文摘gydF4y2Ba
背景:Osteodex是小说bi-functional大分子polybisphosphonate开发治疗前列腺癌和乳腺癌的骨转移。高功效的osteodex已经证明在体外和体内。本研究调查osteodex是否还有效的软组织肿瘤病变。材料与方法:十二个女性裸体小鼠注射orthotopically mda - mb - 231细胞。Osteodex在2.5毫克/公斤输液管理,每周5周。肿瘤体积测量在治疗期间,动物被牺牲,样本收集进行蛋白质组学分析。结果:摘要老鼠的病情演化成多发性肿瘤溃疡与明显大于4厘米,而治疗组肿瘤直径小于1厘米,没有溃疡。虽然治疗小鼠的一般状况很好,摘要动物在贫穷的状态。16 300确定蛋白质差异表达,与统计学意义表达的变化超过双重治疗和摘要组之间的差异。这些蛋白质被确定使用基于non-gel nano-liquid色谱加上Synapt G2的乐器。 Conclusion: We conclude that osteodex showed significant treatment efficacy on soft tissue tumor implants. The study provides a global view of changes in protein expression profiles following osteodex treatment. Some functions of the identified proteins might be used to explain the specific treatment efficacy of osteodex.
前列腺癌和乳腺癌最常见的骨骼发展转移。在一个先进的转移阶段,超过70%的患者出现骨转移。斯蒂芬·佩吉特氏种子和土壤假说,说明循环肿瘤细胞增长只能生长微环境是宽松的,仍然是合适的。连续re-modeling骨破骨细胞和成骨细胞,产生释放多种细胞因子,趋化因子和生长因子有利于肿瘤细胞生长(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。这个,在存在本地丰富的血管和周围高渗透骨髓可以解释的倾向在先进的前列腺癌和乳腺癌骨转移。即使骨头是最常见的网站转移,软组织转移通常发生在晚期前列腺癌和乳腺癌。最常见的网站是淋巴节点、肝脏和肺(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。淋巴结与原发肿瘤通常是第一个网站的肿瘤扩散。在前列腺癌,脊柱转移往往先于肝脏和肺转移。大约一半的女性与转移性乳腺癌肝转移发展。一般来说,检测阳性淋巴结显示预后不良,也可能是积极的肿瘤表型的一项指标。先进的前列腺癌和乳腺癌化疗的治疗组合,辐射,荷尔蒙和生物疗法(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Osteodex bi-functional聚gydF4y2Ba国际清算银行gydF4y2Ba膦酸酯最近开发出治疗骨转移。Osteodex由碳水化合物聚合物二磷酸盐和胍半个聚合物骨干有关。以前的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究表明重大bi-functional功效gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba抑制骨吸收和抗肿瘤功效(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。它的作用方式取决于三个主要影响:抑制甲羟戊酸途径,诱导细胞凋亡,细胞毒性。临床阶段我研究osteodex最近完成了castration-resistant前列腺癌患者(CRPC)和第二阶段研究计划为2014。Osteodex高分子有一定的静电电荷特性和,因此,它似乎是合理的,它也可以积聚在乳腺肿瘤病灶依赖增强渗透性和保留效果(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
本研究调查了osteodex是否可能对软组织损伤疗效。蛋白质组学分析的主要方法用于调查osteodex治疗后对蛋白质组的影响。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
Osteodex合成gydF4y2Ba。Osteodex准备如前所述(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。短暂,右旋糖酐40 PhEUR (Pharmacosmos, Holbaek、丹麦)和钠氧化meta-periodate(默克公司,达姆施塔特,德国)和氨基胍alendronate (Sigma-Aldrich,斯德哥尔摩,瑞典)随后共轭。硼氢化钠(Chemicon,斯德哥尔摩,瑞典)是用于还原胺化作用。PD-10一次性交联葡聚糖G-25列被用于分离和净化(g e,生物技术AB、梅迪奇纳、瑞典)。结合收益率是由元素分析(总氮、总磷;Mikrokemi AB,乌普萨拉,瑞典)。gydF4y2Ba
动物。gydF4y2Ba十二个女性裸体小鼠(年龄6 - 8周/重约g)年龄在18岁至25岁之间的被注射大约1 - 1.5 mda - mb - 231细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)在乳腺皮下注射垫。肿瘤发达post-injection 10 - 14天内9的12老鼠和允许肿瘤生长与osteodex在开始治疗前不到1厘米。九个肿瘤小鼠分为治疗(n = 5)和不做(n = 4)组。gydF4y2Ba
此后的五个肿瘤小鼠osteodex单剂量的治疗,静脉注射gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba尾静脉剂量为2.5毫克/公斤,每周5周。连续测量肿瘤生长期间实验拍摄到动物牺牲。测量各组的困难是由于广泛的肿瘤的生长与巨大的溃疡。gydF4y2Ba
治疗期后,动物被牺牲和总解剖。从两组切除肿瘤组织蛋白质组学分析。所有程序进行了严格按照批准的协议使用动物研究。老鼠和照顾机构处理动物保健和使用委员会(IACUC)政策和指导方针的研究事务办公室(RAC # 2080 - 052年),和动物设施在KFSHRC协议。动物被关在动物设施比较医学部门和所有程序都是根据标准的指导方针执行。gydF4y2Ba
尸体解剖。gydF4y2Ba总值腹腔开放所有的动物和尸体解剖。总值的表象和摘要动物记录包括可见治疗腹外肿瘤。腹膜是检查,寻找证据腹膜腔的渗透和扩散。为蛋白质组学分析为代表组织样本收集。样品制备和蛋白质组学分析。样本验尸后立即准备。肿瘤细胞被non-enzymatic提取方法如前所述(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。短暂,新鲜肿瘤样本1 - 2毫升冰冷的rpmi - 1640年机械均质介质补充5%小牛血清和蛋白酶抑制剂(0.2毫米phenylmethylsulfonyl氟苯甲脒(PMSF) / 0.83毫米)。组织碎片和结缔组织被使用500μm筛网过滤器和肿瘤细胞percoll离心后收获。收集细胞悬浮液洗两次在磷酸缓冲盐含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒,然后离心800×gydF4y2BaggydF4y2Ba和4°C 3分钟。最后,所有的样品都离心机在2700×5分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba(4°C)。球被储存在-80°C进行进一步分析。gydF4y2Ba
蛋白质在溶液中消化和液相色谱-光谱法分析。gydF4y2Ba整个细胞溶解产物的蛋白质浓度由布拉德福德测定方法。蛋白质浓度的所有样本归一化和为每个样本,100μg复杂的蛋白质混合物被和交换两次500μl 0.1% RapiGest(水域,曼彻斯特,英国)1000年(1瓶稀释μl 50 mM AmBic)与3-kDa超滤设备(微孔,贝德福德,妈,美国)。蛋白质的浓度在0.1和1之间μg /μl年底实现消化。蛋白质变性的0.1% RapiGest科幻小说在80°C,持续15分钟,减少10毫米二硫苏糖醇为30分钟60°C,驾驭下来,允许冷却至室温和烷基化10毫米碘乙酰胺在黑暗中在室温下了40分钟。样本trypsin-digested 1:50 (w / w;1μg /μl胰蛋白酶浓度)酶:蛋白质比例和胰蛋白酶,至少4小时或隔夜在37°C和温和的颤抖。消化是结束,RapiGest淬火与4μl 12 M盐酸37°C 15分钟和离心机17900 RCF 10分钟。样本稀释5 pmol /μl或5 - 10倍水0.1%甲酸之前LC / MS分析。所有样本被掺入了酵母乙醇脱氢酶(ADH;P00330)作为内部标准消化给200 fmol每针的绝对定量。gydF4y2Ba
蛋白质质量鉴定spectrometry-LC /女士gydF4y2BaEgydF4y2Ba。gydF4y2Ba定性和定量表达式使用维纳米Acquity液相色谱分析进行耦合与串联质谱Synapt G2仪表(水科学、伯克希尔哈撒韦公司、英国)。电喷雾电离质谱分析的仪器设置进行了优化调整页面如下:探测器设置使用2 ng /μl亮氨酸脑啡肽(556.277 Da),质量(gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba校准是实现在一个单独的注入500 fmol (Glu) 1-fibrinopeptide B (GluFib 785.843 Da),使用Lynx IntelliStart质量。其他参数包括毛细管电压3 kV,样本锥50 V,提取锥5 V, 80°C源温度,气体锥10 l / h,纳米流气体0.5酒吧和净化气体800 l / h。所有分析都进行Trizaic纳米源(水)电离nanoESI正离子模式。gydF4y2Ba
总共2μg蛋白质消化加载在列和样本处理使用Acquity样本管理器与流动相组成的A1(水+ 0.1%甲酸)和B1(乙腈+ 0.1%甲酸)示例0.500μl /分钟的流量。Data-independent收购(女士gydF4y2BaEgydF4y2Ba)/铁流动分离实验研究和数据在一系列的收购gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba50 - 2000 Da 1 s的扫描时间,增加碰撞能量转移20 - 50 V,总收购时间120分钟。所有样本一式三份运行分析和数据是使用Lynx项目质量(版本。4.1,SCN833;水)在分辨率和正极性模式。获得数据女士background-subtracted,平滑和de-isotoped中阈值。蛋白质猞猁全球服务器(身为)2.2(水)是用于所有自动化数据处理和数据库搜索。生成的肽质量与使用身为Uniprot蛋白质序列数据库搜索2.2蛋白质识别(水域)。gydF4y2Ba
数据分析和信息。gydF4y2BaTransOmics信息学(水)是用于处理和搜索数据。人类的数据库包含46906年回顾条目从Uniprot下载。诱饵数据库是由之前扭转这种和连接到原始数据库搜索。搜索算法的原理是被李gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。以下标准被用于搜索:一个错过的乳沟,最大的蛋白质质量1000 kDa,胰蛋白酶,carbamidomethyl C固定和氧化M变量的修改。gydF4y2Ba
规范化label-free量化使用独家TransOmics软件,实现了与非线性动力学(英国纽卡斯尔),和用于绘制主成分分析(PCA)对数据分析分成两组。被过滤的数据只显示统计(方差分析)显著改变蛋白(gydF4y2Bap≤gydF4y2Ba0.05)≥3肽识别和褶皱变化超过2。gydF4y2Ba
另外的Hi3绝对量化进行了使用抗利尿激素作为内部标准给每个确定蛋白质的绝对数量(水域)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
之前牺牲动物的解剖,指出对待动物和正常状态而摘要良好表现不佳的动物是由于广泛的疾病进展。连续测量的肿瘤生长/体积显示治疗和摘要动物之间统计上的显著差异(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。Osteodex-treated动物小病变破坏而摘要动物出现大的渗透和溃疡病变(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
尸体解剖。gydF4y2Ba摘要动物发达腹腔中的多个转移性肿瘤远处转移到肾脏和肝脏溃疡和血管浸润。对待动物有一些孤独的小损伤肾脏,但没有进一步渗入腹膜腔和肝转移(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba组织学的光学显微镜幻灯片显示代表正常肾脏肾小球对待动物与肿瘤细胞的组织学形态渗入整个摘要动物的肾脏。gydF4y2Ba
了解这背后的生理变化巨大的差异在肿瘤的生长,肿瘤样本从五个治疗和四个摘要老鼠受到蛋白质组的比较。gydF4y2Ba
蛋白质组学分析和蛋白表达的变化。gydF4y2Ba一个label-free MS-based方法作为比较的工具使用蛋白表达分析。总共19420独特的肽的特性被发现,过滤面积50 - 2000外gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba和背景噪音,减少到11045人。筛查特性差别显著治疗和摘要(gydF4y2Bap
大部分蛋白质治疗组差异,而各组只有很少一部分的差异。观察这些发现是类似与PCA情节产生的二维数据集(数据没有显示)。gydF4y2Ba
差异表达的蛋白质。gydF4y2Ba大约300个蛋白质治疗和肿瘤组织的摘要老鼠。16这些蛋白质的差异表达显著的表达变化之间的至少两个样本组(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba)。16个差异表达蛋白质的一个数据集处理样品组之间明显歧视样品分成两个不同的组无监督层次聚类分析和主成分分析(gydF4y2Ba图3 a和BgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
确定蛋白质的功能解释。gydF4y2Ba进一步确定蛋白质的特征探索利用聪明才智通路分析(智慧系统,Inc .)、红木、钙、美国)。确定的16个蛋白在三sub-signaling网络映射和代表。十蛋白质网络中涉及的体液免疫反应,炎症反应和细胞运动,而三分子参与的分子网络运输、血液系统的开发和功能,血液疾病。只有一个分子(VI型protein-arginine deiminase,肽基精氨酸deiminase家族中的一员)有牵连的网络细胞周期,细胞死亡和生存、内分泌系统疾病(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
摘要功能特征的识别蛋白质中列出gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba,来自独创性的数据库程序。大多数的这些分子位于细胞质中,只有少数位于细胞外空间。虽然许多人作为酶,其他作为细胞的转运蛋白。十蛋白上调,而只有四个蛋白质之间被抑制和摘要团体治疗。此外,四个蛋白(血红蛋白,β成人小链(Hbb-b2),血红蛋白,泽塔(HBZ)、腺苷三磷酸酶、CagydF4y2Ba+ +gydF4y2Ba运输、心肌、快速抽动1 (ATP2A1)和补充组件3 (C3)没有直接映射在一个网络,但在细胞死亡和生存functionally-implicated在腺泡的腺体细胞凋亡以及细胞凋亡的肝细胞系。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
本研究调查的功效osteodex植入治疗肿瘤在小鼠和对肿瘤细胞的影响蛋白质组研究。gydF4y2Ba
以前的经验从一个广泛的化疗药物和其他抗癌药物表明许多导致恶性细胞的诱导细胞凋亡。结合序列的事件发生在肿瘤细胞凋亡,包括DNA和蛋白质降解。最近,上野gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba表明,乳腺癌肿瘤细胞的凋亡检测血清中可以创建产品(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。因为法律调节病人的完整性,伦理问题gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。(生物银行法律法规),很难获得前和治疗后顺序活检样本。因此,知识和特点在治疗实体肿瘤的凋亡变化人类是有限的。gydF4y2Ba
大多数恶性肿瘤的临床诊断可以与准确性,然而预测治疗反应更加困难,是有限的。因此,需要有一个相当大的敏感和特定的生物标志物的发现和开发治疗疾病预后和预测反应。gydF4y2Ba
蛋白质生物标记物通常定义为特定的蛋白质,可以定量测量和评估作为正常状态的客观指标,治疗反应的病理状态,作为一个指标。gydF4y2Ba
最近在蛋白质组学分析技术进步产生进一步的兴趣转化研究的可能性。表达蛋白质组学,通常定义为大规模差异蛋白质分析分析,导致识别疾病或组织蛋白可以作为疾病的生物标记物(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
经典表达式的蛋白质组学策略,包括高分辨率二维蛋白质分离(2 de)耦合LC-MS-MS高度敏感的蛋白质识别,可以识别小说蛋白质标记。大量的微分表达式的数据可以通过人工学习方法,分析了产生疾病的诊断或监测治疗反应。gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们使用层次聚类分析的定性和定量在溶液中蛋白质表达的变化,以监测和解释变化由于osteodex治疗乳腺肿瘤。使用蛋白质表达变化耦合串联质谱鉴定,16个差异表达蛋白质与osteodex治疗被发现。这些蛋白的表达明显歧视对待与摘要之间组(gydF4y2Ba图3 A和BgydF4y2Ba)。大部分的蛋白质治疗组明显上调与各组相比,表明改变蛋白表达与osteodex相关治疗。蛋白质的功能特性建立了利用聪明才智途径分析。十五16识别蛋白质的不同信号网络,包括体液免疫反应,炎症反应,细胞运动,分子运输、血液系统的开发和功能,血液疾病。16个蛋白之一,没有治疗组和各组中表达,是一种酶,键入6 protein-arginine deiminase(垫),肽基精氨酸deiminase家族中的一员,与网络相关联影响细胞周期,细胞死亡和生存。垫属于一组酶参与翻译后蛋白质de-aminations。他们作为催化剂在精氨酸残基的转换成瓜氨酸的钙离子。PAD1、2、3和4中描述到目前为止人类基因及其表达跨越各种组织和被认为在人类的发展中发挥作用神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和多发性硬化症。PAD6特征明显没有在人类肿瘤(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。高表达的观察各组在治疗肿瘤是有趣,可能表明潜在的标记osteodex监测治疗反应。gydF4y2Ba
微管蛋白β6类V,胞质蛋白,显著抑制在样本osteodex-treated老鼠。微管蛋白属于总科的细胞质蛋白质。六名成员特征,α-、β-、γ、δ-ϵ——ζ-tubulin。α-Tubulin和β-tubulin相关的细胞动态/稳定微管和微管蛋白家族成员很普遍。许多抗癌药物β-tubulin绑定活动,导致微管re-arrangements,最终细胞循环阻塞。不同微管蛋白的表达模式抗癌治疗后一直研究阐明其可能的效用作为治疗结果的标记。一般来说,全球的表达不同β-tubulin同形像展示多样和复杂的模式在不同肿瘤类型(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
结直肠癌最近的一项研究展示了一种可怜的生存和微管蛋白的表达之间的联系,β3 (TUBB3) / TUBB6和雄激素受体(AR),特别是女性。在两种性别,AR与TUBB3 / TUBB6表达式(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
半合成的紫杉烷衍生物cabazitaxel通过破坏细胞功能所必需的微管网络,特别是在有丝分裂和细胞分裂的间期。这种化合物是最近由食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗CRPC。用这个角度对影响微管蛋白的重要性,本研究的观察是有趣的和重要的。微管蛋白标记一次验证可能成为有用的监测CRPC患者对治疗的反应。gydF4y2Ba
三种蛋白质样本中最明显的差异摘要和osteodex-treated老鼠纤维蛋白原γ和β链,肌凝蛋白多肽6和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。最高的意思是光的表情肌凝蛋白多肽6中观察到的样本处理老鼠,而其他三个蛋白质显著摘要肿瘤样本中高度表达。特别感兴趣的大于3倍逆表达式的GAPDH观察治疗组。这38-kDa蛋白是一种重要的催化酶在细胞ATP生产所必需的。最近表明,GAPDH是监管目标端粒酶体系结构,导致端粒维持的逮捕,诱导癌症细胞衰老和癌症细胞增殖增加(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。因此,目前的结果表明,治疗osteodex抑制GAPDH表达式,从而导致抑制肿瘤的生长。gydF4y2Ba
细胞骨架蛋白质是积极参与调节细胞结构和细胞保持结构完整性的能力是一项基本的细胞反应,伤害或治疗药物。最近的一项研究表明,肌球蛋白轻链激酶显著提高乳腺癌细胞介导的高度增殖能力通过抗凋亡与p38通路(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。增强的样本组的细胞增殖,具有肌凝蛋白的差异表达光多肽6和标记表达减少样本osteodex-treated动物是另一个有趣的观察表明osteodex的功效。gydF4y2Ba
总之,目前的研究表明,osteodex,虽然特异性,对软组织病变施加相当大的功效。几个差异表达的蛋白质模式表明广泛而显著的作用方式。其中一些可能有潜力作为标记的治疗反应。gydF4y2Ba
本研究进一步表明蛋白质组学分析的多功能性及其不断发展的技术进步。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
作者希望承认研究中心政府的支持国王费萨尔专家医院和研究中心。我们感谢支持和后勤援助从物流和设施管理办公室。这项工作是由国王费萨尔专业医院和研究中心(RAC项目# 2080 052)。我们值得庆幸的是承认阿卜杜拉先生Al-Dhfyan技术援助。这项研究得到了癌症协会在斯德哥尔摩,国王古斯塔夫V禧基金,斯德哥尔摩,瑞典癌症协会和Svante Wadman先生,斯德哥尔摩。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
信息披露和利益冲突gydF4y2Ba
一个也没有。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2014年1月17日。gydF4y2Ba
- 修订了gydF4y2Ba2014年1月30日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2014年1月31日。gydF4y2Ba
- 版权©2014国际抗癌研究所(John g . Delinassios博士),保留所有权利gydF4y2Ba