抽象
细胞凋亡与增殖和外源性表面活性剂对这些过程的影响呼吸窘迫综合征和死胎机械通气/氧处理过的早产儿的肺进行了调查。
凋亡和增殖指数是在肺组织切片从27通风/氧治疗早产婴儿和29个死胎确定。外源性表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响在16名通气早产儿进行了研究;11名未处理的婴幼儿作为对照。凋亡和增殖的细胞通过双标记结合终端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记或Ki-67的与细胞标记蛋白鉴定。途径细胞死亡被切割的胱天蛋白酶-3,-8,-9的免疫标记研究。
在通气/氧处理早产儿的肺中,凋亡细胞和增殖细胞的数量与死胎的肺中相应的数量相比显著增加。肺泡上皮细胞凋亡,而上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞增殖。表面活性剂处理可减少通气/氧处理诱导的细胞凋亡;然而,下降并不显著。caspase‐8和‐9不参与呼吸诱导的凋亡,而caspase‐3参与了凋亡。
总之,通气/氧处理诱导早产儿肺上皮细胞凋亡和上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。
细胞凋亡与增殖的胚胎和胎儿生命过程中参与了几个进程并发挥正常细胞更新和组织发展具有重要作用。
虽然他们有牵连的获得正确的细胞数量的机制,他们参与病理过程。在肺中,这些过程可导致从氧损伤引起的高的氧浓度。然而,氧疗常常需要从肺部疾病的患者。这是早产儿和新生儿的呼吸窘迫综合征(RDS)的痛苦,谁需要氧气的浓度超生理维持足够的血氧张力,尤其如此。
在动物模型中,高氧状态下的细胞凋亡显著增加1-3。另外,可以示出氧过多诱导提高的基因的表达编码促凋亡蛋白1,2。增殖,但是,停止作为高氧的在细胞培养实验与肺泡上皮细胞,成纤维细胞和结果气管平滑肌细胞4-6。
外源性表面活性治疗仍然RDS的既定处理。最近,已变得越来越明显的是,外源性表面活性剂制剂对细胞生理学和肺中的包括促炎性细胞因子,超氧化物的产生和肺宿主防御的调节抑制显著影响炎症过程7,8。然而,没有任何已知的表面活性剂有关的对细胞凋亡和肺组织细胞的增殖在高氧肺损伤的影响。
虽然凋亡与增殖起到明显的发展和肺组织损伤的高氧具有重要作用,调查已经仅仅进行了动物模型,只有最近的一项研究认为,细胞凋亡与RDS通气早产儿的几个器官9。在本报告中所述的工作以检查细胞凋亡和增殖,特别是在人的死产胎儿和早产儿的与暴露于机械通气和升高的氧浓度RDS肺组织的肺。这两个进程作为肺发育的组成部分和通风的在上凋亡和增殖的氧浓度升高的影响的发生进行了研究。在这些高氧过早损坏人体肺部,对细胞凋亡和增殖的表面活性剂可能产生的影响还研究。另外,研究了是否胱天蛋白酶-3,-8或-9在信号级联放大导致细胞凋亡活性。
材料与方法
研究人群
从1985 - 2000年期间,在病理学系(维尔茨堡大学,维尔茨堡,德国)执行的所有婴幼儿尸检程序的报告进行了审查。
选择在22-36周的妊娠无肺部或泌尿生殖系统畸形胎儿交付儿和早产儿的研究,如果他们没有表现出肺炎,绒毛膜羊膜炎,脐带或placentitis的炎症;159案件符合这些标准。相应的肺组织尸检样品已经常规福尔马林固定和石蜡包埋。Sections had been cut at a thickness of 4 µm and stained with haematoxylin and eosin. They were examined microscopically and only nonautolytic and well-preserved material was selected for the present study. Fifty-six subjects were chosen and the study population divided into two groups. One group comprised 29 stillborn foetuses aged 22–36 weeks of gestation (mean±sem 28.0±0.8 weeks) and the other 27 infants live born at 23–36 weeks of gestation (27.9±0.7 weeks) with RDS, who had received ventilatory support and supplemental oxygen. Ventilator records were reviewed and the mean daily inspiratory oxygen fraction and mean airway pressure were determined and averaged over the duration of ventilator treatment.
为了研究凋亡细胞和增殖细胞数量的变化是否与氧浓度升高通气时间有关,将RDS早产儿分为3组,分别为0-1天、1-3天和>3天。此外,在机械通气/氧处理的早产儿RDS中,表面活性剂治疗和不治疗也被考虑。
Clinical details of the infants studied are given in table 1⇓。
终端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法
使用凋亡检测试剂盒(Qbiogene, Heidelberg, Germany)按照制造商说明,使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)检测与凋亡相关的脱氧核糖核酸(DNA)片段。20 mg·L显视过氧化物酶-13,3'‐二氨基联苯胺盐酸盐在0.05 M tris-(羟甲基)-氨基甲烷(tris) (pH 7.6)中含有0.01%的过氧化氢。标本经水冲洗,1g·L复染-1Mayer的苏木解决方案。阴性对照在不存在终端脱氧核苷酸转移酶的标记的脱氧尿苷三磷酸处理。
Ki量67免疫组织化学
Immunocytochemical demonstration of Ki‐67 was performed employing a rabbit polyclonal antibody directed against Ki‐67 (Dako, Hamburg, Germany) diluted 1:50 in0.25 M phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.4)/10% foetalcalf serum (FCS) and a streptavidin/biotin conjugate kit (Biogenex, San Ramon, CA, USA) with 20 mg·L-13,3'‐diaminobenzidine tetrahydrochloride as chromogen, in 0.05 M Tris (pH 7.6) containing 0.01% H2Ø2。Tissue sections were microwaved six times for 5 min each at 800 W in 10 mM citrate buffer (pH 6.0). Negative controls consisted of samples submitted to primary incubation with PBS/FCS. The sections were counterstained with 1 g·L-1Mayer的苏木解决方案。
细胞凋亡与增殖的定量
为了量化凋亡和增殖的程度肺组织,来自每个组织切片4个随机视野进行使用Zeiss Axiophot显微镜(Zeiss,Oberkochen的,Germany)和AGFA RSX在40倍的放大倍数拍摄的二世电影(Agfa-Gevaert,勒沃库森,德国;ASA 50)。使用幻灯机(Kindermann magic screen IR, Ochsenfurt, Germany)观看幻灯片,然后手动计数。测定各部位细胞核总数和阳性染色细胞核数;每个磁场500-750个原子核,即每组织切片2000-3000细胞核进行计数。凋亡指数(AI)被计算为是TUNEL阳性或凋亡细胞核的总数的百分比,和增殖指数(PI)作为分别的Ki-67免疫染色的百分比。
半胱天冬酶免疫组织化学
对于切割的免疫组化检测,即激活时,胱天蛋白酶-8和-9,所述单克隆抗体11G10(新英格兰生物实验室,贝弗利,MA,USA)和兔多克隆caspase-9的切割位点(316分之315)特异性抗体(Biosource公司国际,尼维尔,比利时)分别为used, each diluted 1:50 in 0.25 M PBS (pH 7.4)/10% FCS. Although tissue sections submitted to cleaved caspase‐9 immunolabelling were not microwaved, tissue sections for the immunohistochemical detection of cleaved caspase‐8 were microwaved twice for 5 min each in citrate buffer. Immunohistochemistry was performed using the streptavidin/biotin/peroxidase method.
For detection of activated caspase‐3, tissue sections were boiled in citrate buffer for 5 min at 124°C and immunostained using activated caspase‐3 antibody (New England Biolabs) diluted 1:20 and the Histostain Plus Kit (Zytomed, Berlin, Germany).
双immunolabelling
进行双免疫标记,用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色团的检测分别TUNEL阳性细胞核和Ki-67,的和immunoalkaline磷酸酶与固蓝BBN重氮盐和萘酚结合免疫过氧化物酶AS-MX磷酸盐作为底物检测细胞角蛋白18,CD34或肌动蛋白。Peroxidase was developed using 20 mg·L-13,3'‐二氨基联苯胺盐酸盐在0.05 M Tris (pH 7.6)中,含0.01% H2Ø2and alkaline phosphatase activity was visualised wih 50 mL 1 mg·mL-1Fast Blue BNN diazonium salt in Tris (pH 7.4) containing 1 mLñ,ñ‐dimethylformamide, 10 mg naphthol AS‐MX phosphate and 25 mg levamisole for 10 min to give blue deposits. Mouse monoclonal antibodies directed against cytokeratin 18 (clone DC 10), CD34 (clone QBEnd 10) and muscle actin (clone HHF35; all Dako) were diluted 1:50 in 0.25 M PBS (pH 7.4)/10% FCS and incubated overnight. The antibodies were detected using a streptavidin/biotin conjugate kit (Biogenex, Hamburg, Germany).
统计分析
单因子变异数分析被用来比较的AI和PI胎儿死产在不同胎龄的差异。胎儿死产的认可和PI与机械通气/氧治疗早产婴儿和表面活性剂处理/未处理组的使用Mann-Whitney U-检验进行比较。使用Kruskal-Wallis检验,随后bypairwise使用Mann-Whitney U-检验比较进行机械通气/氧气治疗的不同的持续时间在AI和PI的差异进行分析。的<0.05的p值被认为是显著。数据表示为中位数和四分位范围。
结果
凋亡和人胎儿肺细胞增殖(死产胎儿)
从年龄分布22-36周妊娠的人类胎儿死胎肺切片检查凋亡细胞中,其可视化原位采用TUNEL法。不能排除的是,坏死细胞也含有TUNEL染色浓度的3'‐羟基DNA末端。但TUNEL阳性细胞表现出细胞核固缩、细胞萎缩等凋亡形态学特征。此外,我们还对活化的caspase‐3进行了免疫组化染色,这是凋亡信号通路的一个重要的caspase调控因子。这证实了凋亡细胞的发生和TUNEL检测的结果。
TUNEL阳性细胞核的定量揭示了胎龄22-36周的胎儿肺部爱的显著变化。平均AI在0.8(0.4-1.5)保持不变。
对相同的肺样本进行Ki‐67免疫组化,以确定细胞增殖的程度。在此期间,中位数PI保持在1.8(1.4-3.2)。
氧浓度升高通气治疗早产儿呼吸窘迫综合征肺内细胞凋亡与增殖
In lung tissue sections from preterm infants with RDS aged 23–36 weeks of gestation who required mechanical ventilation and supplemental oxygen, considerably more TUNEL‐positive nuclei were demonstrated than in lung tissue sections from stillborn foetuses (fig. 1a and b⇓)。This result was confirmed by anti-activated caspase‐3 immunohistochemistry, which also revealed more apoptotic cells in lung tissue sections from mechanically ventilated and oxygen-treated preterm infants than in those from stillborn foetuses (fig. 2⇓)。
通气/氧处理的RDS患儿肺细胞凋亡的中位百分率是死胎的中位AI的6倍(通气/氧处理的新生儿4.8(2.4-10.4),死胎0.8 (0.4-1.5);p <0.001)(图3a⇓)。
As with TUNEL‐positive cells, the number of proliferating (Ki‐67‐positive) cells was raised in the lungs of preterm infants with RDS in association with mechanical ventilation/oxygen treatment (fig. 1c and d⇑)。The median PI was 3.9 (1.9–6.7) in this group and 1.8 (1.4–3.2) in the stillborn foetus group (p<0.01) (fig. 3b⇑)。
细胞凋亡和增殖的水平依赖于氧浓度升高时机械通气的持续时间
从胎儿死产肺部的AI相比,TUNEL阳性细胞从早产儿RDS,谁在升高的氧浓度通风,肺百分比显著后<1天通风的增加,以及后1-3天和>通风的3天(死胎0.8(0.4-1.5),通风<1天2.8(1.0-8.0),1-3天3.3(2.2-7.7),>3天13.3(7.5-15.5); p <0.001) (fig. 4a⇓)。
我们也评估了在高氧浓度下机械通气时间对早产儿RDS肺内PI的影响。随着通气时间延长(死产胎儿1.8(1.4-3.2),通气时间<1天2.8(1.5-4.6),1 - 3天3.7(2.4-5.0),>3天6.9(6.0-10.7),中位PI升高;p < 0.001)(图4 b⇑)。
凋亡和增殖的细胞的鉴定
对死胎胎儿的肺部进行双重染色显示,在妊娠22-25周的肺发育阶段,稀疏的TUNEL阳性细胞核优先定位于间充质细胞和内皮细胞(图5a和b)⇓), whereas, in the lungs of older stillborn foetuses (26–36 weeks of gestation), apoptotic nuclei were detected mainly in alveolar epithelial cells (fig. 5c⇓)。
In lung specimens from preterm infants with RDS exposed to mechanical ventilation at elevated oxygen concentrations, double labelling revealed that mainly cytokeratin 18‐positive epithelial cells were apoptotic (fig. 6a and b⇓)。相比之下,只有少数TUNEL检测阳性细胞核中CD34阳性血管内皮和平滑肌α应承担actin-positive肌肉细胞。
双标记以鉴定增殖的细胞类型显示,没有优选的细胞类型,无论是在从死胎肺组织也不机械通气/氧处理过的肺组织。
表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响
将接受表面活性剂治疗的早产儿和未接受表面活性剂治疗的早产儿的AIs和PIs进行比较。
通风/氧治疗的婴儿与谁收到表面活性剂RDS肺的平均AI小于一半,在不具有表面活性剂治疗的患者(表面活性剂3.3(2.8-7.5),不含表面活性剂7.4(1.6-11.7))(图中发现。 7⇓)。然而,统计分析显示,实验组之间的AI差异不显著。
机械通气/氧处理过的早产儿的肺的中值PI与表面活性剂治疗的存在和不存在RDS是相同的(表面活性剂3.9(1.9-7.9),不含表面活性剂3.8(1.9-6.5))。因此,增殖明显不通过与RDS机械通风/氧处理过的早产儿的肺表面活性剂处理的影响。
导致机械通气/氧处理肺细胞凋亡的途径
为了探索生化途径,导致细胞死亡死产胎儿并用RDS通风/氧处理过的早产儿的肺部,免疫标记切割胱天蛋白酶-3的,-8和-9进行。
在死胎的肺组织,切割的半胱天冬-8和-9观察偶尔,在上皮细胞和间质细胞。在升高的氧浓度通风后,有在任一的程度或裂解的caspase-8-或-9-免疫阳性细胞的分布没有变化。
然而,在通风/氧处理过的早产儿的呼吸窘迫综合征中,活化的caspase-3的量的显着增加的肺组织检测与死产胎儿的肺组织相对比。As shown in figure 2b⇑,激活caspase-3的免疫阳性细胞多,而且主要是肺泡上皮细胞。Øn the contrary, in the lungs of stillborn foetuses, activated caspase‐3 was merely detectable immunohistochemically (fig. 2a⇑)。
讨论
在本研究中,研究表明,由于在高氧水平下机械通气,早产儿RDS的肺中凋亡细胞和增殖细胞的数量显著增加。外源性表面活性剂对细胞增殖无影响,但可能有抗凋亡作用。凋亡信号通路的启动子caspases‐8和‐9与机械通气引起的高氧浓度下的凋亡无关,而caspase‐3参与了这一过程。
应该记住,早产儿的临床治疗是一个复杂的过程,要与患者的个人需求相协调。因此,所检查的组间存在一定的异质性是不可避免的。此外,机械通气加氧与高氧血症、气道压力升高和机械拉伸有关,这些因素对细胞凋亡和增殖的影响可能不同。物理力激活细胞凋亡和增殖的机制仍有待研究。在II型上皮细胞和成纤维细胞中已经发现了周期性拉伸引起的细胞凋亡10,11。大鼠肺成纤维细胞的增殖,但是,通过循环机械拉伸抑制12,而在α平滑肌肌细胞,应变增加增殖13。在肺中高氧细胞反应已在动物模型中已经研究了,并有暴露于高氧已经显示出诱导细胞凋亡和增殖1-3,11。机械通气时在与RDS早产儿的肺部细胞凋亡与增殖的氧浓度升高的影响本研究导致的结果,它们与高氧动物模型的研究结果一致。
本研究清楚地表明,胎儿肺的增殖和凋亡是肺发育的正常过程。在上皮细胞、内皮细胞和肌肉细胞中均有增殖,这与之前的研究结果一致14。该PI低,没有孕周22-36期间显著变化。相比之下,其他研究者已描述了人类的肺在妊娠后期增殖逐渐减少15。
经检测的发育时期死胎肺的凋亡活性也较低,且无变化。这一结果与在发育中的大鼠中描述了低而持续的AIs的研究结果是一致的16和人类胎儿的肺15。根据与从兔子研究中获得的结果17,由间充质多观察到的转变,并在从泪小管到终端囊状阶段(第26次孕周)中的过渡内皮成主要上皮细胞凋亡。可能的是,增加的上皮细胞凋亡可以连接到II型的分化和I型肺泡上皮细胞,在此时间内发生18。
数据显示,在高氧浓度的机械通气条件下,人胎儿肺中凋亡细胞和增殖细胞的数量显著增加。
早产儿的肺中指数增加了2.2倍。这一观察结果与细胞培养实验结果相反,在细胞培养实验中,高氧抑制成纤维细胞的增殖五,平滑肌细胞4和上皮细胞19。增殖的停止被认为代表防止损坏模板DNA的复制的基本保护机制。分子,如P21WAF / CIP1和p53,促进细胞周期停滞,在高氧期间上调20.和信使核糖核酸(mRNA的)编码细胞周期蛋白组蛋白和胸苷激酶不高氧的条件下翻译19。然而,在大鼠肺和肺外植体培养,高氧的条件下,增加的增殖,特别是II型肺泡细胞和成纤维细胞中,观察到10,11。这表明,相对于细胞培养实验,组织细胞的增殖是由不同细胞类型的细胞/细胞的相互作用的影响。有丝分裂原如碱性成纤维细胞生长因子821,角质细胞生长因子22和胰岛素样生长因子-I23恢复期间可能刺激增殖。在组织修复,所有肺细胞类型的增殖,可以检测24。在高氧浓度通气的肺中,不能识别优先增殖的细胞类型。
细胞凋亡在人类早产儿,谁收到通气和氧载体的肺组织的深刻增加,达到了平均AI那是在胎儿死产六倍高于。
此外,机械通气/氧气治疗的持续时间起着早产儿肺细胞凋亡中起关键作用。随着在氧气含量升高,增加机械通气时间,凋亡细胞的显着增加百分比中位数可以证明。在一些高氧动物模型系统,在发生凋亡的细胞的百分比的增加也同样依赖于时间1,2。这可能是由于活性氧簇(ROS)的积累。在肺泡上皮细胞培养物中进行的研究显示,细胞凋亡诱导不纯氧而是通过ROS25。这些分子是通过线粒体的电子传递系统产生的26通过中性粒细胞和吞噬细胞的浸润27并通过氧化酶28。所述ROS积聚在肺组织在升高的氧浓度延长通风。细胞抗氧化系统的早产儿的肺部不成熟29最有可能导致ROS和H的间隙不足2Ø2通过抗氧化剂和防止有效限制氧化剂的爆发,调解分子损伤导致细胞生理学和凋亡的改变。
与23-36周妊娠的RDS机械通气/氧处理过的早产儿的肺,细胞凋亡在肺泡和支气管上皮细胞优先增加。在小鼠中,Barazzone等。1发现高氧状态下肺内皮细胞凋亡增加。对经机械通气/氧处理的RDS早产儿肺部细胞凋亡的研究,这一发现尚不能得到证实。肺泡上皮细胞是抵御高氧损伤的第一线防御,并含有在高氧条件下增加的抗氧化活性,如II型肺细胞所示30.。暴露于高氧动物的肺其他研究也表明,虽然所有的细胞室在riskof氧化损伤,肺泡和支气管上皮细胞氧中毒的主要目标和凋亡3。
由于各种动物模型和细胞培养的研究都强调了肺表面活性剂的生理和免疫调节作用7,8外源性表面活性剂对在通风/氧处理过的肺细胞凋亡和增殖的影响是令人感兴趣的。以前,已经显示,在成纤维细胞培养的表面活性剂抑制增殖8和表面活性剂脂质还导致有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖抑制31。然而,早产儿的与暴露于机械通气和补氧RDS肺,外源性表面活性对增殖没有影响。
关于凋亡,朝向外源性表面活性的保护作用仅观察到一种趋势。平均AI的表面活性剂处理后下降;但是,减少并不显著。
凋亡的关键效应因子是一系列天冬氨酸特异性蛋白酶,即caspases。已经提出了一个模型,其中caspase‐8被死亡受体介导的凋亡激活,而caspase‐9在药物治疗、紫外线或化学诱导剂的作用下激活32。迄今为止,既没有胱天蛋白酶-8,也不caspase-9的已在人类研究发育的胎儿或机械通风/氧处理的肺部。
这两种caspase在死产胎儿的肺中偶尔被激活,在囊状和小管状阶段。迄今为止,caspase‐9 mRNA已在人类胎儿肺中得到证实33这可能证实了目前的发现。鼠肺发育过程中细支气管上皮和II型上皮细胞凋亡介导表面抗原(Fas)受体及其配体(FasL)的检测17,34还支持目前的结果。这些蛋白可能参与信号级联导致裂解的caspase-8。
令人惊讶地,在早产儿与在升高的氧浓度机械通气,增加既不裂解的caspase-8也不处理RDS肺部-9是可检测的。相比于从死胎肺组织切片然而,相当多的胱天蛋白酶-3激活。在这些检查基,胱天蛋白酶-3阳性细胞发生在相同解剖区域和大致相同的数量TUNEL阳性细胞。显然,信号级联通过caspase-3的不暴露于高氧的早产儿的肺部裂解半胱氨酸蛋白酶8和-9导致参与细胞死亡。胱天蛋白酶-3介导的凋亡,其中既不胱天蛋白酶-8,也不胱天蛋白酶9由切割被活化也在AKR-2B细胞最近证明血清剥夺的结果35。
综上所述,细胞凋亡与增殖是在22-36岁周妊娠的胎儿死产的肺部肺发展的有机组成部分。本研究表明,在与机械通气/氧处理连接经历凋亡和增殖在呼吸窘迫综合征增加早产儿的肺细胞的数目,用通气的持续时间是一个重要因素。细胞凋亡增加介导通过caspase-3的。无论是细胞凋亡也没有增殖指数显著差异作为表面活性剂处理的结果。细胞凋亡和增殖的这些机械通气/氧处理的肺中的分子机制仍有待确定。
- 收到2003年4月7日。
- 公认2003年7月29日。
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