文摘
有一个细胞外基质(ECM)之间的亲密关系,在气道平滑肌细胞。很少有研究全面评估不同的ECM组件的构成及其监管机构在气道平滑肌(ASM)在哮喘。
借助图像分析,部分地区总胶原蛋白和弹性纤维中量化ASM 35科目与致命的哮喘(FA)并与10非致死性哮喘(NFA)患者和22 nonasthmatic控制情况。胶原蛋白我和III,纤粘连蛋白的表达,versican,基质金属蛋白酶(MMP) 1、2、9和-12和组织抑制剂metalloproteinase-1和2量化在ASM在22个FA和10控制情况。
FA大型航空公司的情况下,部分区域内的弹性纤维ASM增加与NFA和控制。同样,纤连蛋白,MMP-9和MMP-12增加在足总病例的ASM在大型航空公司与控制。弹性纤维增加小航空公司只FA与NFA相比的病例。
有改变的细胞外基质成分和趋向下降的环境内的致命的哮喘患者气道平滑肌,这可能对机械和合成有重要影响气管平滑肌功能。
气道平滑肌(ASM)的主要效应控制呼吸道口径,在ASM和结构变化的基础可能是气道高反应性是哮喘的特征1。病理研究描述了ASM沿着支气管树质量,增加与细胞肥大的证据2和增生2,3。ASM细胞也被认为是免疫调制剂在哮喘和分泌多种炎症介质,如细胞因子、趋化因子和生长因子4。
哮喘患者的增厚ASM层还包括细胞外基质(ECM)成分有重要的角色在决定ASM的力学性能,以及之间的转移力ASM从ASM细胞周围的细胞和组织1。ECM是由胶原结构以及noncollagenous结构,如弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白。在ASM细胞影响至关重要的过程,如增殖,迁移,生存和介质的分泌5。
它曾被证明ASM细胞暴露在哮喘患者血清的生产增加ECM蛋白质的水平6。反过来,ECM蛋白质能够影响ASM的增殖和分泌状态7。ASM细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)和组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)8,在免疫调节中的作用机制调节ECM成分在哮喘患者。
在哮喘患者中,异常沉积的ECM元素被描述在黏膜下和外膜领域的大型和小型航空公司9- - - - - -12。ECM的部分地区也已被证明是在ASM层增加致命的哮喘(FA)病例13,但有更好的理解这个问题重要的原因。首先,ECM成分在ASM的变化可能会影响其收缩特性。用胶原酶消化的ECM ASM导致增加力量的生成和缩短ASM的条14。相反,一个给定的ECM成分在ASM层可能限制缩短,防止过度的气道狭窄15。其次,描述中的基质金属蛋白酶的表达和TIMPs ASM可以增进了解参与哮喘的改造。第三,ASM ECM成分可以影响表型的改变细胞16。
有几乎没有任何的数据在活的有机体内组成不同的ECM组件及其监管机构在ASM哮喘。因此,在目前的研究中,主要的肺ECM元素的表达(胶原蛋白、弹性纤维,纤连蛋白和versican), MMP的家族成员(金属蛋白酶- 1、2、9和-12)和组织抑制剂(TIMP-1和2)测定在ASM层在哮喘患者的肺组织。
方法
本研究的一部分人口已经先前描述9,10,12,17- - - - - -19。本研究对人类的研究审查委员会批准的圣保罗大学医学院(CAPPesq-FMUSP;巴西圣保罗),由查尔斯爵士Gairdner医院伦理委员会(Nedlands、澳大利亚)。
研究人群
圣保罗的情况下
组织获得受试者死了FA和经历了解剖病理学的部门,圣保罗大学,1996年到2003年之间。都有哮喘,以前的历史记录了采访的家庭,并没有其他肺部疾病。临床数据,包括治疗、吸烟习惯、疾病的持续时间,以前的人住院,最后的攻击,持续时间管理问卷调查获得的近亲。Nonasthma控制(NAC)被定义为那些没有哮喘史,喘息,使用哮喘药物或其他肺部疾病,无毛或微观肺部病理学尸检。
珀斯的情况下
左边或右边肺部得到来自个人的验尸解剖,死因是不是哮喘或如果死亡发生突然没有胸部创伤或疾病(哮喘)。病史回顾性获得从家庭成员,通常医师和医院文件。例随后归类为:英足总,如果周围的死亡事件是一致的致命攻击的哮喘和没有其他重大贡献导致死亡;非致死性哮喘(NFA),如果死亡(通常是突然和意外)来自非呼吸道的原因和历史有一个明确的医生诊断哮喘;圣保罗或NAC上面定义的情况。
组织处理
样本的中心和外围地区肺被随机收集到所有的病人。组织在10%缓冲福尔马林固定,常规石蜡和嵌入式处理。部分5µm厚被削减,初步分析与苏木精和伊红染色。
免疫组织化学
抗体抗原检索和主要用于标签ECM组件(i型和iii型胶原蛋白,versican和纤连蛋白)、基质金属蛋白酶(金属蛋白酶- 1、2、9和-12)和TIMPs (TIMP-1和2)如表1所示⇓。简单地说,部分是脱蜡和水化。3%的H2O2解决方案是申请40分钟抑制内源性过氧化物酶活性,紧随其后的是隔夜孵化主要抗体。streptavidin-biotin复杂(LSAB;DAKO斯特鲁普、丹麦)使用后二次抗体。所有部分都沾在一个会话使用来自一批抗体染色。消极的控制,主要抗体是在染色过程中PBS所取代。
免疫组织化学分析只有在足总杯与南汽的情况下收集在圣保罗。在优化不同的抗体,观察到染色强度在圣保罗和珀斯之间存在着显著的差异情况下,非常薄弱的染色模式在前,几乎可以肯定将固定时间越长时期在珀斯的情况下(> 1周),最初为研究收集的气道结构和维度。因此,为了保证数据的质量,只有在圣保罗的情况下执行免疫组织化学。
形态测量学
两个大(基底膜周边(Pbm) > 6毫米)和三个小(Pbm≤6毫米)航空公司削减横切面从每个案例进行分析。的形态学图像分析得到的数据利用Image-Pro®4.1 + Windows®软件(美国马里兰州银泉的媒体控制论)在一个兼容微机连接到一个数码相机和耦合光学显微镜(徕卡DMR;徕卡Microsystems GmbH是一家位于德国)。由两个观察者测量进行研究团体也不清楚。测量ASM在整个气道周长进行400×放大。ASM的面积测量只在不重叠的领域这是明确的;地区相邻的结缔组织被排除在外。阳性染色的面积为每个抗体的标记区域内ASM是由颜色阈值(图。1⇓)9- - - - - -12,21- - - - - -23。为此,不同部分与每个抗体染色(每组6到8例),以及消极的控制,被用来实现最好的一系列积极的情况下,由两名有经验的病理学家总是检查(m . Dolhnikoff和t . Mauad)。这些程序生成一个文件包含所有颜色选择数据,之后被应用于所有情况下沾有相同的抗体。特定抗体染色的部分地区被表示为一个ASM总面积的百分比。
数据分析
人口统计数据中位数(四分位范围)。数值数据均值±sd,除非另有说明。数据日志转换分析之前,必要的地方。如果达到了正常,方差分析或未配对t被用于比较的意思。如果对数转换数据的非参数分布,Mann-Whitney U-tests。的Bonferroni事后测试是用来区分差异组。ECM组件的部分地区在ASM比较大型和小型航空公司用配对t和Wilcoxon测试。使用皮尔逊相关性进行或枪兵的系数测试。的假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
主题
主题特征如表2所示⇓。足总组中,所有受试者宏观和组织学变化与FA兼容17。一般来说,建议临床严重哮喘的临床特点,经常住院,使用口服皮质类固醇或时间远离平常活动由于哮喘。一般来说,NFA受试者历史表明哮喘临床严重程度轻微,很少有症状,只是偶尔使用β-agonist治疗,低剂量或没有吸入型皮质类固醇激素,没有历史的住院或干扰正常活动由于哮喘。NAC主题没有哮喘或其他肺部疾病史,都是不吸烟者和正常肺组织学。
形态测量学
图2⇓显示肺组织学在大型航空公司从南汽和足总病例。有一个ASM层FA与南汽相比更加突出。其他哮喘组织学特性是粘液堵塞,气道炎症和粘膜下腺体的数量增加。
在大型航空公司,意味着±sdPbm在足总10.6±3.4毫米,12.6±3.1毫米NFA, 10.3±3.8毫米NAC (p = 0.23)。在小航空公司,Pbm在足总2.7±1.0毫米,2.6±0.9毫米NFA, 2.4±0.5毫米NAC (p = 0.58)。均值±sdASM区域每个字段在大型航空公司为15.4±3.7×104μm2在FA, 12.2±4.1×104μm2NFA和9.1±3.6×104μm2在南汽FA (p < 0.001与南汽;足总p = 0.085与NFA;为NFA p = 0.16与南汽)。ASM区域中的每个字段小航空公司为5.4±3.5×104μm2在FA, 2.5±1.9×104μm2NFA和2.9±2.1×104μm2在南汽FA (p = 0.03与南汽;足总p = 0.02与NFA;为NFA p = 0.99与南汽)。
胶原蛋白和弹性纤维组织化学分析
图3⇓(a和b)显示的例子,南汽和足总病例为弹性纤维染色。NFA和FA病人,没有总胶原蛋白和弹性纤维的差异之间的大型和小型航空公司。在南京,部分区域内的弹性纤维ASM的小航空公司高于在大的航空公司(p = 0.035;表3⇓)。
弹性纤维的部分区域ASM在大型航空公司增加FA与NFA (p = 0.002)和南汽相比(p = 0.007)。NFA和南京之间没有明显差异。小航空公司,部分区域的弹性纤维在FA与NFA相比显著增加(p = 0.019),但与南汽相比。没有差异的部分区域弹性纤维在ASM的小型航空公司NFA和南京之间。组之间没有明显差异的百分比在ASM总胶原蛋白(表3所示⇑)。
免疫组织化学分析
免疫组织化学分析的结果列于表3⇑和图4⇓。在ECM组件、FA和南汽的病人,versican的部分地区,胶原蛋白和胶原蛋白三世更高的小航空公司比大的航空公司(FA, p = 0.005, p = 0.0001, p = 0.001,分别;南汽,p = 0.033, p = 0.018, p = 0.011,分别;表3⇑)。
部分地区有显著增加纤连蛋白的大型航空公司在足总情况下与南汽相比(p = 0.04;图3 d-f⇑)。纤连蛋白表达积极与年龄相关(r = 0.48, p = 0.03)在大型航空公司的案例。versican患者组之间没有差异,第三我胶原蛋白或胶原蛋白部分地区大型或小型航空公司。
基质金属蛋白酶,FA病人提出更高的分数MMP-12领域在大型航空公司比小航空公司(p = 0.001)。在南汽的病人中,ASM MMP-9部分地区在小航空公司和TIMP-2高于大型航空公司(分别p = 0.043, p = 0.025;表4⇑)。
ASM的面积分数MMP-9(图4 a - c⇓)和MMP-12(图4 d-f⇓)增加在大型航空公司,但不是小航空公司,在足总与南汽的情况下。之间存在着正相关弹性纤维和MMP-12在大型航空公司在足总情况下(r = 0.71, p = 0.003)。MMP-9 (r = 0.51, p = 0.01)和MMP-12 (r = 0.52, p = 0.02)表达式在大型航空公司的情况下,积极与哮喘的发病年龄相关。没有统计上显著差异的情况下组织金属蛋白酶- 1,MMP-2, TIMP-1或TIMP-2。
吸烟者与不吸烟者
有11个足总受试者吸烟者或抽过烟。吸烟者有一个更大的部分面积比不吸烟者MMP-9在大型和小型航空公司(大航空公司8.6±10.6与2.8±4.4%,p = 0.024;小航空公司6.5±6.0与1.2±1.0%,p = 0.001;分析与圣保罗的病人,n = 8)。没有明显的弹性纤维和胶原面积分数差异吸烟者和非吸烟者的NFA的病例。
皮质类固醇的使用
13个足总受试者接受了类固醇经常有小面积分数的弹性纤维相比,大型和小型航空公司与那些没有收到任何皮质类固醇(大航空公司8.8±13.7与28.8±9.5%,p = 0.003;小航空公司10.0±12.8与20.4±9.5%,p = 0.01)。没有其他参数的差异分析。
讨论
在目前的研究中,不同的ECM组件的ASM内容,分析了基质金属蛋白酶和TIMPs没有哮喘患者的肺组织。增加弹性纤维的面积分数FA与NFA和南汽相比。此外,纤连蛋白的表达增加,MMP-9和MMP-12 FA与南汽的大型航空公司。当前作者的知识,这是第一在活的有机体内人体组织的研究,全面分析几个ECM组件及其监管机构,都在大、小气道级别ASM的哮喘。
弹性纤维中的一个重要组成部分ECM的肺实质和航空公司。他们有一个重要的作用在调节气道开放和肺弹性反冲。以往的经验显示,在英足总,弹性纤维受损的大型航空公司和弹性纤维含量却降低了牙龈和牙槽依恋水平9,10。在ASM和弹性纤维丰富,虽然他们的生理作用还不清楚,它们可能与必要的气道改变口径和长度在正常潮汐呼吸,深呼吸和咳嗽。弹性纤维有助于促进bronchodilation和反对支气管收缩在灵感24,25。
目前的研究显示增加的面积分数中的弹性纤维ASM在患者FA大型和小型航空公司,但不是在NFA,相比之下,南汽情况。这与之前的结果减少了弹性纤维的面积分数下气道上皮基底膜和外围的9,10。不同比例的弹性纤维的可能的原因可能与潜在的局部平滑肌的分泌功能,促进弹性蛋白形成,和elastolytic炎症的影响,突出在FA固有层和外膜层17。
有稀缺的信息激素的作用在弹性蛋白含量阻塞性肺部疾病。目前的数据表明,哮喘严重程度可能与增加弹性纤维的部分地区在ASM,这种变化可能会改变治疗。
蛋白聚糖组成一个家庭的蛋白质肺癌生物学的主要角色26。这些蛋白质之一,大型蛋白聚糖versican,有能力调节组织水含量,从而影响弹性27。先前的研究已经证明增加versican内壁的小型和大型航空公司在哮喘的情况下,但在ASM级别未发现差异12,21,27。扎et al。21最近比较了部分区域内的versican ASM在小中度和重度哮喘病例和人口控制情况下,还发现哮喘和nonasthmatic受试者之间没有显著差异。有可能增加versican内壁与积累的水肿液。
总的来说,这些发现表明,ECM的变化,在类似炎症的时尚变化,不同的哮喘气道隔间之间的不同28,试图了解哮喘的气道结构和功能之间的关系并不简单。功能的改变航空公司最终将取决于每个气道中的每个蛋白质间的相对贡献,和蛋白质之间的相互作用与周围的薄壁组织。这将是非常有趣的夫妻所有这些数据在本研究患者功能数据,但肺功能数据在绝大多数不幸的是不可用的。进一步的研究将哮喘气道结构和功能显然是需要的。
纤连蛋白ASM也丰富,曾被证明是增加在哮喘气道壁29日。当前作者发现它的面积分数的增加在大型航空公司的。尽管目前的研究第一次表明,有增加纤连蛋白在ASM在活的有机体内,有一个大的身体在体外证据表明,纤连蛋白强烈影响ASM生物学哮喘。纤连蛋白可能增强ASM扩散30.、迁移31日和细胞生存32。陈et al。33证明了ASM哮喘病患者的细胞分泌更多的纤连蛋白在体外,这自分泌分泌有助于水平的提高白介素(IL) 13-dependent eotaxin表达式。
i型和iii型胶原蛋白是主要的纤维胶原蛋白在肌肉组织中,而network-forming iv型胶原蛋白是主要的基底膜胶原蛋白34。在体外研究表明,ASM的哮喘病患者分泌更多胶原蛋白7。在活的有机体内一些先前的研究发现,增加胶原蛋白在哮喘支气管黏膜下水平29日,35,36,而其他人没有37。在目前的研究中,没有增加胶原蛋白中的内容ASM在足总被天狼星红染色和免疫组织化学。增加纤维胶原蛋白肯定会采取行动限制力ASM细胞之间的转移,从而减少支气管狭窄,一个假设不支持的数据。
的微分表达基质金属蛋白酶与哮喘发病机制有关。除了他们的角色在降解ECM组件,基质金属蛋白酶也参与炎症细胞贩运,宿主防御和组织修复38。在当前的研究中,增加MMP-9和-12年被发现,但在金属蛋白酶- 1或2,或在ASM TIMP-1或2束FA的情况下。目前的数据支持使下降的环境在ASM,尤其是基质金属蛋白酶elastolytic活动。
有强有力的证据MMP-9参与哮喘,尤其是严重哮喘患者39在急性严重恶化40。MMP-9表达肺部炎性细胞和结构,包括ASM细胞。有趣的是,目前的研究还表明,吸烟会增加部分区域的MMP-9 ASM相比,不吸烟的科目。MMP-12劈开弹性蛋白和iv型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和明胶41。它最近被证明ASM细胞表达MMP-12,由IL-1β高度诱导41。当前数据显示增加的ASM细胞表达MMP-12受试者死于哮喘。此外,在足协的情况下,有一个弹性纤维和MMP-12之间的正相关关系,符合动态营业额的弹性纤维发生哮喘。在成人组织,功能修复弹性纤维是困难的,因为它需要协调的表达所有的分子组成的微纤维以及酶交联弹性蛋白的关键42。可以推测,虽然分数表达式中的弹性纤维增加ASM在足协的情况下,弹性纤维结构异常,顺向功能受损。这个事实可能导致改变机制ASM收缩和放松的哮喘。
本研究有一些重要的局限性,如有限的临床和功能数据用于哮喘的主题。此外,尽管有正常的肺组织学,控制并不缺乏其他疾病。虽然它不是珀斯病例免疫组织化学染色,在足总提供信息,NFA, NAC“总”胶原蛋白和弹性纤维是非常重要的,因为这两个主要的肺蛋白可能ASM力学的主要角色。此外,组织化学的数据证实了“总”胶原蛋白免疫组织化学数据在圣保罗的子集的病人。
某些蛋白质之间有显著相关性,年龄和哮喘发作,尽管这些发现的相关性尚不清楚,白et al。13以前显示年龄之间的关系和ECM内平滑肌层的面积分数在哮喘。当前数据是基于组织和免疫组织化学技术。这将是有用的在RNA水平证实这项发现。不幸的是,试图从microdissected ASM的尸检材料中提取RNA没有成功,由于广泛的事后剖析RNA降解。
尽管部分地区的一些研究蛋白质高的小型航空公司,大多数足总之间的变化和南汽在大型航空公司中被发现。最近,布朗et al。43和Permutt44有强调的作用气道结构在大型气道水平在哮喘气道高反应的主要决定因素。可能观察到ECM的变化在ASM贡献更重要的内在在哮喘气道改变大型航空公司比小的航空公司。
总之,弹性纤维,纤连蛋白中增加致命的哮喘的气道平滑肌,增加矩阵metalloproteinase-9和-12的表情。目前的在活的有机体内数据证实,细胞外基质的变化及其监管机构发生在哮喘气道平滑肌,但不一定反映气道壁内的其他地方。然而,他们可能对气管平滑肌功能有重要影响和过度在哮喘气道狭窄。
支持声明
本研究获得的支持Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(巴西,巴西利亚),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(巴西)和澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(澳大利亚堪培拉),授权ID 343601。
感兴趣的语句
没有宣布。
确认
作者要感谢Servico de Verificacao de Obitos da资本(SVOC),圣保罗大学(巴西圣保罗),允许收集致命的哮喘病例。他们也感谢所有肺部病理学小组的成员部门的病理,圣保罗大学医学院组织组织收集。
- 收到了2007年11月6日。
- 接受2008年2月26日。
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