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摘要目的:识别目标抗原antifibroblast抗体(AFA)在系统性硬化症(SSc)的病人。
患者和方法:在第一部分中,从24 SSc患者血清与肺动脉高血压(12(多环芳烃)和12)和36特发性PAH患者,进行集中血清组三,比较与14名健康对照组血清池(HC)。血清免疫球蛋白反应分析了通过使用一个二维电泳和免疫印迹技术与正常人类成纤维细胞抗原。在第二部分,血清免疫球蛋白反应两组:158 SSc, 67特发性多环芳烃和100 HC;和35 SSc和50 HC对α-enolase从测试酿酒酵母分别和重组体人(rHu)α-enolase ELISA。
结果:在第一部分,α-enolase被认定为主要目标抗原的阿SSc的病人。在第二部分中,37/158 (23%)SSc病人,6/67(9%)特发性肺动脉高压病人和HC 4/100 (4%) (p < 0.001)有反年代酵母α-enolase抗体;12/35(34%)的患者SSc和3/50(6%)的HC anti-rHuα-enolase抗体(p = 0.001)。SSc,反的存在年代酵母α-enolase抗体与间质性肺病(ILD)、肺活量下降(73.2% vs 89.7%;p < 0.001)和扩散能力一氧化碳(47.4% vs 62.3%;p < 0.001), antitopoisomerase 1抗体(46% vs 21%;p = 0.005)但不是anticentromere抗体(11% vs 34%;p = 0.006)。结果类似于rHuα-enolase测试。
结论:SSc,阿发承认α-enolase和相关ILD和antitopoisomerase抗体。
来自Altmetric.com的统计
系统性硬化症(SSc)是一种结缔组织疾病的特点是过度的胶原蛋白沉积在皮肤和内脏器官,血管代和消灭的现象。12抗核抗体存在于80 - 90%的病例。3三个自身抗体特定SSc和互斥:anticentromere抗体,与皮肤的SSc有限,4antitopoisomerase 1抗体,与间质性肺病(ILD)5和anti-RNA-polymerase三世抗体,与硬皮病相关肾危机。6此外,SSc患者的血清被发现含有非特异性自身抗体,包括antifibrillin 1,7anti-endothelial细胞891011和antifibroblast抗体(AFA)。121314151617在SSc病人,阿发可以激活成纤维细胞,引起细胞外基质蛋白质合成。1315抗血小板源生长因子受体的抗体是最近在SSc患者确认。据报道这些抗体诱导酪氨酸磷酸化和活性氧积累,刺激I型胶原基因表达和myofibroblast表型转换在正常人类主要的成纤维细胞。15然而,刺激anti-platelet-derived生长因子受体抗体的存在SSc患者仍然是有争议的。1819
在先前的研究中,利用蛋白质组学方法结合二维电泳(2 de)和免疫印迹,与正常人类成纤维细胞是自体抗原的来源,我们确定了特发性肺动脉高血压患者(多环芳烃)和SSc-related PAH,特定的目标抗原的阿发扮演关键角色在细胞生物学和体内平衡的维护。20.因此,我们决定使用同样的方法来识别目标抗原的阿发SSc的病人。
患者和方法
血清样本
在第一部分的研究中,为了确定阿发的目标抗原,血清样本获得24 SSc患者(12与多环芳烃经右心catheterisation (RHC)和12)和36 PAH患者经RHC(24与特发性肺动脉高压,六个家族多环芳烃和六dexfenfluramine-related多环芳烃)和14名健康对照组(HC)没有明显的区别于患者的年龄或性别。在第二部分的研究中,验证的基础上确定目标抗原的ELISA和表型的相关性,我们与SSc包括158例,67例多环芳烃经RHC和100 HC。所有患者的血清和HC整除,储存在−80°C进行测试。所有患者把他们的书面知情同意的伦理委员会La - salpetriere医院集团。
SSc病人满足SSc美国风湿病协会的标准21和/或勒罗伊和Medsger标准。22有限的SSc被雷诺氏现象的定义和异常出现在capillaroscopy和/或SSc-specific自身抗体在缺乏皮肤参与;有限的皮肤SSc的定义,除了以前的标准,通过皮肤增厚远端地区肘部和膝盖;23和弥漫性皮肤SSc定义为皮肤增厚近端、远端,肘部和膝盖。23没有一个病人其他结缔组织疾病或癌症。
2 de和免疫印迹,患者由不同的表型:(1)特发性多环芳烃;(2)家族多环芳烃;(3)dexfenfluramine-related多环芳烃;(4)没有PAH SSc-PAH和(5)SSc病人。三组患者血清具有相同的多环芳烃和/或SSc表型汇集。血清的14个HC也汇集。我们因此测试八池特发性肺动脉高压患者的血清,两池家族PAH患者,患者的两个池dexfenfluramine-related PAH,四池SSc PAH患者、四池SSc HC患者没有多环芳烃和一个游泳池。ELISA试验,对SSc病人血清样本,特发性肺动脉高压病人和HC单独进行测试。
临床、生物和免疫参数由使用标准化的形式详细记录(见补充数据网上)。
细胞培养
正常的人类皮肤成纤维细胞在HC从皮肤活检获得执行。活检标本,去籽切成培养皿培养如前所述。20.
检测与细胞抗原抗体反应使用2 de和免疫印迹
抗体反应性分析是使用2 de与正常的人类皮肤成纤维细胞和免疫印迹技术如前所报道。20.细胞培养、蛋白分离、蛋白质量化、二维凝胶电泳,二维印迹和蛋白质质谱鉴定2 de凝胶进行详细(见补充数据网上)。20.242526给出了确定蛋白质表1。
检测和验证的抗体反应酿酒酵母和人类重组α-enolase ELISA
从158 SSc患者血清免疫球蛋白反应,67 PAH患者和100 HC被ELISA检测酿酒酵母α-enolase(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和血清免疫球蛋白反应从35 SSc病人和50 HC测试对重组人类(rHu)α-enolase Abnova,台北,台湾。ELISA进行补充的详细数据(仅网上)。样品被认为是阳性反年代酵母或anti-rHuα-enolase抗体在光密度大于或等于平均+ 2 SD HC的值。
统计分析
数据中位数和百分比。确切概率法或χ2测试是使用适当的比较定性值,和Mann-Whitney非参数测试被用来量化的值进行比较;p < 0.05被认为是显著的。统计分析涉及使用InStat(版本3.00)。2 de和蛋白质质谱鉴定,分析如前所述。20.
结果
特征的病人评估阿发的蛋白质组学方法
PAH患者的临床及免疫学特性,归纳了SSc病人表2。十个病人SSc有限。特发性肺动脉高压患者明显比那些年轻SSc有或没有多环芳烃(38.9(标准差15.1)和54.8(标准差16.6)年;p = 0.001)。两组之间的性别比例是相似的。PAH患者相似的疾病持续时间特发性多环芳烃和SSc(27.4(标准差41.4)和25.3(标准差19.4)个月;p = 0.57)。
血清免疫球蛋白反应在HC和PAH患者和/或SSc和纤维母细胞抗原
从正常的人类成纤维细胞蛋白质提取,在硝酸银染色,发现了859个蛋白质斑点和436 (SD 118)斑点被成功转移到聚乙二烯二氟化物膜。血清免疫球蛋白SSc病人血清池的认可比血清免疫球蛋白g蛋白斑点从HC (84 (SD 29)和43 (SD 22);p = 0.03)。血清免疫球蛋白g 12血清池的PAH患者和8为SSc患者血清池认可92 (SD 30)和72 (SD 24),分别。从血清血清免疫球蛋白PAH患者认可显著更多的蛋白质斑点比HC与无显著差异(p < 0.05),在识别SSc患者和HC。
血清免疫球蛋白四个血清池的SSc PAH患者和4个血清池的SSc病人没有PAH承认81 (SD 12)和63 (SD 32)蛋白质斑点,分别(不重要)。
比较之间的血清免疫球蛋白抗体绑定SSc病人和HC和识别目标抗原的阿
我们使用计算机分析评估血清免疫球蛋白的绑定目标抗原抗体的血清池SSc病人和HC。我们选择由SSc病人和HC共享的蛋白质斑点,但比在HC SSc患者的认可更强烈;和蛋白质斑点承认在75%以上的SSc患者的血清池,而不是承认HC的池。我们因此选择14个蛋白质斑点被血清血清中免疫球蛋白SSc患者(图1)。
二维silver-stained蛋白质模式健康供体成纤维细胞总蛋白提取的。确定13活性点的位置被一个计算机程序任意分配。GCP、谷氨酸carboxy-peptidase;G6PD glucose-6-phosphate-deshydrogenase;HSP27、热休克蛋白27个;Kelch-like电解珩磨,Kelch-like ECH-associated蛋白1;PHF15、蛋白质Jade-2;PI3激酶,磷脂酰肌醇3激酶;UGT1A UDP-glucuronosyltransferase 1 - 2;51 ZFP51,锌指蛋白。
十三14点被成功鉴定的质谱分析。阿根廷足协认可的目标抗原的血清SSc病人而不是HC中列出表1。阿根廷足协认可的目标抗原血清更强烈的SSc病人比HC caldesmon, p22Dok UDP-glucuronosyltransferase 1 - 2▽和α-enolase (图2)。蛋白质识别和显示关于这些作业的可靠性表1。
血清免疫球蛋白反应在肺动脉高血压(PAH)患者中,系统性硬化症(SSc)患者和健康对照组与纤维母细胞抗原通过二维电泳和免疫印迹α-enolase关注区域对应的反应。蛋白质点在选定地区从45至50 kDa和等电点在6.50到7.50之间波动。IPAH特发性肺动脉高血压;MW,分子量。
anti-α-enolase抗体的ELISA检测
患者的血清SSc (n = 158)、特发性多环芳烃(n = 67)和HC (n = 100)评估了反年代酵母α-enolase抗体ELISA。SSc病人比HC显示反更频繁年代酵母α-enolase抗体(37/158(23%)与4/100 (4%);p < 0.001)。之间没有显著差异被发现特发性肺动脉高压病人和HC(6/67(9%)与4/100 (4%);图3)。ELISA, SSc病人比HC (n = 35)更频繁(n = 50)显示anti-rHuα-enolase抗体(12/35(34%)与3/50 (6%);p = 0.001;数据未显示)。
探测反年代酵母α-enolase抗体的ELISA系统性硬化症(SSc)患者肺动脉高压(PAH)患者和健康对照组。反的线代表了积极的阈值年代酵母α-enolase抗体,由光密度(OD)大于或等于平均+ 2 SD健康对照组的值。
临床和SSc anti-α-enolase患者抗体的免疫学特征
SSc患者的临床及免疫学特性评估anti-α-enolase抗体中描述表3。患者反年代酵母α-enolase抗体(n = 37)更频繁地比那些没有抗体(n = 121)显示肺活量下降(73.2% vs 89.7%;p < 0.001)、用力肺活量下降(73.0% vs 87.1%;p = 0.016),限制综合症与肺活量不足80% (76% vs 32%;p < 0.001),肺纤维化(27% vs 12%;p = 0.03),减少扩散能力一氧化碳(47.4% vs 62.3%;p < 0.001)和antitopoisomerase 1抗体(46% vs 21%;p = 0.005),减少频繁显示anticentromere抗体(11% vs 34%;p = 0.006)。此外,反患者年代酵母α-enolase抗体更频繁地宣称黑人种族(26% vs 12%;年轻(p = 0.06), 44.2(标准差16.7)和48.2(标准差14.6);p = 0.08),但并不显著,比那些没有抗体(表3)。32 SSc-PAH患者中,九23没有肺纤维化肺纤维化,电脑断层扫描。4 9例(44%)患者的肺纤维化和八23(35%)的那些没有肺纤维化anti-α-enolase抗体(p = 0.70)。capillaroscopic异常(megacapillaries和/或无血管的区域)中发现了17个27例(63%)患者anti-α-enolase抗体和63年的97 (65%)(p = 1.00)。
患者中评估anti-rHuα-enolase抗体,抗体阳性12(34%)和23个(66%)呈阴性。患者anti-rHuα-enolase抗体更频繁地比那些没有抗体展出ILD和肺活量下降(69.3% vs 89.4%;p = 0.006),肺活量不足80% (73% vs 29%;p = 0.05),减少扩散能力一氧化碳(43.9 vs 64.5;p = 0.005;数据未显示)和最大肺活量下降(67.6% vs 86.7%;p = 0.08)和肺纤维化(42% vs 13%;p = 0.09),虽然不是很多。患者anti-rHuα-enolase抗体更频繁地比那些没有抗体显示antitopoisomerase 1抗体(67% vs 22%;p = 0.02; data not shown). As observed with anti-年代酵母α-enolase抗体,患者anti-rHuα-enolase抗体更频繁地宣称黑人种族(42% vs 13%;年轻(p = 0.09), 42.1(标准差13.8)和49.2(标准差16.9);p = 0.08),但并不显著,比那些没有抗体(数据未显示)。
讨论
我们使用2 de和免疫印迹技术和发现有13个目标抗原SSc阿发的患者。这些目标抗原包括glucose-6-phospate deshydrogenase谷氨酸羧肽酶,锌指蛋白51,热休克蛋白27日PHF15, phosphatidyl-inositol-3激酶,Kelch-like ECH-associated蛋白1,caldesmon, p22Dok UDP-glucuronosyltransferase 1 - 2▽和α-enolase亚型。这些蛋白参与细胞骨架调节、细胞萎缩、氧化应激、细胞能量代谢和在不同的通路,扮演关键的角色在细胞生物学和体内平衡的维护。
在这些蛋白质抗原,我们选择α-enolase来验证我们的方法并建立表型关联因为anti-α-enolase抗体被发现在各种各样的自身免疫和炎性疾病包括SSc,27因为免疫球蛋白反应针对α-enolase确定SSc患者尤其高于HC。
Alpha-enolase,也叫做non-neuronal烯醇酶,属于一个家庭的糖酵解酶。28除了糖酵解作用,α-enolase相关的其他许多函数其亚细胞位置。28Alpha-enolase在许多真核细胞表面的表达,如刺激造血的细胞(中性粒细胞、B和T淋巴细胞、单核细胞),上皮细胞,神经细胞和内皮细胞,2829日30.31日32和可以作为一个强大的受体,激活纤溶酶原。物2830.然而,upregulationα-enolase没有导致增加纤溶酶原激活物在c-jun转换鼠成纤维细胞。33当位于细胞核,α-enolase Myc-binding蛋白(MBP-1),起着至关重要的作用在调节细胞生长和分化。此外,α-enolase调节内皮细胞在缺氧的环境压力和可能也起到了直接或间接的作用位点专一的小管组织。34
Anti-α-enolase抗体被发现在多种自身免疫和炎性疾病包括病人的反应与中心体系统性风湿性疾病,34antineutrophil细胞质antibody-associated系统性vasculitides,35溃疡性结肠炎和克罗恩病,36原发性硬化性胆管炎,37系统性红斑狼疮,38cryoglobulnaemia混合,38SSc,38类风湿性关节炎(RA),39遗传病的疾病,40多发性硬化症,41桥本脑病的42和癌症等多种视网膜病变视网膜病变。43在HC,α-enolase抗体被发现在0 - 6%之间,3638434445我们最近报道,α-enolase的主要目标之一是自然antiendothelial细胞抗体。24
考虑到广泛的疾病与anti-α-enolase相关抗体,这些抗体似乎并不帮助在一个特定的自身免疫性疾病的诊断。然而,最近的一项研究显示,存在anticitrullinatedα-enolase RA患者的抗体,这些抗体特定RA。46除了可能的诊断意义,anti-α-enolase抗体可以作为预后标记在系统性红斑狼疮和cryoglobulinaemia anti-α-enolase抗体的存在与肾有关参与,353847但是这些发现仍有争议。48
在SSc以前的工作,测试病人的数量很小,并没有明显的相关性之间anti-α-enolase抗体的检测和临床表现,除了严重的器官的参与。38在目前的工作,我们发现反年代酵母α-enolase和anti-rHuα-enolase抗体SSc病人的23%和33%,分别比HC更频繁。此外,anti-α-enolase抗体与ILD和antitopoisomerase 1抗体有关。这些发现进一步支持,anti-α-enolase抗体可能导致的病理生理学SSc诱导成纤维细胞增殖或激活,因为它曾被报道,anti-α-enolase抗体可以诱导细胞增殖,血管内皮细胞损伤通过免疫复合物的生成和激活补体级联,并抑制纤溶酶原与扰动α-enolase物的绑定的血管内和pericellular纤溶系统。27同时,这两个反的存在年代酵母α-enolase和anti-rHuα-enolase抗体可能表明微生物烯醇酶的作用的起始SSc患者自身免疫。
在以前的工作中,我们发现阿SSc-associated PAH患者在30%的患者和40%的特发性多环芳烃。17在SSc患者中,阿发已经被证明体外诱导成纤维细胞激活和pro-adhesive炎性细胞的表型。13目标抗原的阿发PAH患者最近被我们组。20.PAH患者和那些SSc分享这些目标抗原:glucose-6-phosphate脱氢酶、谷氨酸羧肽酶,锌指蛋白51,热休克蛋白27日PHF15,磷脂酰肌醇3-kinase, Kelch-like ECH-associated蛋白1和α-enolase。这个发现支持这样一个概念,即共同的特征参与特发性肺动脉高压的病理生理学和SSc。
我们还发现新目标抗原的阿发SSc病人:caldesmon, UDP-glucuronosyltransferase 1 - 2和p22Dok▽。这些蛋白质在细胞生物学上发挥了关键作用:caldesmon是一个肌动蛋白和myosin-binding蛋白与肌动球蛋白的规定相互作用在平滑肌细胞和成纤维细胞,和p22Dok▽62 - kda,截断p21Ras GTPase激活相关蛋白蛋白质同种型,是早期各种酪氨酸磷酸化途径的衬底。49
总之,我们的研究结果证实阿发SSc患者的存在,并提供证据表明这些细胞抗体识别目标,特别是α-enolase扮演关键的角色在细胞生物学和体内平衡的维护。我们发现通过使用验证年代酵母α-enolase和rHuα-enolase。Anti-α-enolase抗体与ILD和antitopoisomerase抗体。最后,这些抗体的有效性SSc筛查、诊断或后续需要进一步证实了广泛的实验室筛选的大型和地理位置不同组的SSc的病人和其他病人组与ILD结缔组织疾病。
确认
作者要感谢尼古拉•杜宾提供正常的人类成纤维细胞。MCT, MH、LG和LM的Groupe法语de矫揉造作的苏尔Sclerodermie。
引用
补充材料
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脚注
▸额外补充数据只在网上发布http://ard.bmj.com/content/vol69/issue2
资金这项工作是由协会支持des Sclerodermiques法国(ASF),腿Poix, Chancellerie des大学,Academie巴黎,法国,法国Actelion股价制药和“Contrat d 'Investigation et de矫揉造作的倩碧”(05066年保监会)的援助Publique-Hopitaux巴黎。BT收到财务的支持方向Regionale de l 'Action防疫线等Sociale (DRASS) d的法国。其特定的收件人赠款Avenir Mutualiste des职业自由和独立,ASF和Actelion股价制药。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准伦理批准获得医院伦理委员会的La - salpetriere组。
病人的同意获得的。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。