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摘要
摘要目的:新月体肾炎（crGN）是抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎的常见和危及生命的表现。促炎细胞因子的上调通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）导致肾损害然而，目前尚不清楚四种p38MAPK亚型中的哪一种在crGN中表达、激活并因此具有重要意义。
方法：免疫组织化学检测抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的crGN患者和对照组肾脏活检中p38MAPK亚型和下游靶激酶MAPKAP2的表达和磷酸化情况。通过逆转录-聚合酶链反应、免疫印迹和激酶阵列检测TNF对人足细胞p38MAPK亚型的表达和功能激活。
结果:在肾小球足细胞和新月体中发现p38MAPKα、β和γ亚型的强表达。浸润性白细胞主要表达p38MAPKα。在肾小球足细胞、新月体和炎症浸润的crGN中发现p38MAPK及其下游介质MAPKAP2的激活。有趣的是，肾活检前的皮质类固醇治疗减少了crGN中p38MAPK的激活。激活的p38MAPK与足细胞和新月体中的α、β和γ亚型共定位，而白细胞主要显示p38MAPKα激活。在人足细胞系中，所有四种p38MAPK亚型的mRNA和蛋白质均表达，但只有p38MAPKα在TNF激发时被激活。
结论：本研究显示在crGN中有选择性的p38MAPK亚型表达和激活。足细胞和足细胞诱导的新月形成是crGN中p38MAPK激活的主要来源。TNF是足细胞中α-亚型的有效和选择性激活剂，因此是crGN肾小球中促炎信号的主要贡献者。
来自Altmetric.com的统计数据
新月体性肾小球肾炎(crGN)是抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎的严重并发症。1crGN的病理生理过程尚未完全阐明，尽管已知促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1参与其中，它们是由浸润的免疫细胞和驻留的肾细胞产生的。2这些介质的调节是令人感兴趣的，因为crGN的动物模型指出TNF和白细胞介素-1在促进肾损伤中的重要作用。在ANCA相关肾小球肾炎的大鼠模型中，TNF阻断抗体实际上消除了肾脏中的白细胞浸润、新月形形成和瘢痕形成。3.
p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是一种细胞内信号转导途径，将促炎刺激物传递到细胞核，主要参与促炎细胞因子的合成。4该通路的激活依赖于上游激酶的磷酸化，这反过来激活p38MAPK，允许快速诱导广泛的靶基因触发炎症反应。5因此，p38MAPK通路可能参与炎症（如crGN）期间的组织重塑。p38MAPK家族由四种亚型组成：p38MAPKα、β、γ和δ。6重要的是，所有四种亚型都通过下游激酶的磷酸化和激活对不同的炎症刺激作出反应。最近从类风湿关节炎患者炎症组织分析中获得的数据表明，p38MAPK亚型表达和激活在慢性炎症疾病中显示出非常独特的模式。7
目前尚不清楚p38MAPK激活模式与crGN中亚型表达、激活和定位的关系。89由于p38MAPK成员调控广泛的细胞过程，对p38MAPK亚型的更选择性抑制可以提高疗效，同时避免不可接受的毒性问题，这阻碍了目前可用的非选择性p38MAPK抑制剂在人类的临床应用。因此，我们分析了在anca相关性肾小球肾炎患者和健康肾供体中p38MAPK亚型表达和激活。
患者和方法
肾活检样本
在维也纳大学医学院常规诊断服务处理后获得肾活检标本。包括十三例以ANCA相关系统性血管炎为基础的CRGN患者。临床参数是从进行肾活检的医疗部门收集的。如HCs，肾活检FRO。m六名活体肾脏捐赠者，在移植后立即进行常规诊断。当地伦理委员会批准了所有程序。
免疫组织化学
所使用的针对p38MAPK亚型、MAPKAP-2和MKK3/6的抗体在支持材料中有详细说明。制作肾活检组织石蜡包埋标本的连续切片(2 μm)。添加10%山羊血清或10%兔血清可阻断非特异性结合。经蛋白酶VI型(p38α和β)、热(p38γ、p-p38、p-MAPKAP-2)或不经预处理(p38δ)后，应用一抗或一种不相干的同型和浓度匹配抗体。然后，切片用物种特异性生物素化免疫球蛋白(Vector, Burlingame, CA, USA)孵育，然后用vecastain ABC试剂(Vector)和3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)作为显色剂进行检测。在手术结束时进行苏木精复染。为了检测抗原表达，所有肾小球由经验丰富的肾病理学家(AS)盲法评分，评分范围从0到3(0 =未染色，1 = <20%抗原表达细胞，2 = 20-50%抗原表达细胞，3 = >50%抗原表达细胞)。
双免疫组织化学
双重标签方案是以单一标签程序为基础的。使用上述抗体对p38MAPK亚型进行染色。结合是由物种特异性生物素标记的结合物和Vectastain ABC和DAB显示的。随后，磷酸化的p38MAPK用磷酸化特异性单克隆抗体(Cell Signaling, Frankfurt, Germany)、生物素标记结合物、Vectastain ABC试剂和HistoGreen (Linaris, Wertheim, Germany)进行标记。再次用苏木精进行反染色。
人足细胞培养
分化、生长停滞的足细胞来源于使用SV-40 T抗原的温度敏感突变体进行条件转化的细胞系，如前所述。10此外，这些细胞已经被稳定地转染了人类端粒酶基因的催化亚基。详细信息在辅助材料中给出。
p38MAPK亚型的定量聚合酶链反应
从细胞培养中分离RNA，进行实时定量逆转录聚合酶链反应。详细资料和引物序列发表在支持材料中。
西方墨点法
为了分析p38MAPK亚型在足细胞中的表达，收集细胞，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并在硝化纤维素膜上印迹。用10× tri -buffered saline (0.1% Tween 20和5% milk)阻断非特异性结合后，以抗p38mapk α(1:300)、抗p38mapk β(1:100)、抗p38mapk γ(1:300)、抗p38mapk δ(1:300)和抗肌动蛋白(1:300)作为一抗，然后加入辣根过氧化物酶结合的二抗(1:2000)，并用化学发光检测系统进行可视化(Pierce, Rockford, IL, USA)。
为了分析TNF诱导的p38MAPK磷酸化，分化的足细胞饥饿12小时，然后用10 ng/ml人TNF刺激(R&D Systems, Minneapolis, MA, USA)。蛋白样本用针对p38MAPK、MKK3/6和mapk2的磷酸化特异性抗体染色，并归一化至p38MAPK总蛋白表达。为了确定TNF刺激下的p38MAPK亚型磷酸化，根据制造商的说明，使用人Phospho-MAPK阵列试剂盒(R&D Systems)分析蛋白样品。
统计分析
由于数据是非参数的，所有的值都以中位数和四分位数范围给出。组均值比较采用非参数Mann-Whitney U检验。
结果
病人的特点
13例诊断为Wegener肉芽肿病(n = 10)或显微镜下多血管炎(n = 3)的患者纳入本研究，采用的标准来自于Chapel Hill共识会议的疾病定义。此外，所有韦格纳肉芽肿病患者也符合美国风湿病学会1990年分类标准。除1例患者外，所有患者在首次发病时均行肾活检;由于显微镜下多血管炎复发，其余患者接受了第二次随访活检。大多数患者急性期反应物水平高(中位c反应蛋白水平7.1 mg/dl，范围1.7-9.9)，只有3例患者在肾活检时接受了类固醇治疗，而其他10例患者根本没有接受免疫抑制治疗。Wegener肉芽肿病患者均有抗蛋白酶3 (PR3-ANCA)的抗体，镜下多血管炎患者均有抗髓过氧化物酶anca的抗体。所有患者均有活动性肾小球肾炎的尿征，13例患者中12例有显著的蛋白尿(中位蛋白尿1.3 g/24小时，范围0.9-2.0)，除1例患者外，所有患者肌酐清除率降低(中位:16 ml/min，范围7-59)。
足细胞和肾小球新月是抗中性粒细胞胞浆抗体相关的新月体性肾小球肾炎中p38MAPK表达的主要来源
我们首先通过免疫组化方法评估了健康肾供体和crGN患者肾活检中肾小球p38MAPK亚型表达。如前所述，p38MAPK亚型特异性抗体的单特异性被确定7．在健康和病变肾脏中，肾小球足细胞是p38MAPK表达的主要来源。因此，健康和病变肾脏的足细胞均强烈表达p38MAPKα、β和γ，而不表达p38MAPKδ。
在健康肾和肾小球肾中，肾小球上皮细胞仅弱表达p38MAPKα和p38MAPKβ。相比之下，在健康而非病变的肾脏活检中，p38MAPKγ表达在肾小球上皮细胞中显示出显著的染色(p<0.05)。同样，p38MAPKδ在肾小球上皮细胞中表达缺失，而p38MAPK亚型和p38MAPKβ在小动脉血管平滑肌细胞中表达。在crGN活检中，浸润的中性粒细胞中也观察到p38MAPKδ的模糊染色。此外，在健康和病变肾脏的血管内皮细胞中均观察到p38MAPKγ表达强烈，而p38MAPKα和β仅在该部位表达弱。
当我们选择性分析p38MAPK亚型在肾小球新月形和肾小球炎症浸润中的表达时，我们发现p38MAPKα、β和γ亚型在肾小球新月形中表达强烈。相比之下，浸润炎性白细胞的p38MAPK表达较窄，仅显示p38MAPKα亚型的表达。免疫组化染色及结果有代表性图1，p38MAPK亚型表达谱的摘要如所示表1．
p38MAPK和MAPKAP-2在抗中性粒细胞胞浆抗体相关的肾小球肾炎中被激活
我们接下来评估了相同患者肾组织中p38MAPK及其主要下游靶点MAPKAP-2的激活情况。在crGN患者的肾小球足细胞中存在p38MAPK激活，而在HCs足细胞中仅发现p38MAPK微弱且不频繁的激活（HCs的中位数为0.5（0-1）vs.crGN 2（1-2）；p<0.05）。此外，肾小球新月体（crGN中位数1.5（1.5-2））和炎症浸润（crGN中位数2（1.5-3））是p38MAPK激活的主要来源。相反，肾小球上皮细胞在健康和病变肾脏中仅显示少量p38MAPK激活。在肾小球外，我们观察到crGN患者近端和远端小管中p38MAPK的强烈激活，而HCs的远端小管中也观察到p38MAPK的激活，但近端小管中没有。
对于下游靶点MAPKAP-2，观察到类似的情况，足细胞、肾小球新月和炎症浸润强烈激活，但hc没有。同样，健康和病变肾脏的远端小管均被激活，而近端小管仅在crGN中显示MAPKAP-2激活。有代表性的图片和量化结果显示在图2．
在新月体性肾小球肾炎中，免疫抑制治疗与p38MAPK活化降低相关
由于p38MAPK激活有助于促炎性细胞因子分泌，并可能导致ANCA相关crGN患者的炎症活动，我们假设免疫抑制治疗可下调p38MAPK激活(图3)因此，我们比较了未治疗患者和皮质类固醇治疗患者的肾活检，发现治疗前患者所有研究肾区p38MAPK的激活状态均明显减弱。有趣的是，虽然未经治疗的患者存在炎症浸润，并显示p38MAPK激活，但皮质类固醇治疗的患者几乎没有炎症浸润。最后，在肾小管p38MAPK激活方面可以观察到类似的模式：皮质类固醇治疗导致皮质类固醇治疗患者的近端和远端肾小管p38MAPK激活强烈下调。
磷酸化p38MAPK的双重标记显示在新月体肾小球肾炎中p38MAPKα， β和γ亚型的原位激活
接下来，我们通过选择性研究p38MAPK亚型的激活，探讨了肾小球中表达的三种p38MAPK亚型中的哪一种在体内受到激活。因此，我们对p38MAPK亚型和磷酸化p38MAPK进行了双重免疫组化研究，以探讨三种肾小球表达的p38MAPK亚型α、β和γ的激活状态。如中所示图4，我们发现在60%以上的同型阳性肾小球细胞中，p38MAPKα和β与磷酸化的p38MAPK共定位。p38MAPKγ与磷酸化的p38MAPK共定位频率较低(<40%)。特别是p38MAPKα、β和γ在肾小球月牙状细胞中被激活，而浸润的白细胞主要被p38MAPKα激活。这些发现表明p38MAPKα和β以及较小程度上的p38MAPKγ在anca相关的crGN中被激活，在活跃的组织重塑位点。
人足细胞中p38MAPK亚型的表达和激活
如中所示图5A和B通过定量逆转录-聚合酶链反应和Western blotting检测，四种p38MAPK亚型均在增殖和分化的足细胞中表达，p38MAPKα、γ和δ水平相当，但p38MAPKβ显著降低。与肾脏活检的结果相反，我们也发现p38MAPKδ在培养的足细胞中表达。在用人TNF刺激分化的足细胞后，我们观察到p38MAPK在15分钟后迅速磷酸化(图5度)．此外，上游激酶MKK3、6和下游激酶mapk2在TNF作用下被磷酸化。使用亚型和磷酸化特异性抗体，我们可以在15分钟内显示由TNF刺激的分化足细胞中p38MAPKα的磷酸化。相反，p38MAPKγ和δ仅被TNF微弱激活，而p38MAPKβ在受刺激的足细胞中完全没有磷酸化(图5 d)．因此，TNF诱导人体内p38MAPKα活化，提示体内anca相关血管炎患者肾小球中p38MAPK的活化是基于炎症细胞因子环境。
讨论
在这项研究中，我们研究了p38MAPK亚型在系统性人类自身免疫性疾病中的表达和激活。Pauci-immune crGN是anca相关系统性血管炎的一种严重器官表现，伴有快速肾小球免疫细胞浸润，细胞新月形形成，最终导致终末期肾病。病理生理学上，免疫细胞和常驻肾细胞之间复杂的相互作用与促炎和增殖诱导转录机制的激活被假设。p38MAPK是炎症和增殖刺激的重要信号通路，因此被认为是肾脏炎症的一个有趣靶点。为了阐明其在crGN中的作用，我们对患者受影响组织中的p38MAPK亚型定位和磷酸化进行了分析。
通过p38MAPK抑制治疗免疫不足的crGN似乎是一个有效的选择，原因有以下几个:(a)在crGN中的人类和动物研究始终显示肾实质和浸润细胞中p38MAPK激活，并与肾损伤呈正相关;9（b） 促炎细胞因子如TNF-α和白细胞介素-1是p38MAPK的强激活剂，在crGN中高表达；1112（c） 在大多数crGN动物模型中，包括抗肾小球基底膜肾炎和肾毒性肾炎，p38MAPK抑制剂通过减少肾小球浸润和增殖显示出有益的作用。1314(d)目前，口服p38MAPK抑制剂已进入各种炎症性疾病的早期临床试验，包括类风湿关节炎和克罗恩病，具有良好的抗炎潜力。1516然而，一些问题出现在p38MAPK抑制作为实现疾病改善的目标:哪四种亚型表达和激活，以及这些亚型在目标组织的生理情况下的作用?
我们发现，p38MAPKα、β、γ和δ蛋白在hc和crGN患者的肾组织中表达(表1)．在差异表达方面，我们发现足细胞是肾小球中p38MAPK表达的主要细胞来源，在健康肾脏中表达p38MAPKα、β和γ，但不表达δ亚型。这些异构体也在体外培养的人足细胞中表达。在肾小球外，p38MAPKγ在内皮细胞表达较强，p38MAPKδ在血管平滑肌细胞表达较强。血管平滑肌细胞p38MAPKα和β表达较弱。当我们分析crGN患者时，我们发现p38MAPKα、β和γ在肾小球新月形中强烈表达，这归因于足细胞在新月形形成中的作用，而浸润性白细胞主要表达p38MAPKα。
虽然p38MAPK的表达是细胞适当使用该信号通路的先决条件，但下游靶点的功能性激活依赖于p38MAPK的磷酸化。既往研究报道crGN中肾小球p38MAPK磷酸化与肾损害和蛋白尿显著相关。9然而，哪些p38MAPK亚型在crGN中被激活尚不清楚。我们的研究结果表明，与健康肾脏相比，crGN伴随肾小球足细胞、细胞新月形细胞和白细胞中p38MAPK的深度激活。此外，p38MAPK的下游激酶MAPKAP-2也有类似的表达和激活模式，表明在crGN中p38MAPK信号通路具有功能。在差异激活方面，我们观察到p38MAPKα、β和γ在细胞新月体和肾小球足细胞中的激活，其中α和β亚型显示最强的激活。然而，在浸润性白细胞中，单核细胞中p38MAPKα几乎被选择性激活，而中性粒细胞中p38MAPKα和δ仅被少量激活(图6)。尽管C-ANCA和P-ANCA相关性肾小球肾炎在急性和慢性肾小球肾炎方面表现出不同的组织病理学，17我们没有发现p38MAPK在这两个亚组中的表达和激活模式不同(数据未显示)。然而，P-ANCA患者组太小，无法恰当地解决这个问题。
p38MAPKα在肾小球浸润中的这一关键作用与处理p38MAPK亚型差异效应的其他发现一致：（a）对培养足细胞的功能测试表明，crGN中肾损伤的相关致病介质优先磷酸化α亚型。因此，与其他亚型相比，TNF强烈激活人类足细胞中的p38MAPKα。此外，先前的研究表明促炎细胞因子也主要激活p38MAPKα在体外的巨噬细胞和中性粒细胞中。18(b)在crGN相同肾小球结构的下游靶点MAPKAP-2的体内激活，支持α亚型在肾小球应激反应中的重要作用，因为MAPKAP-2仅是α和β亚型的靶点，而不是其他p38MAPK亚型的靶点。(c)目前可用的在实验crGN中成功使用的p38MAPK抑制剂都是p38MAPKα和β的抑制剂，但不影响p38MAPKγ和δ活性。(d)与胚胎致死的p38MAPKα敲除小鼠相比，p38mapk β缺陷小鼠没有明显的表型，而且在体内发生tnf诱导的关节和肠道炎症时，在体外对脂多糖也敏感。19这些数据表明，p38MAPK激活不仅仅是一个“开关紧急开关”对环境压力的反应，而是这个压力响应系统被选择性异构体激活非常严格地调节，这取决于外源性触发器的性质以及靶细胞类型。
我们的研究结果和之前的研究表明，肾脏和免疫细胞中p38MAPK的活化被认为是crGN中重要的致病效应因子。事实上，肾小球足细胞作为肾小球新月形形成的介质最近引起了越来越多的关注，表明它们在crGN的进展中具有极其重要的作用。20- - - - - -22除了足细胞活化和增殖外，单核细胞和中性粒细胞的肾浸润被认为是crGN发生的重要步骤。在crGN的晚期病变中发现巨噬细胞，除足细胞外，还产生TNF和白细胞介素-1。23在我们的研究中，我们发现p38MAPK在白细胞、足细胞和新月体中的激活表明p38MAPK在crGN的所有步骤中都有相关作用。
由于TNF主要激活足细胞中的p38MAPKα， MAP激酶似乎是治疗crGN的一个有趣的靶点。这不仅与检测未来的p38MAPK小分子抑制剂在crGN中的疗效有关，也是目前有效的抗炎治疗方案(如糖皮质激素)的基础。与此同时，经糖皮质激素预处理的crGN患者肾小球中p38MAPK活化几乎被消除。总之，我们描述了crGN中p38MAPK激活的特定模式，足细胞和足细胞相关新月形细胞是p38MAPK激活的主要来源。
致谢
我们感谢Birgit Tuerk和Cornelia Stoll出色的技术支持，以及Dontscho Kerjaschki教授提供的人类足细胞细胞系。这项研究得到了奥地利科学基金(G. Schett)和血管炎基金会(J. Zwerina)的START奖的支持。
参考资料
补充材料
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只有网页附录67/5/602
本数据补充文件:
脚注
竞争利益：没有一个
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