,尽管据报道,il - 4 DC-SIGN的表达是一个重要的因素21,信使rna编码细胞因子并不是七个标本中检测到实时PCR渗透的直流子集,这表明其他因素参与DC-SIGN表达式在DCs的表面在活的有机体内。这些DC-SIGN + DCs的存在的意义在人类肿瘤仍有待研究。
很少CD83 + DCs观察结缔组织基质的肺部癌,表明大部分的直流子集渗透这些肿瘤未成熟DC。这些细胞树突形态特征,不沾anti-CD3或anti-CD19抗体,进一步确认他们没有激活的T -淋巴细胞。符合这个想法,没有tumour-infiltrating DC DC灯具表示,另一个DC成熟的标志。这些结果与以前的观测协议当前作者CD1a +肺癌细胞CD40, CD80和CD86负面的12。引人注目的是,然而,在peritumoural上皮细胞组织,尤其是II型pneumocytes, dc灯具高度表达。dc灯具的表达,在正常的人类肺二型pneumocytes最近报道22。因此,dc灯具应该不再被视为特定DCs,作为最初的想法。
血浆DCs浸润其他类型的癌最近被确定,它已经表明,这些细胞可能参与了受损的免疫反应对肿瘤和不利的结果20.,23。相比之下,血浆DCs目前没有确定肺部癌研究。这不能反映技术问题,因为CD123 +内皮细胞(如证实了这些细胞的染色CD31标记)被证明存在于相同的组织部分。有趣的是,Conejo-garciaet al。24最近,在动物模型中,人口迁移到内皮的DCs和表达标记树突和内皮血统。因此,尽管CD123 +细胞鉴定内皮形状,在当前的研究中有一个特点,这些细胞可能代表了对应的内皮DCs不能排除在外。
通过肺部癌趋化因子生产
在最近的研究中,为CCL20 mRNA表达的各种肿瘤标本的编码,但表达明显与肺CD1a +细胞浸润癌的数量。评估这趋化因子蛋白的表达水平,用免疫组织化学显示肿瘤细胞趋化因子的主要来源,并进一步证实了这个表达式的强度之间的相关性和负担的tumour-infiltrating CD1a + DCs。CCL20的表达也被报道在其他肿瘤,虽然相关的特定子集的DCs并不成立16,19。有趣的是,在一些实验模型,CCL20的表达在肿瘤与DCs的当地招聘,尽管抗肿瘤反应的最终结果是有争议的25- - - - - -28。
引人注目的是,目前的研究未能识别CCR6 + DCs在任何肿瘤标本,尽管一再努力,而CCR6 +淋巴细胞观察在相同的组织部分,表明CCR6的表达在DCs的表面是软弱和不被使用的抗体。在这方面,尽管CCL20的表达之间的相关性和乳房癌的浸润CD1a + DCs据报道,CCR6受体的表达,这些细胞没有评估16。同样的,尽管原位CCR6受体的表达已经被免疫组织化学评估在某些病理组织标本石蜡包埋,antigen-retrieval程序之前进行免疫染色19,29日。事实上,小数据目前可用的检测CCR6 snap-frozen DCs表面的组织。为了进一步解决这一点,两个肿瘤石蜡包埋标本CCL20 mRNA的表达大量沾anti-CCR6抗体,显示不包含积极的DCs。因此,CCR6抗原的表达在DCs的表面可能是免疫组化技术检测的阈值水平以下。
CCL19趋化因子mRNA表达所有肺部癌评估。CCL20表达相比,一些细胞类型,除了肿瘤细胞,沾anti-CCL19抗体。这生产CCL19有点奇怪,因为一些成熟(CD83 +) DCs在肺癌癌、观察和CCL19之间没有相关性可以建立和存在的任何子集的DCs存在于组织评估,包括CD1a +细胞的数量。CCL19表达式可能发挥作用在幼稚t细胞和自然杀伤细胞的招募,假设没有在本研究评估7,30.。然而,值得注意的是,唯一CCR7 +细胞类型识别是内皮细胞。因此,还需要更多的研究来定义CCL19在肺癌中的作用,并确定是否CCL19表达式是有益的或有害的anti-tumoural免疫力。
细胞因子在肺癌癌微环境
之前找到当前的作者,gm - csf nonsmall肺癌中表达,表达的水平与CD1a +浸润细胞的数量14,证实了本研究。这些发现表明,CCL20不是唯一中介参与招聘的DCs的肺癌。符合DCs肺浸润癌的不成熟的表型,细胞因子的平衡模式在肿瘤微环境,然而,显然转向DCs的抑制环境成熟。因此,在所有的标本,信使rna编码il - 10, TGF-β和VEGF检测到,不管DCs存在于肿瘤的子集,并没有观察到的相关性CD1a +细胞的数量。这三个因素是有效抑制DC的成熟和功能的介质,并已不同程度地与有缺陷的抗肿瘤免疫反应10,11,31日,32。相比之下,虽然IFN-γ信使rna是存在于所有肿瘤,只有两个样品包含信使rna编码il - 12,安装有效的细胞毒性抗肿瘤免疫反应的关键细胞因子在动物模型和人体试验3,9。综上所述,虚拟的il - 12和DC成熟的抑制因素的优势表明,肿瘤微环境不太可能是t细胞活化的吉祥。
目前的研究是有限的,然而,少量的样本评估和结果,虽然明确,应该进一步证实。
然而,这些结果阴影在肺癌中树突细胞生物学,并表明肿瘤微环境本质上是抑制树突状细胞的成熟。这些结果阐述策略时应该考虑使用树突状细胞免疫治疗肺癌患者。
确认
作者想感谢毛m .优秀的技术援助。
- 收到了2005年10月1日。
- 接受2006年7月14日。
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