文摘
核转录因子的表达(NF) -κB细胞的激活和炎性介质的指标生产。本研究的目的是描述p65的表达和本地化,NF-κB的主要单元,支气管粘膜的慢性阻塞性肺病(COPD)患者,并检查p65表达式和疾病状态之间的关系。
支气管活检获得来自14个吸烟者与慢性阻塞性肺病,17岁的吸烟者与正常肺功能和12不吸烟者肺功能正常。p65阳性(+)细胞的数量被免疫组织化学和量化的表达p65支气管活检的三组检测免疫印迹(WB)。
吸烟者与正常肺功能和COPD患者增加了数量的p65 +细胞上皮和增加p65核表达。在慢性阻塞性肺病患者上皮p65 +细胞的数量与气流限制的程度。世行分析显示,吸烟者p65增加与正常肺功能和慢性阻塞性肺病患者(p < 0.05)。
在吸烟者支气管活检与正常和慢性阻塞性肺疾病患者肺功能显示p65蛋白表达增加,主要在支气管上皮细胞。疾病严重程度增加核factor-κB上皮的表达。
这项研究得到了戴尔'Asma Associazione / la Ricerca e la的看台(ARCA,帕多瓦,意大利),萨尔瓦多Maugeri基金会IRCCS,“Ricerca Corrente”和葛兰素(英国)。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)可以被定义为慢性肺量测定法证实了不可逆气流限制1- - - - - -3它的特点是缓慢渐进的和不可逆的肺功能恶化1- - - - - -3。吸烟是慢性阻塞性肺病的发展的主要危险因素,吸烟者占超过90%的慢性阻塞性肺病患者在发达国家1- - - - - -3。最近的研究从COPD患者进行支气管活检报告增加t淋巴球浸润(CD3 +和CD8 +细胞),巨噬细胞4- - - - - -6和增加的碳碳趋化因子受体5水平轻度到中度慢性阻塞性肺病7。此外,炎症反应在慢性阻塞性肺病与炎性蛋白的表达增加,细胞因子、趋化因子等8和粘附分子5,9,10。发生在慢性阻塞性肺病的炎症变化也出现在吸烟者没有慢性阻塞性肺病,但程度不一样9。
这些炎症诱导的基因编码的蛋白质是由转录因子,结合监管(发起人)地区的这些基因调节的转录率10。尽管许多转录因子可能参与这些炎症基因的规定,1、核factor-κB (NF-κB)似乎是特别重要的11。基因的细胞因子和其他介质已被报道参与COPD气道的炎症过程,包括白介素(IL) 112,il - 613,引发14- - - - - -16,单核细胞化学引诱物蛋白(MCP) 117肿瘤坏死因子(TNF) -α18,endothelin-119分泌白细胞蛋白酶抑制剂20.和细胞间粘附分子(ICAM) 121,22,都是由NF-κB监管23- - - - - -25。
NF-κB的活性形式是一个异质二聚体,通常由两个亚基组成,p65 (RelA)和p50。在静息细胞NF-κB保留在细胞质中由于结合抑制蛋白(IκB)。当细胞适当刺激,IκB揭示退化核本地化p65信号,所以它正迅速安置到细胞核,它绑定到特定κB识别目标基因的启动子区域中的元素23。许多细胞外刺激,包括IL-1βTNF-α、氧化剂和脂多糖激活NF-κB在许多细胞包括上皮细胞和淋巴细胞)10。
先前的研究表明,细胞p65蛋白的表达可能与疾病状态和早期哮喘患者的支气管粘膜的渗透26。在本研究作者识别和量化细胞的数量表达p65蛋白在上皮黏膜下层的支气管活检COPD患者和对照组的比较正常的吸烟者和非吸烟者的肺功能。t细胞的百分比子集(CD4 +和CD8 +)共同表达p65蛋白支气管活检黏膜下层的COPD患者也被量化。
方法
主题
活检从43个受试者被免疫组织化学检查,31日是吸烟者和12是不吸烟者与正常肺功能。的严重性气流限制是使用标准的全球倡议慢性阻塞性肺病1:14吸烟者有轻度到中度慢性阻塞性肺病(在一秒钟用力呼气量/用力肺活量(FEV1预测和FEV / FVC)率< 70%1> 30% pred)和17(健康的吸烟者,FEV肺功能正常1/ FVC率> 70% pred)(表1所示⇓)。
6控制不吸烟者,8个健康吸烟者和五个COPD患者(平均±标准差:FEV1% pred: 107±8与94±9与72±15 (p < 0.05与控制吸烟者和不吸烟者相比,分别)用于免疫印迹分析p65表达式的支气管活检。
所有的研究对象遭受最近恶化,定义为增加呼吸困难与痰液的质量和数量的变化,会使他们在月前研究就医。所有受试者免费急性呼吸道感染和上部没有收到糖皮质激素,茶碱在前一月内或抗生素。所有受试者nonatopic (即。他们消极的皮肤测试常见的过敏原提取物),没有过去的历史哮喘和过敏性鼻炎。
每个主题进行了一次采访中,胸片、心电图、血常规测试,皮肤测试常见的过敏原提取物、支气管镜检查前2 - 5天之间和肺功能测试。这项研究符合赫尔辛基宣言,从每个主题获得了知情同意。支气管活检是根据当地伦理委员会的指导方针。
肺功能测试和卷
肺功能测试包括FEV的测量1和FEV1各科/ FVC基线条件下检查(6200 Autobox肺功能实验室;美国Sensormedics Corp . Yorba琳达,CA)。的预测是那些使用正常的值没有产品du碳et de l′Acier27。为了评估气道阻塞的可逆性,FEV1测量与FEV的科目1≤80%重复吸入后20分钟200µg舒喘灵。
Fibreoptic支气管镜检查,收集和处理支气管活检
不吸烟者和吸烟者与正常肺功能和慢性阻塞性肺病患者参加了支气管镜检查套件午夜08.30 h禁食后,用阿托品预处理(0.6毫克注射。)和咪达唑仑(5 - 10毫克注射。)。氧气(O2)(3 L·分钟−1)管理通过鼻尖头叉子在整个手术过程中,O2饱和与数字血氧计监测。使用利多卡因局部麻醉(4%),上呼吸道和喉,一个fibreoptic支气管镜(奥林巴斯BF10 Key-Med,邵森德,英国)是通过鼻腔进入气管。进一步利多卡因(2%)低喷到航空公司,和四个支气管粘膜活检标本取自节段和subsegmental航空的上下叶使用大小19凹的钳。支气管活检免疫组织化学的描述后进行处理。支气管活检免疫印迹分析立即放置在冰和加工如前所述28。
免疫组织化学
活检标本轻轻地从钳中提取和加工光学显微镜如前所述6,7。两个样本嵌入在组织Tek II最佳切削温度(10月)(美国英里科学,内伯威尔市,IL),冻结在15分钟内异戊烷在液氮预冷,并存储在−80°C。最好的冷冻样本然后面向6-µm厚低温恒温器部分减少了免疫组织化学光学显微镜分析。两个部分在一个间隔100µm被适当的染色和免疫组织化学方法。后面板的抗体被用来确定t淋巴球,早期肠(CD4 +和CD8 +细胞)和NF-κB p65蛋白:鼠标anti-CD3抗原(M756;Dako、伊利、英国)总t淋巴球,鼠标anti-CD4抗原(M716;Dako)为辅助,鼠标anti-CD8抗原(M707;Dako) T-suppressor /细胞毒性和兔子anti-p65 (sc - 372,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)为NF-κB p65蛋白。主要抗体测定(如前所述)6,7。总之,阻塞后使用血清非特异性结合位点源自相同的动物物种二级抗体,鼠抗体主要是应用于最佳稀释在三-(羟甲基)氨基甲烷(三)缓冲盐水包含0.05米(0.15米盐TRIS-hydrochloric酸在pH值7.6)和孵化(1 h)在室温下湿室。抗体绑定是演示了使用碱性磷酸酶anti-alkaline磷酸酶系统(Dako APAAP装备系统K 670)和坚牢红底物。应用兔多克隆抗体(1 h)之前是孵化h为3%2O220分钟之后,孵化在亲和素(20分钟)和生物素(20分钟)屏蔽解决方案(sp - 2001, Vectastain工具包)和阻止血清。兔多克隆抗体被孵化比显示在一个生物素化的猪anti-rabbit抗体(E431 Dako 30分钟),ABC复杂合(K377 Dako 30分钟)和3,3′diaminobenzidine tetrahydrochloride (S3000 Dako 15分钟)。Double-staining了兔子anti-p65蛋白质和鼠标anti-CD4 CD8-antigens作为主要抗体(1 h)其次是孵化猪anti-rabbit辣根过氧化物酶共轭(P399;Dako)和山羊anti-mouse碱性磷酸酶共轭(A2179;σ)二级抗体(1小时)揭示了孵化3,3′diaminobenzidine tetrahydrochloride (S3000 Dako 15分钟)和坚牢红底物(APAAP装备系统K699 Dako 20分钟)。控制幻灯片包含在每个染色运行使用人类扁桃体是一个积极的控制总淋巴细胞(CD3抗原),组织化学染色早期肠。CD4 +, CD8 +细胞,p65 +细胞,以及double-stained细胞在面积100µm量化上皮基底膜下在几个不重叠的大功率领域,直到所有可用的区域覆盖。最终结果,表示为每平方毫米阳性细胞的数量,计算执行的所有细胞计数的平均在每个切片的幻灯片。双染色p65 + / CD4 +, p65 + / CD8 +量化在同一地区,最终的结果是表达CD4 +和CD8 +细胞的比例,分别。p65 +细胞也被量化的保存完好的上皮(由柱状和基底上皮细胞)和p65数目表示+每毫米长度的上皮细胞。 A mean±sd of 0.750±0.350 mm of epithelium was analysed in COPD patients and control subjects. Counting was performed by a colleague in a blinded manner.
Light-microscopic分析的放大x900分辨率下玩t淋巴球的量化,早期肠,p65蛋白,double-stained上皮细胞和黏膜下层。Leitz则形态学尺寸进行了光学显微镜(生物医学,徕卡剑桥,英国)连接到一个录像机连接到计算机图像系统(定量电视显微镜500图像处理和分析系统,软件Qwin V0200B,徕卡)。
沾了共焦显微镜部分p65(1:50稀释,圣克鲁斯生物技术)和视觉效果使用rhodamine-conjugated二级抗体完全如前所述29日。原子核的视觉使用Vectashield-mounting中4,6-diamino-2-phenylinodole (DAPI)封面(向量实验室)染色和玻璃密封安装介质(distrene、增塑剂、二甲苯(DPX))。幻灯片是用共焦显微镜观察。Confocal-scanning激光显微镜图像采集用Lieca共焦显微镜,配有488/514 nm双频氩离子激光。一个油浸的目标是使用。图片收集使用TCSNT软件(莱卡)。
免疫印迹分析p65
全细胞蛋白提取从支气管活检如前所述28。总之,支气管活检与机械resuspended中断30 - 50µL 1 x reporter-lysis缓冲区(Promega,南安普顿,英国),蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏分子生化药剂,刘易斯,英国)立即冻结−70°C,解冻后至少60分钟。蛋白质浓度测定在布拉德福德的上层清液方法根据制造商的指示(英国)赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室。至少30µg·莱恩−1全细胞蛋白的受到dodecylsulphate钠10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)和转移到硝基过滤器(Hybond-ECL, Amersham淀粉微球生物科技)印迹。过滤器被封锁之前使用脱脂奶粉5%孵化与兔子anti-p65抗体(圣克鲁斯生物技术)。p65检测使用一个antirabbit抗体结合辣根过氧化物酶(Dako)稀释1:4000和immunocomplexes想起使用增强化学发光(ECL)推荐的制造商(Amersham法玛西亚生物技术)。
作为内部控制每个过滤器reprobed以反人类的肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术)。
43 kDa(肌动蛋白)或65 kDa (p65)乐队量化使用微和抓住它和GelWorks软件(UVP,剑桥,英国),表示为相应的肌动蛋白光密度值比相同的车道。
数据分析
组数据被表示为平均数±标准差。组之间的差异进行了分析使用方差分析(方差分析)功能数据,和形态的克鲁斯卡尔-沃利斯检验数据。差异显著时,方差分析测试是紧随其后的是一个未配对t检验比较组和克鲁斯卡尔-沃利斯检验是紧随其后的是Mann-Whitney紫外线测试组之间进行比较。用斯皮尔曼相关系数计算的排名方法。概率p < 0.05的值被认为是重要的。数据分析使用统计视图执行SE图形程序(Abacus概念Inc .)、伯克利、钙、美国)。
结果
临床研究结果
表1中报告主题特点⇑。三组受试者进行相似年龄。吸烟史是相似的在COPD患者和健康的吸烟者。如预期的选择标准,FEV的值1(% pred)和FEV1/ FVC(%)明显不同的组与慢性阻塞性肺病而健康的吸烟者和控制非吸烟者(整体组织,方差分析测试:FEV p < 0.00011%,FEV1/ FVC %值)。
p65支气管上皮细胞的免疫组织化学
的总数p65免疫反应性的支气管上皮细胞与正常肺功能显著增加了吸烟者(215±55·mm细胞−1)和慢性阻塞性肺病患者(279±95个细胞·毫米−1)与肺功能正常与不吸烟者相比(143±37·mm细胞−1;整体组:p = 0.0007;无花果1 - 2⇓⇓⇓⇓)。
在支气管上皮之间没有显著差异的吸烟者与正常肺功能和慢性阻塞性肺病患者的总数p65免疫反应性的细胞(无花果1 - 4⇑⇑⇑⇑)。
p65核染色
覆盖的图片红色p65染色和蓝色(DAPI)核染色显示,吸烟者和主题没那么强烈的蓝色色与慢性阻塞性肺病指示colocalisation(图3所示⇑)。p65核染色增加在健康吸烟者(70±2,p < 0.01)和主题与慢性阻塞性肺病(76±2,p < 0.001),而正常对照组(35±12,无花果3 - 4⇑)。染色的强度也得分在1 - 4强度范围内,证实了光学显微镜数据。正常人(1.5±0.5)减少了强烈p65染色较健康的吸烟者(2.5±0.3,p < 0.05)和主题与慢性阻塞性肺病(2.8±0.2,p < 0.05)。
CD3、CD4和CD8支气管黏膜下层的免疫组织化学
CD3 +和CD8 +细胞数量显著增加在黏膜下层的吸烟者与正常肺功能和慢性阻塞性肺病患者与不吸烟者相比正常肺功能(CD3 +: 334±117与539±238与与不吸烟者相比556±229,p < 0.05;CD4 +: 182±75与214±152与294±165;CD8 +: 144±65与334±175与275±98 p < 0.05与不吸烟者相比,分别对不吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病)。双染色法在慢性阻塞性肺病患者的支气管黏膜下层的识别CD4 +和CD8 +细胞共同表达p65蛋白显示,大约有三分之一的t细胞中的子集p65(图5所示⇓)。
形态和肺功能数据之间的相关性
当分析全球所有吸烟者(与正常肺功能或慢性阻塞性肺病患者)p65-immunoreactive上皮细胞的数量是反向,FEV显著相关1(% pred) (r =−0.43, p < 0.05), FEV1/ FVC比(r =−0.50, p < 0.05)(图7所示⇓)。当分析局限于气流限制患者(COPD患者),这些关系维护(r =−0.78, FEV p < 0.051%;为FEV r =−0.75, p < 0.051/ FVC %)(图7所示⇓)。
没有其他重要的形态和功能之间的相关性数据或形态参数之间whole-subjects组或与气流限制观察对象。
讨论
这项研究表明在支气管活检与肺功能正常的吸烟者和吸烟者都有轻度到中度慢性阻塞性肺病有两个增加到了原来的4倍p65蛋白的表达与支气管活检相比,从控制不吸烟者。使用共焦显微镜核p65染色增加在健康吸烟者和COPD受试者与控制。此外,与轻度到中度COPD受试者,p65 +上皮细胞的数量增加了100%,与气流限制的程度显著相关。此外,功能参数(FEV之间显著负相关1%,FEV1/ FVC %)和数字p65 +细胞的上皮细胞,还建议增加疾病的严重程度之间的关系和上皮p65表达与COPD受试者。
在之前的研究中执行轻度到中度慢性阻塞性肺病患者4- - - - - -7淋巴细胞和巨噬细胞数量的增加,以及增加存在ICAM-1上皮5在内皮细胞,内皮细胞白细胞粘附molecule-15和巨噬细胞炎性protein-1β支气管肺泡灌洗液8已报告。许多炎症的迹象,如MCP-1超表达8也被观察到具有吸烟者与正常肺功能,即使在较小程度上比在慢性阻塞性肺病患者9。然而,转录因子的作用,可以调节许多炎性蛋白的转录率(il - 1、il - 6、引发MCP-1, TNF-α,ICAM-1)尚未调查支气管活检在慢性阻塞性肺病患者。
有报道称炎性细胞浸润为在慢性阻塞性肺病加重病人的增加9,这是猜测,反复发作的病毒和细菌来源,可能诱发一连串的事件导致NF-κB诱导和激活,细胞因子和趋化因子的生产和进一步的炎性细胞浸润。不幸的是,收集受试者接受支气管活检的发作是难以执行,很少被病人接受。因此,直接证据NF-κB参与支气管炎症在慢性阻塞性肺病加重病人的是很难获得的。然而,增加细胞的数量表达核p65表明他们可能更正常激活炎症侮辱比正常细胞不吸烟的科目。本报告在许多细胞类型的超表达p65刺激炎症基因的结果23也在阻止癌细胞的恶性肿瘤30.。这可能有助于解释越来越多、越来越严重的发作后这些主题类似的刺激。
细胞的激活NF-κB取决于NF-κB和抑制蛋白质的相对水平。正常的休息条件下所有NF-κB由IκB留存在细胞质中。增强表达NF-κB或p65这里描述的亚基,可以克服IκB的抑制性影响从而导致核易位和炎症基因表达的增加航空公司的吸烟者与COPD受试者4- - - - - -9。这是最明显的看到在体外表达研究p65表达否定的要求外源性刺激激活NF-κB响应基因31日。这可能发生,因为吸烟者和有COPD的科目增加了p65本地化与正常对照组相比,这可能反过来诱导细胞因子的生产和ICAM-1表达在上皮的吸烟者和慢性阻塞性肺病患者4- - - - - -9。作者认为增加p65表达式不是由于细胞浸润增加,虽然这发生,因为他们表达少p65每个细胞在数量上少于上皮细胞。
观察增加p65表达存在不仅在慢性阻塞性肺病患者的上皮细胞也在吸烟者的上皮细胞与正常肺功能表明,香烟烟雾本身能够诱导上皮细胞活化。超过4000个粒子和氧化剂在香烟烟雾被描述32,这可能构成一个连续的外部挑战吸烟的支气管上皮细胞。反过来,这可能引起NF-κB表达式和/或激活在支气管上皮细胞使其可能更能够诱导炎性细胞因子的生产。
作为t淋巴球代表对产生细胞因子的主要来源之一,在慢性阻塞性肺病患者的一个子集(6科目)双重染色进行识别的CD4 +和CD8 +细胞中的p65。发现大约三分之一的t细胞表达p65子集。这些数据表明,t细胞可能子集可能参与细胞因子的生产引起的核表达p65与COPD受试者。
最后,它已经表明p65的总量,由西方墨点法评估,增加支气管活检的吸烟者与正常肺功能和慢性阻塞性肺疾病患者。这似乎是由于增加的数量p65 +上皮细胞控制不吸烟者相比,通过免疫组织化学方法如图所示。这些结果表明在所有吸烟者上皮细胞的重要角色,作为核factor-κB蛋白质的来源。之间的正相关程度的气流的数量限制和p65 +上皮细胞在慢性阻塞性肺疾病患者也报道,表明上皮p65表达的变化可能与疾病的状态有关。
- 收到了2001年8月13日。
- 接受2002年3月28日。
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