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文摘
目标研究interferogenic的存在自身抗体在系统性硬化症(SSc)及其与临床表现相关,血清干扰素α水平(IFNα)和趋化因子的疾病过程中的重要性。
方法外周血单核细胞(PBMCs)或纯化血浆树突细胞(髓)从健康的捐赠者与血清刺激SSc (n = 70)患者或健康人群(n = 30),连同坏死或凋亡细胞材料。IFNαIFNα生产和血清,IFN-inducible protein-10 (IP-10) /趋化因子(C-X-C主题)配体10,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) /(碳碳主题)ligand-2 (CCL-2)、巨噬细胞炎性protein-1α(MIP-1α)/CCL-3和咆哮/ CCL-5测量和相关自身抗体的存在和SSc患者临床表现。
结果血清扩散SSc和SSc包含interferogenic抗体有限,这与anti-ribonucleoprotein和anti-Sjogren综合症抗原自身抗体的存在。pDCs IFNα负责生产所需的交互FcγRII和内吞作用。IP-10血清水平的增加与血管有关表现如心脏介入(p = 0.027)和肺动脉高血压(p = 0.036)。增加MCP-1或IFNα血清水平与肺纤维化相关(p = 0.019和0.048,分别)。数字溃疡包括数字损失与IFNα血清水平的增加有关(p = 0.029)。
结论激活I型干扰素系统之前在其他系统性自身免疫性疾病也出现在SSc和可能导致血管病理和影响profibrotic过程。
来自Altmetric.com的统计
介绍
系统性硬化症(SSc)是一种罕见的多系统自身免疫性疾病分为扩散(dcSSc)和皮肤(lcSSc)有限,其中前者是更严重和广泛的皮肤和内脏器官的参与。12SSc的病因学在很大程度上是未知的,但基因表达谱早期患者的外周血白细胞SSc证明增加I型干扰素(IFN)诱导表达的基因,是干扰素,除了基因参与针对内皮的血液白细胞。34许多不同的自身免疫性风湿病疾病和SSc分享这干扰素的签名,表明持续的I型干扰素的生产是中央在自身免疫过程。5,- - - - - -,9增加一些趋化因子的表达也报告了SSc,招聘的重要性和炎性细胞的活化。1011
我们曾表明IFNα可以由血浆树突细胞(髓)激活interferogenic免疫复合物(ICs)包含自身抗体和DNA或RNA。12,- - - - - -,15据报道,SSc血清含有anti-topoisomerase interferogenic ICs(威尼斯平底渔船)-我自身抗体可以形式,这种能力是与肺癌相关症状的患者。16在这项研究中,我们旨在阐明进一步I型干扰素的作用系统激活SSc和关联这与临床表现。在一个未经选择的患者群SSc因此我们调查了interferogenic IFNα血清和血清水平和能力interferon-inducible protein-10 (IP-10) /趋化因子(C-X-C主题)配体10,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) /(碳碳主题)ligand-2 (CCL-2)、巨噬细胞炎性protein-1α(MIP-1α)/ CCL-3和咆哮/ CCL-5。
患者和方法
病人和控制
共有70名患者,满足1980年美国风湿病学院初步定SSc (ACR)标准17在研究(包括表1)。
胃肠道参与被定义为食管蠕动障碍、吞咽困难、胃灼热、便秘、腹泻或大便失禁。肺纤维化是由高分辨率CT诊断和/或胸部x光检查。心脏介入被定义为现在或以前的心肌梗死,心力衰竭、胸膜炎或心律失常。数字的损失(acrolysis或手术截肢的影像学证据由于坏死溃疡),肺动脉高血压(PAH),以前硬皮病肾危机18或外围血栓形成记录。
目前的药物包括质子泵抑制剂(44/70例),血管紧张素转换酶抑制剂(36/70),钙通道阻滞剂(24/70),糖皮质激素(26/70),非甾体抗炎药(22/70)和免疫抑制药物(17/70)。血清样本30岁,sex-matched健康献血者被用作控制。
自体抗原决定
病人血清抗核抗体(ANA)的分析使用HEp-2细胞和间接免疫荧光法短膜虫属luciliae(Immunoconsept,萨克拉门托,加州美国)anti-dsDNA抗体。12患者和对照组的血清抗体SmB进行分析,D核糖核蛋白(RNP) -70 k, RNP-A, RNP-C,干燥综合症抗原(SSA) (Ro60和Ro52)、单边带、着丝粒B (CENP-B) Topo-I Jo-1,核糖体P抗原和组蛋白使用Inno-Lia安娜更新行污点分析(Innogenetics,根特,比利时)。12
细胞培养条件和IFNα抗病诱导剂
外周血单核细胞(PBMCs), pDCs和单核细胞从健康献血者巴菲准备外套在96孔板和培育14;在网上看到的细节补充材料。
从单核细胞的坏死和凋亡细胞材料U937细胞13是用于细胞培养的最终浓度为10%和25%,分别。病人或控制血清用于最终浓度为10%,1%,0.1%或0.01%,有或没有坏死或凋亡的材料。血清被定义为IFNα诱导当IFNα生产高于均值IFNα+ 2 sd一起控制血清引起坏死(> 15 U /毫升)或凋亡(> 10 U /毫升)材料。控制IFNα诱导物,UV-inactivated单纯疱疹病毒类型使用。13。患者免疫球蛋白g 6 SSc和两个健康控制血清纯化如前所述。13
抑制剂IFNα生产
坏死细胞材料以及控制IFNα诱导物聚我:C (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州美国),pcDNA3质粒和单纯疱疹病毒治疗DNase-free核糖核酸酶A(8µg /毫升;AB-Gene,英国萨里郡)或RNase-free DNase (20 Kunitz单位/毫升;试剂盒、希尔登,德国)。13诱导物是核糖核酸酶孵育,DNase或中等,3 h在37°C添加免疫球蛋白或转染代理Lipofectin(表达载体,圣地亚哥,加州美国)。anti-FcγRII单克隆抗体(写明ATCC IV.3: hb - 217,罗克维尔市,马里兰美国)准备如前所述13和IgG2b同形像控制(BD生物科学,圣何塞,加州美国)用于表示浓度诱导文化PBMCs或髓。磷酸氯喹(5µg / ml: Sigma-Aldrich)被用来抑制内吞作用。
免疫测定的IFNα
由dissociation-enhanced IFNα水平上层清液测定镧系元素fluoroimmunoassay (DELFIA),检测最IFNα亚型但不是IFNα2b(检测等级≥2 U /毫升)。19检测血清中IFNα,执行一个更加敏感的DELFIA(检测水平≥0.5 U /毫升)。20.
在患者和对照组的血清趋化因子的多元分析
IP-10的水平、MCP-1 MIP-1α和咆哮的血清样本进行分析4-Plex Bio-Plex多重细胞因子测定(Bio-Rad大力士,加州美国)。增加趋化因子水平定义为平均值控制血清+ 2 sd。
统计数据
数据使用SPSS软件进行分析(芝加哥,伊利诺斯州美国)。之间的差异进行分析组,克鲁斯卡尔-沃利斯与邓恩事后测试或Mann-Whitney U测试使用。使用斯皮尔曼等级相关检验相关性计算。p值≤0.05被认为是重要的。
结果
病人的特点
病人特点所示表1。55/70的患者ANA阳性。特定的自身抗体检测在43/70的病人血清和没有控制。在10个病人几个自身抗体特异性在场:CENP-B SSA(4名患者),CENP-B, SSA和RNP(一位病人),SSA和RNP(2例),SSA和Jo-1(一个病人)和RNP结合anti-Topo-I在两个病人。没有antihistone抗体和一个病人anti-dsDNA抗体。
IFNα-inducing能力SSc血清与凋亡或坏死细胞材料相结合
我们最初研究的能力SSc血清诱导IFNα生产在正常PBMCs结合凋亡或坏死细胞材料。我们发现33和23 70在一个或多个病人血清检测血清浓度诱导IFNα当结合坏死(314±478 U /毫升,意味着±SD)或凋亡细胞物质(399±574 U /毫升,平均±标准差),这是明显高于健康人血清(图1一个)。除了一个IFNα-inducing血清诱导IFNα最高水平在0.1%或1% SSc血清用于坏死或凋亡的材料。有IFNα水平之间的相关性引起的病人血清结合坏死和凋亡细胞物质(斯皮尔曼r = 0.537)。没有IFNα血清诱导的凋亡或坏死细胞材料单独(没有显示)。
干扰素α(IFNα)引起的生产从系统性硬化症(SSc)患者血清。(A)外周血单核细胞(PBMCs)健康献血者被坏死或凋亡细胞刺激材料结合血清SSc (n = 70)患者或健康人群(n = 30)。每个数据点代表最大IFNα水平测试获得的血清浓度(0.001%、0.01%、0.1%或1%)。水平线显示为每组血清中位数的值。实验重复了四次不同的健康献血者PBMCs相似的结果。IFNα水平细胞培养上清液测定20 h后免疫测定。(B)由PBMCs IFNα生产血浆树突细胞(髓样),pDC-depleted PBMCs或单核细胞健康献血者,刺激细胞坏死物质和SSc患者血清。一个最优的血清浓度(看到)用于每个SSc血清。值意味着IFNα五SSc血清水平和标准偏差引起的。三种实验显示了类似的结果。 No IFNα could be detected when sera from healthy controls were used (not shown). IFNα levels in cell culture supernatants were measured after 20 h by an immunoassay.
pDCs负责IFNαSSc-associated IC生产刺激
然后,我们调查是否pDCs负责SSc serum-induced IFNα生产。纯化的髓后产生大量的IFNα刺激比PBMCs SSc血清和坏死物质,和pDC-depleted PBMCs或纯化单核细胞不能产生任何IFNα(图1 b)。然后我们分析是否IFNα生产所需的免疫球蛋白。SSc免疫球蛋白结合坏死细胞材料引导IFNα浓度的方式(图2),但不是一个人(没有显示)。的IFNα感应SSc-associated ICs是敏感的核糖核酸酶治疗,但被DNase(影响较小图2)。此外,IFNα生产pDCs SSc血清和坏死或凋亡刺激材料是强烈减少抗体FcγRII (图3一)或通过阻断核内体的酸化与氯喹(图3 b, C)。我们得出结论,pDCs负责IFNαRNA-containing引发的生产,通过FcγRII SSc-associated ICs, endosome-dependent通路。
干扰素α(IFNα)坏死引起的生产材料和从系统性硬化症患者免疫球蛋白(SSc)需要的RNA。从健康献血者外周血单核细胞与表示的浓度SSc刺激免疫球蛋白和坏死细胞的材料。坏死细胞材料与核糖核酸酶或DNase治疗,或不及时治疗。IFNα水平细胞培养上清液测定20 h后免疫测定。一式三份的均值和标准差值井。当几个免疫球蛋白制剂也获得了类似的调查结果与不同的自体抗原特异性。两种实验使用SSc免疫球蛋白与类似的结果包含自身抗体RNP topoisomerase-I显示。
干扰素α(IFNα)生产血浆树突细胞(髓)诱导系统性硬化症患者的血清(SSc)是通过FcγRII和核内体介导的。pDCs从健康献血者和SSc血清刺激(A, B)凋亡或坏死细胞(A、C)材料。(一)表示的单克隆抗体浓度FcγRII或IgG2b同形像控制抗体被添加到感应的文化。(B, C)髓刺激与SSc血清不同的特异性,系统性红斑狼疮血清或UV-inactivated单纯疱疹病毒存在与否的磷酸氯喹(5µg /毫升)和(B)凋亡或(C)坏死细胞材料。IFNα水平细胞培养上清液测定20 h后免疫测定。均值和标准差值至少两个不同的pDC捐助者在每个面板。
IFNα感应与安娜的相关性模式和特定的自身抗体的存在
接下来,我们问如果有任何不同的安娜模式之间的相关性或特定的自身抗体的存在和能力诱导IFNα生产。IFNα水平没有显著差异引起的PBMCs ANA-negative (n = 15)或ANA-positive血清(n = 55),结合坏死(117±276 vs 162±381 U /毫升;均值±SD)或凋亡材料(98±149 vs 171±441 U /毫升;平均数±标准差)。没有安娜模式与IFNα-inducing能力明显高于血清(结果未显示)。
与多个特异性血清含有抗体诱导IFNα比用一个自身抗体血清特异性。大多数与多种自身抗体血清特异性自身抗体包含RNP和/或SSA IFNα诱导高水平(图4)。IFNα-inducing低容量可以发现在血清中所占的比例仅包含自身抗体Topo-I或CENP-B,这些血清没有显著增加IFNα-inducing能力与病人血清相比缺乏这些抗体。
干扰素α(IFNα)诱导能力不同的特异性自身抗体。系统性硬化患者的血清;n = 70)或从健康对照组血清(HC);n = 30)结合(A)坏死或(B)凋亡细胞材料,并将其添加到文化,从健康献血者外周血单核细胞。酒吧显示IFNα水平引起的血清;HC血清,SSc血清没有检测到自身抗体(Auto-Ab底片)或与一个SSc血清自身抗体特异性(单一)表示或和几个不同的自身抗体特异性(多个)。酒吧的数量下的数字IFNα-inducing血清(诱导超过平均IFNα生产+ 2 sd引起控制血清连同坏死或凋亡材料)其次是血清的总数量在每个类别。IFNα水平测量20 h后免疫测定。值均值和标准差。三种实验显示了类似的结果。
然而,当11血清诱导> 200 U /毫升IFNα结合坏死物质更详细地进行分析,我们发现一个协会IFNα-inducing高容量和安娜有斑点的存在模式(p = 0.044), anti-RNP (p = 0.001)或anti-SSA (p = 0.001)。16个血清诱导的IFNα-inducing能力> 50 U /毫升IFNα凋亡材料与斑点安娜模式(p = 0.042)和anti-RNP (p = 0.001)或anti-SSA (p = 0.043)。
体内生产IFNα、IP-10、MCP-1 MIP-1α患者SSc咆哮
然后我们探讨SSc患者是否有任何迹象的体内激活I型干扰素系统如果这与一些趋化因子SSc的发病机制的重要性。我们发现IFNα7/70的病人血清(范围0.5 -18 U /毫升)(未显示),和19/69的病人血清水平增加IP-10 (≥118 pg / ml) (图5)。IFNα和IP-10血清水平有相关性(枪兵r = 0.347, p = 0.03)。总共9 69水平升高的患者MCP-1 (≥299 pg / ml: p = 0.02),而与IP-10水平(枪兵r = 0.309, p = 0.009)病人血清。水平的提高MIP-1α(≥14 pg / ml)和咆哮(≥143 ng / ml)中只有两个,一个病人样本,分别。之间不存在相关性的血清趋化因子与SSc血清的IFNα-inducing能力来衡量。
(A)的血清水平interferon-inducible protein-10 (IP-10), (B)单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1), (C)巨噬细胞炎性protein-1α(MIP-1α)和(D)咆哮在系统性硬化症患者(n = 70)或在健康对照组(n = 30)测量多路珠免疫测定。水平线显示每组的中间值。
循环细胞因子的相关性与安娜模式和特定的自身抗体
我们发现的水平明显高于IP-10 (210 vs 71 ng / ml, p = 0.020)和MCP-1 (210 vs 144 ng / ml, p = 0.018)相比,ANA-positive ANA-negative血清。有弱关联MCP-1水平和斑点安娜模式(p = 0.05),虽然没有关联能找到其他安娜模式。SSA抗体与血清水平增加有关IFNα(p≤0.001)和IP-10 (p = 0.011)。有一个消极的协会与CENP-B自身抗体和血清IFNα水平(p = 0.049),而没有其他协会能找到其他特定的自身抗体的存在与细胞因子来衡量。
临床表现之间的联系和激活I型干扰素系统
接下来,我们检查了可能的不同的疾病表现和IFNα感应之间的关联,血清水平的IFNα或趋化因子。水平的提高IP-10与心脏介入有关(p = 0.027),多环芳烃(p = 0.036)的迹象,动脉或静脉血栓形成史(p = 0.037)和红细胞沉降率(ESR) (p = 0.002)。增加血清IFNα水平相关的历史数字溃疡(p = 0.029),尽管数字损失是目前只有五个病人,其中四个水平增加血清IP-10与64年的相比没有数字损失(确切概率法;p = 0.022)。肺纤维化与MCP-1血清水平的增加(p = 0.019)和IFNα(p = 0.048),但不是与干扰素诱导凋亡或坏死细胞材料。硬皮病肾的历史危机是只存在于两个病人,但血清诱导高IFNα生产与坏死或凋亡的材料,也增加了血清水平的IP-10(参阅在线补充表1)。没有发现协会IFNα之间感应或血清细胞因子水平及其他疾病的表现。
我们进一步探讨是否ESR作为疾病活动的标记可能与体内细胞因子的生产。我们发现血清IFNα(枪兵r = 0.39, p = 0.001),和趋化因子IP-10(枪兵r = 0.38, p = 0.002), MCP-1(枪兵r = 0.25, p = 0.045)和MIP-1α(枪兵r = 0.46, p < 0.001)与ESR。
我们也分析了血清诱导高水平的IFNα分开,发现IFNα-inducing能力(> 200 U /毫升)结合坏死物质与ESR有关(p = 0.022)和数字损失(p = 0.025)则没有这样的关系可以发现凋亡材料。
讨论
在这项研究中,我们观察到,从一个没有组患者的血清SSc连同坏死或凋亡材料诱导IFNα生产pDCs,显然由ICs由SSc自身抗体激活。从患者血清lcSSc或dcSSc同样有效地触发IFNα生产,证明interferogenic ICs的形成并不局限于疾病的一个子集。这一发现是由观察证实lcSSc患者或dcSSc都显示一个IFNα签名,4这lcSSc或dcSSc患者单核细胞显示没有区别Siglec-1管理他们的I型干扰素的表达。21因此,dcSSc和lcSSc可以包含在大群系统自动免疫疾病的IFNα签名可以造成interferogenic ICs的存在引发pDCs连续IFNα生产。
符合观测的其他疾病,只有比例的患者血清有能力形成interferogenic ICs,1214这可能是由于以下几个原因。一种可能性是,I型干扰素系统激活时SSc的早期阶段中最重要的是免疫激活和炎症明显比在疾病的后期。支持这个解释观察最高IFNα生产与ESR高有关。此外,早期的研究表明,循环IFNα抗病诱导剂在耀斑在狼疮患者更常见2223IFNα签名是在早期的疾病。24
关联IFNα生产时不同的SSc血清自身抗体的存在,我们发现,诱导高水平的IFNα有着明确的联系和autoanti——身体rna结合蛋白,anti-RNP和SSA。这些自身抗体是经常出现在许多风湿性疾病IFNα签名5725和与血清IFNα活动系统性红斑狼疮。26在这项研究中,形成了ICs的interferogenic能力也依赖于RNA和被抗体FcγRII以及氯喹。因此,我们的研究结果表明,rna结合蛋白自身抗体是最重要的一代interferogenic ICs SSc,表明TLR7激活是一种常见的通路的IFNα签名表达系统性自身免疫性风湿性疾病。
与先前的研究中,我们无法证明anti-Topo-I抗体形成强烈interferogenic ICs。16差异的原因尚不清楚,但之前的研究并没有排除这种可能性,其他自身抗体存在于血清导致interferogenic活动调查。我们也观察到,与多个特异性血清在生成interferogenic ICs最有力。此外,在四个血清自身抗体无法被证明通过间接immunofluorescense安娜或线污点Inno-Lia试验但仍诱导IFNα生产,表明I型干扰素的生产在某些患者SSc不是依赖ICs或由于interferogenic ICs包含自身抗体与特异性不调查研究。IFNα生产机制不依赖ICs被描述在牛皮癣,抗菌蛋白质LL37结合核酸和激活的髓。27因此,类似IFNα生产机制可能存在在一些患者SSc。
少数患者可检测血清IFNα水平,只有28%的人显示增加可由IFNαIP-10水平。然而,我们观察到,增加IP-10水平与心脏介入有关,多环芳烃的迹象,ESR升高,虽然只出现在一些病人,与数字和肾危机损失。即使我们找不到任何IFNα-inducing能力之间的关联和临床表现为整个集团,我们发现高IFNα生产(> 200 U /毫升)坏死物质和ESR增加是与数字有关的损失。我们没有正确的多个测试和结果必须被谨慎,但观察,大多数临床协会相关血管表现很有趣。结果在我们看来加强视图,I型干扰素可能重要的SSc血管病变的发展。SSc的先前的研究表明,IFNαmRNA表达的主要是血管和血管周的细胞,4这upregulation myxovirus-resistance蛋白质28或增加干扰素基因的表达29日与缺血性溃疡数字相关联。IFNα抗血管新生的影响,30.并可以在狼疮损害血管内皮细胞分化。31日因此,激活SSc的I型干扰素系统可能影响微血管系统和确切的机制IFNα导致血管损伤的澄清是很重要的。此外,有一个关联MCP-1 IFNα和肺纤维化,强调的重要性,I型干扰素系统疾病过程中。
总之,SSc的患者比例有自身抗体生成ICs的体外激活pDCs IFNα生产能力。这种观察可能至少部分解释观察到的IFNα签名lcSSc和dcSSc患者也增加血清水平的I型IFN-induced分子。后者之间的关系和血管病变的临床表现是有趣的,也许可以解释为什么许多风湿性疾病的特点是频率的增加心血管疾病也有一个激活的I型干扰素系统的迹象。综上所述,我们的观察可以解释为何IFNα管理局SSc有助于患者在疾病发展过程中,32和支持的观点,I型干扰素通路是一个可能的治疗目标。
确认
作者感谢安妮Tronnberg女士优秀的技术援助和女士Rezvan Kiani收集血液样本。
引用
脚注
资金工作是达纳基金会赠款支持瑞典研究理事会的瑞典社会医学、瑞典风湿病协会,瑞典癌症基金会,乌普萨拉大学医院发展基金会,艾格尼丝和Mac Rudberg基金会尼尔森基金会,国王古斯塔夫V 80年基金会和结合。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准伦理委员会批准的这项研究是在乌普萨拉和知情同意从所有患者获得和控制。