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文摘
背景成千上万的电子香烟(烟)补充液体继续制定和分布式,越来越需要了解调味的细胞毒性化学物质和溶剂中使用这些产品,以确保它们是安全的。本研究的目的是比较烟加注液体/溶剂内的细胞毒性及其对应的气溶胶使用体外培养细胞。
方法烟补充液体和diy产品筛选液体和气溶胶的形式使用MTT细胞毒性(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl)−2, 5-diphenyltetrazolium溴)测定。人肺成纤维细胞的敏感性、肺上皮细胞(A549)和人类胚胎干细胞液体和气溶胶相比。气溶胶是利用约翰逊溪的离析cartomizer风格包括烟。
结果效力的层次结构建立了aerosolised产品。我们的数据表明,(1)由于电子烟气溶胶可以在培养细胞产生细胞毒性效应,(2)发现了细胞毒性的四种模式相比补充液体和相应的气溶胶,(3)液体准确预测气溶胶细胞毒性74%的时间,(4)干细胞通常是更敏感比分化细胞和气溶胶(5)91%的气溶胶由补充液体只包含甘油是细胞毒性,即使在低电压产生。
结论我们的数据表明,各种口味/品牌缴获补充液体和气溶胶是细胞毒性和演示由于电子烟产品的需要进一步评估,以便更好地理解其潜在的健康影响。
- 电子香烟
- 口味
- 细胞毒性
- 蔬菜甘油
- 补充液体
- 气溶胶
来自Altmetric.com的统计
介绍
各种各样的电子香烟(烟)补充液体迅速增加,1和电子烟已经成为广受青少年以及成年人以前没有使用烟草制品。2这种快速上升的烟流行发生信息安全与健康风险。最近的一次风险评估得出的结论是,需要额外的工作来更好地理解电子烟造成的公共卫生影响。3
Cig-alike模型缴获和肾上腺素cartomizers含有溶剂,如丙二醇、甘油(也称为蔬菜甘油或丙三醇)、口味和尼古丁(通常从0到36毫克/毫升)。4个5用户也买瓶补充液体,可以手动烟cartomizers内滴入。一些补充产品,称为DIY (DIY),是作为集中出售,可以由用户稀释。补充液体可用在许多味道,通常可定制的尼古丁浓度和溶剂,往往比已经预装好的cartomizers更划算。
鉴于其人气上升,关键是了解电子烟带来的正面和负面健康影响。25岁以上病例报告属性不良健康影响电子烟。6其中包括系统性影响包括呼吸、心脏和消化系统,无意和有意中毒,由于爆炸和伤害。一些体外研究发现,电子烟导致激活的细胞应激通路包括炎症、氧化应激、细胞凋亡和DNA损伤。7 - 12此外,许多负面的和一些阳性症状归因于烟暴露了用户自我报告在互联网论坛网站。13日14美国食品和药物“(FDA)记录了小烟严重不良事件报告给他们的用户。15日16上述不良反应可能是由于尼古丁戒断症状或过量,6日13金属在烟气溶胶粒子和纳米粒子,17日至19日活性氧物种,或口味如双乙酰和肉桂醛。20 21一些研究发现羰基化合物,如丙烯醛和甲醛、烟气溶胶。22 - 24这些高活性和热解产生的有毒化合物的溶剂(如丙二醇或甘油)。22日25日26日
我们实验室最近表明,细胞毒性33烟补充液体和三个DIY产品当测试与成人和胚胎细胞之间存在着显著的差异。27一些产品的细胞毒性与使用的化学品的数量和浓度味补充液体。Cinnamon-flavoured产品特别是细胞毒性,肉桂醛被确认为最有效的添加剂在这些液体。21我们还报道,肉桂醛广泛用于补充体液,包括流行的水果和甜的味道,它在细胞产生不利影响剂量不引起细胞死亡。28
本研究的目的是在出版前处理后续补充体液的细胞毒性。27具体来说,我们比较这些补充体液的细胞毒性及其对应的气溶胶使用三种不同的细胞类型的细胞毒性以及评估气溶胶由真实的丙二醇,甘油,两种最常用的补充液溶剂。
方法
由于电子烟产品的来源
36个烟补充液体测试在前一个屏幕27除了# 3 Marcado(约翰逊Creek),取而代之的是一个重复的瓶子(# 73 Marcado,约翰逊Creek)。美国自由烟测试产品的制造(美国亚利桑那州图森),全球吸烟(美国加州洛杉矶),约翰逊溪(约翰逊溪,威斯康辛州)和红橡木(约翰逊Creek)的子公司。三十五原始36瓶补充液体和缴获的DIY产品包含各种口味和尼古丁浓度进行评估(表1)。选择的产品是给一系列的制造商、溶剂、尼古丁浓度和口味。所有的瓶子都有库存数量和储存在4°C 1年后再筛分。制造商贴上他们的产品“蔬菜甘油”和/或“甘油”,化学是相同的。我们将两届“甘油”在讨论他们的文本,但使用制造商的条款(甘油和蔬菜甘油)表1显示每个产品的实际标签。
由于电子烟气溶胶集合
烟气溶胶产生使用吸烟机前面描述的。28河豚的盒子是与科尔parm MasterFlex聚乙烯管(美国伊利诺斯州的弗农山)MasterFlex蠕动泵(美国伊利诺斯州Barnart公司巴林顿;模型# 7520 - 00)。吸烟机和泵之间的界线包含T连接器(费舍尔科学)举行了烟。蠕动泵是热身前至少15分钟收集气溶胶在圆底烧瓶培养基淹没成冰浴。
每一批的气溶胶与新的未使用的cartomizer准备。空cartomizers从约翰逊溪用于购买他们缴获2.85 V离析模型。为了避免干燥膨化,1毫升的补充液是用移液器吸取到每个cartomizer推荐的供应商,和膨化前后重量被监控流体消费。蠕动泵的速度降低到零,直到之前每一个粉扑的时间泵速度提高到所需的级别。吸烟机校准画一阵卷30毫升4.3秒的时间,这是由于电子烟的平均膨胀时间用户29日10个泡芙的频率/小时。对于每一批气溶胶,24个泡芙收集成4毫升的培养基。
细胞培养
人类肺成纤维细胞(hPFs分区)被选为他们使用在我们先前的研究,他们的第一个细胞暴露于吸入气溶胶和它们参与开发的肺部疾病,如慢性阻塞性肺疾病。30 -hPFs分区(美国加州卡尔斯巴德,ScienCell)培养使用制造商的协议完成纤维母细胞中含2%胎牛血清,1%血清纤维母细胞生长和1%青霉素和链霉素。hPFs分区被分散成单个细胞和镀在4000细胞/在96孔板使用BioMate 3 s分光光度计(热费希尔科学、斜纹棉布裤,加利福尼亚,美国)建立标准曲线。
A549肺上皮细胞(ccl写明ATCC - 185细胞,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)通常用于毒理学和吸入测试。A549细胞培养使用经销商的协议中写明ATCC F-12K介质和10%胎牛血清使用组织培养瓶。镀A549细胞的单个细胞的密度50 000细胞/ 96 -孔板在使用BioMate 3 s Spectrophotometer-based标准曲线。
人类胚胎干细胞的多能为)被用作postimplantation人类胚胎早期的模型。33为(H9) (WiCell,麦迪逊,威斯康辛州,美国)在mTeSR基底膜基质培养基培养(干细胞技术,加拿大温哥华)six-well板块的详细描述。34镀建国之初2 - 10细胞实验,用标准曲线法,40 000个细胞/在96孔板测量。
每个单元格类型是镀的密度增长约80% confluency年底实验。
MTT试验
由于电子烟液和气溶胶进行了测试在96 -孔板在剂量反应实验中使用MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl)−2, 5-diphenyltetrazolium溴化)对高通滤波器分析观察细胞毒性的影响,hESC和A549细胞。稀释的气溶胶测试浓度从0.0006到6 TPE (TPE =总吹牛等价物,泡芙/毫升的培养基)的数量。比较non-aerosolised和aerosolised补充液体,TPE被转换为百分比(%)使用流体的密度和重量/气溶胶的粉扑。密度是决定通过比较流体与水的重量分析天平。然后,一股烟的重量气溶胶被减去的重量计算cartomizer使用前和之后的重量除以24(泡芙)的数量。一支烟的重量除以流体的密度和转换为百分比使用泡芙的总数/毫升的媒介。
36个补充液体和DIY由于电子烟产品的毒性筛选的一项研究。27来确定这些产品显示出类似的毒性在4°C存储后,稀释的35补充液体和DIY产品二次筛分没有aerosolisation使用MTT测定的浓度为0.001%,0.01%,0.03%,0.1%,0.3%和1.0%。稀释,所有液体都带到房间温度和混合彻底吸量。
MTT试验进行了详细描述。35 36补充液体和气溶胶与培养基稀释96 -孔板进行了测试与消极控制位于左边和右边的浓度测试。控制相邻的最高浓度检查蒸汽挥发性液体和气溶胶产生的影响。35 37蒸汽的影响时发现,较低的高浓度用于二次筛分。细胞和治疗一起镀和孵化48小时,然后检查显微镜下观察细胞的状况。MTT的解决方案是添加了2小时,MTT试验。气溶胶进行了测试在三个独立的实验中,手段和SE的意思是被用来产生剂量反应曲线的每一个细胞类型。补充液体二次筛分一个时间来观察他们的信件与原来的屏幕。27在某些情况下,一个额外的高浓度(> 1%)的补充液测试允许比较最高的补充液体气溶胶的浓度。这些额外的高浓度表示为蓝色块箭头图1和图2和补充文件S2。
补充文件1
补充液体和气溶胶non-cytotoxic。红线是补充体液之前筛选与高通滤波器。27蓝线是相同的补充液体(RF)二次筛分在这个研究来确定存储细胞毒性影响。绿色线是气溶胶产生每个补充液体和用于治疗高通滤波器。绿色线,数据的手段和SE的意思是三个独立的实验。星号表示的最低浓度和代表LOAEL明显不同。* * = * p < 0.05, p < 0.01, * * * = p < 0.001。
四种模式的细胞毒性包括烟补充液体(RF)和气溶胶。(A和Bnon-cytotoxic)射频和气溶胶。(C和D细胞毒性)射频和气溶胶。(E射频是细胞毒性但气溶胶。(F和G)细胞毒性但RF不是气溶胶。红线是射频之前筛选与人类肺成纤维细胞(高通滤波器)。27蓝线是相同的射频二次筛分在这个研究来确定存储细胞毒性影响。绿色线是气溶胶产生每个射频和用于治疗高通滤波器。绿色线,数据的手段和SE的意思是三个独立的实验。星号表示的最低浓度显著不同于未经处理的控制(观察到的不利影响最低级别)。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
大多数由于电子烟产品含有甘油产生细胞毒性气溶胶。(l)比较的11个补充液体(RF)和一个diy购买样品蔬菜甘油。红线是射频之前筛选与人类肺成纤维细胞(高通滤波器)。27蓝线是相同的射频二次筛分在这个研究来确定存储细胞毒性影响。绿色线是气溶胶产生每个射频和用于治疗高通滤波器。绿色线,数据的手段和SE的意思是三个独立的实验。星号表示的最低浓度明显不同,代表观察到的不利影响最低的水平。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
数据分析
对气溶胶剂量反应实验,抑制浓度为50% (IC50与棱镜)值计算软件(GraphPad,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)使用日志抑制剂与正常反应变量坡具有顶部和底部约束设置为100%和0%,分别。补充液体重做的屏幕,IC50值是由眼睛的剂量反应曲线。统计学意义的气溶胶决心使用方差分析在三个独立的实验使用GraphPad棱镜。意义时发现,治疗组相比,使用Dunnett事后测试的最低浓度,和手段为p < 0.05被认为是明显不同的。没有观察到的不利影响(科学)和最低水平观察不利影响(LOAEL)是由统计显著性水平。
结果
补充液的细胞毒性与高通滤波器和气溶胶样品
表1总结数据使用的产品,我们的库存数量,该公司的起源,尼古丁的数量/产品,溶剂时,味道类别,剂量反应的数据(科学,LOAEL和集成电路50反应)和细胞毒性数据(< 70%的控制)的液体及其对应的气溶胶。所有的产品被认为是补充体液除了# 24日# 32和33 #,DIY产品。这些产品在效力范围(表1),所有35气溶胶的剂量反应曲线,但有一个例外,产生浓度有毒明显多于最低浓度测试。当调味料类别,如奶油、黄油、薄荷/薄荷醇、烟草和水果效力的层次内,6的14“奶油”气溶胶(# # # 4,# 19日26日28日# 29日# 30)是最有效的在这个屏幕。
一般来说,常温补充液体产生类似的剂量反应数据中获得原来的屏幕(补充文件S1-3),显示细胞毒性的补充液体并没有改变明显当存储长时间在4°C。明显的例外是# 34 JC原始约翰逊溪(补充文件S1G由全球吸烟(40)和#焦糖补充文件S2R),这与存储失去了效力。前面的屏幕和电流二次筛分之间的差异可能是由于产品的老化或逃脱的挥发性香料化学物质在存储。
敏感的成人呼吸细胞和干细胞
补充液体气溶胶的一个子集,在最初的屏幕是大多数细胞毒性进一步测试使用hESC和A549人肺上皮细胞(图3)。为比高通滤波器和A549细胞更敏感的气溶胶的约50%和40%,分别。这个同意我们之前的数据显示,干细胞分化比成人更敏感细胞由于电子烟产品。27两个成人肺细胞反应类似于80%的气溶胶疗法。
两个成人呼吸细胞类型和一个多能细胞相比敏感性烟气溶胶。H9 hESC(红线),A549细胞(蓝线)和高通滤波器(绿线)处理10烟气溶胶(j)。数据绘制的手段和SE的意思是三个独立的实验。星号表示的最低浓度显著不同于未经处理的控制(观察到的不利影响最低级别)。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。hESC,人类胚胎干细胞;高通滤波器,人类肺纤维母细胞。
模式的细胞毒性
剂量反应数据从上面的屏幕可以分为四种模式的细胞毒性通过确定是否最高浓度不大于70%的控制(图1;补充文件S1-3)。38例如,如果样本的高浓度< 70%的控制,补充液体或气溶胶被认为是细胞毒性。模式特征如下:(1)补充液体和其气溶胶non-cytotoxic 35 (7 = 20%) (图1 a, B和补充文件S1);(2)补充液体和气溶胶是细胞毒性(19 35 = 54%)(图1 c, D和补充文件S2);(3)补充液的细胞毒性,但气溶胶不是35 (1 = 3%)(图1 e);和(4)气溶胶是细胞毒性但补充液不是35 = 23% (8)(图1 f, G和S3补充文件)。集体,当结合模式(1)和(2),74%的35常温补充液体/ DIY产品正确预测相应的气溶胶的细胞毒性。在某些情况下,补充液体或气溶胶是略高于70%的控制,而另一个下降略低于70%。对于这些图表,差异百分比计算,如果两个数字在10%,他们认为non-cytotoxic。
大多数补充液体/ DIY产品只包含甘油产生细胞毒性气溶胶
10的11个aerosolised glycerin-based补充水分(91%)是细胞毒性(图2 a - k)。Aerosolised蔬菜甘油本身,这是美国从自由购买烟DIY产品,是细胞毒性(图2 l)。只有一个补充液含有甘油,# 6瓦伦西亚,产生一个没有细胞毒性的气溶胶(图2 f)。
有偿付能力的细胞毒性
在图4从补充液体,溶剂气溶胶和气溶胶与已知溶剂成分读出标签是基于集成电路的绘制50价值观和溶剂组成。一般来说,补充液体气溶胶含有甘油是最细胞毒性。相比之下,气溶胶含有丙烯乙二醇和甘油的混合物整体的低细胞毒性(图4)。这种模式也看到真实aerosolised溶剂,比甘油,丙二醇显示较低的细胞毒性。
溶剂和气溶胶细胞毒性之间的关系。的集成电路50s(浓度百分比)气溶胶的高通滤波器是绘制每个产品用库存数量。降低集成电路50值显示更高的细胞毒性。点绘制在2.5没有强有力的MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl)−2, 5-diphenyltetrazolium溴)测定,作为集成电路50不能产生价值。PG或者只VG的列表示气溶胶由PG和VG美国从自由购买烟。VG补充液体的列表示气溶胶由补充液体含有甘油,和PG + VG补充液体的列表示补充液体含丙二醇,甘油。每个补充液分类是基于制造商的标签。高通滤波器,人类肺成纤维细胞;集成电路50,抑制浓度为50%。
讨论
本研究相比,补充体液的细胞毒性及其相应的气溶胶,建立了层次结构的效力包括烟气溶胶,比较三种不同细胞类型的敏感性烟气溶胶和表明,气溶胶与甘油由cartomizers细胞毒性比那些由丙二醇。
大约74%的气溶胶和相应的补充液体有类似的细胞毒性分类。这种相关性表明,使用补充液体用于筛查可能有用,实用和经济因为有成千上万的独特补充液体,这可以使测试大量的气溶胶。1开发一种筛选方法补充液体的第一检测毒性测试气溶胶紧随其后的液体,毒性会更便宜,更快和更少的劳动强度比为每个样本生产气溶胶。然而,一些有毒的气溶胶可能错过了这个策略,当测试新化学物质的化学修改或代由于加热,气溶胶的筛查是必要的。的情况下补充液只包含甘油,预测从补充液体气溶胶毒性数据准确的根据我们的数据将会超过90%。
其他包括烟气溶胶的细胞毒性研究发现变量的结果。符合我们的研究中,一些团体报道烟毒性和激活细胞应激通路,包括氧化应激和炎症。8 9 11 12 39-42一组类似于我们的研究结果发现,气溶胶毒性不同的时候使用不同的补充液体烟相同的设备,因此得出的结论是,流体成分毒性的重要来源。43与我们的研究中,一些组织认为烟补充液体和气溶胶没有细胞毒性或有相对较低的细胞毒性。44-47这些细胞毒性的差异已经被不同的实验室报告可能是由于细胞类型等变量,物种,包括烟的品牌研究,电压/功率和气溶胶的方法集合。其他组织利用气液界面系统与烟气溶胶直接暴露人类肺细胞。这些研究表明,各种各样的毒理学效应出现包括氧化、刺激炎症反应,降低细胞生存能力,减少代谢活性和基因表达的改变当使用3 d系统。7 39 48-50后续我们当前的屏幕,我们正在测试的一个子集补充液体使用一个气液界面系统间歇性暴露在确定毒性在3 d文化相似。
几项研究已经确定了香料化学物质可能有害的电子烟包括肉桂醛(肉桂),苯甲醛(樱桃)和2,5-dimethypyrazine(巧克力)。28日51 52效力的层次结构为气溶胶剂量反应生成数据在我们的研究表明,各种各样的调味补充体液细胞毒性。细胞毒性最大的6家气溶胶,五个是奶油/黄油味道专门类别(即# 19金手指食品、# 28焦糖,# 30奶油糖果,# 29奶油糖果和# 26焦糖),而第六的烟草,巧克力和奶油/黄油(ie, # 4瑞士黑)。这六个产品是基于甘油和集成电路50值低于蔬菜甘油DIY产品(# 33)。因此,它似乎是合理的,他们增加了力量与香料化学物质。双乙酰和2,3-pentanedione与肺部疾病在人类和老鼠,53-55经常发现在奶油/黄油补充体液,20 56,可能导致在我们的研究中观察到的细胞毒性。
所有气溶胶测试在这项研究中,包括那些有能力相对较低,明显不同于未经处理的控制除了# 16夏天桃(图1 b),和大多数补充液体产生的气溶胶,减少细胞生存控制的70%或更低。虽然我们的体外研究不能直接用于人类,一些人类的数据表明,慢性暴露在烟气溶胶可能与不良的健康影响。6 13 14然而,它是可能的,并不是所有的用户都同样受到由于电子烟产品,几项研究已经报道有利影响或任何重大不利影响。6 13 14 57-59为,这模型postimplantation在人类发展阶段,33通常是更敏感比分化成熟细胞包括烟气溶胶。这种趋势符合原始流体屏幕,在两种干细胞比成人肺细胞更敏感。27怀孕期间研究解决烟用在动物身上发现改变心脏发展(斑马鱼),行为改变(雄性老鼠)和损伤发展率和窝大小(秀丽隐杆线虫)。42 60 61此外,一个病例报告描述一天与结肠坏死性enterocolitits老婴儿,母亲的烟用在怀孕期间和劳动力被推测原因。62年上述研究表明需要进一步的研究对健康影响的产前接触烟气溶胶,尤其是孕妇有时从烟草烟电子烟减少伤害他们的胚胎/胎儿。63 64
本研究最重要的发现之一是,aerosolised甘油是细胞毒性比aerosolised丙二醇在正常情况下使用,没有干燥的膨化。我们的研究结果支持其他烟研究使用不同的细胞类型和显示,溶剂本身造成体外毒理学效应。49个50羰基化合物的报道集中在烟气溶胶也各不相同,22日24 65 - 67最近的研究表明,aerosolisation的甘油生产羰基占我们观察到的细胞毒性。22 67的细胞毒性溶剂尤为重要的日益流行glycerin-based补充液体,产生一个厚气溶胶云。14此外,一些补充液体被宣传为丙二醇免费向用户提供产品丙二醇过敏,和许多网站用户可以定制他们的丙二醇/甘油浓度。68年14
总之,这项研究表明,(1)aerosolised由于电子烟产品不同的细胞毒性与奶油/奶油风味最有力;(2)为其往往比成人肺细胞更敏感烟气溶胶;(3)四种模式的细胞毒性筛选补充液体和相应的气溶胶时出现;(4)大约74%的时间,从补充体液和细胞毒性数据气溶胶相关;(5)使用补充液体屏幕其次是集中筛选气溶胶是一个快速、廉价和不费力的方法识别产品可能产生细胞毒性;(6)91%的时间,glycerin-based补充液体气溶胶产生的细胞毒性使用2.85 V cartomizer风格包括烟;(7)与丙二醇相比,混合溶剂产品,从glycerin-based气溶胶产品更大的细胞毒性。这些数据表明,烟液体和气溶胶往往细胞毒性对人体细胞,可能会对呼吸系统有害。这项研究提供了新的信息,以帮助指导这些产品的监管和帮助用户避免的电子烟产品,可能会对他们的健康有害。
这纸补充道
成千上万的补充液体具有独特的口味是可用的在线和在世界各地的商店进行筛选以气溶胶形式困难。
细胞毒性一般没有改变补充液体储存在4°C时为1年。
干细胞通常比肺成纤维细胞和上皮细胞更敏感的气溶胶。
百分之七十四的时间补充液细胞毒性数据准确预测相应的气溶胶的毒性,毒性表示屏幕可以用液体。
气溶胶的奶油/黄油调味补充体液细胞毒性比其他任何味道。
Glycerin-based补充液体气溶胶产生的细胞毒性仅91%的时间表明甘油可能比丙二醇或混合溶剂更有害的产品。
确认
我们感激地承认维克多Camberos迈克尔·见鬼Jisoo金姆,亚历克斯Razo和Eriel Datuin对于他们的帮助使气溶胶准备,和我的手稿上华对她有益的建议。
引用
脚注
贡献者概念和设计:PT和奥地利中央合作银行。数据收集和解释:奥地利中央合作银行,YW和PT。数据分析和写作手稿:奥地利中央合作银行和PT。数据处理和样品制备:奥地利中央合作银行和YW。
资金研究报告在这份出版物是由格兰特PT R21DA037365数量从美国国立卫生研究院和FDA烟草产品中心。瑞秋Behar支持由国家卫生研究院NRSA个人博士前的奖学金(F31HL116121)。内容完全是作者的责任,并不一定代表官方观点的美国国立卫生研究院和美国食品和药物管理局。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意该项目不涉及人类。
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