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研究文章

健康幼猫呼吸道微生物群的动态变化及其与粪便和血液微生物群的关系

  • 阿依达I. Vientós-Plotts，

    从属关系美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院兽医学和外科学系，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室

    ⨯
  • 艾伦·c·爱立信，

    ericssona@missouri.edu(ACE);reineroc@missouri.edu(CRR)

    从属关系美利坚合众国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美利坚合众国密苏里州哥伦比亚密苏里大学宏基因组学中心，美利坚合众国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院兽医病理生物学系

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  • Hansjorg Rindt,

    从属关系美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室

    ⨯
  • 梅根·e·格罗布曼，

    从属关系美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院兽医学和外科学系，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室

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  • 琥珀色的格雷厄姆,

    联系美国密苏里州哥伦比亚市密苏里大学兽医学院

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  • Kaitlin主教,

    联系美国密苏里州哥伦比亚市密苏里大学兽医学院

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  • 利亚·a·科恩，

    从属关系美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院兽医学和外科学系，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室

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  • 卡罗尔·r·雷纳罗

    ericssona@missouri.edu(ACE);reineroc@missouri.edu(CRR)

    从属关系美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学兽医学院兽医学和外科学系，美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室

    ⨯

摘要

宏基因组学领域使用不依赖培养的微生物鉴定方法取得的进展，已经可以表征健康人类、小鼠、狗、羊和猪肺部丰富多样的细菌群落。这些数据挑战了长期以来的信念，即肺是无菌的，微生物定植等同于病理。对人类和动物的研究表明，健康与疾病时气道微生物群的组成存在差异，这表明发生了呼吸失调。通过对直肠和口咽拭子(OP)、支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中提取的DNA进行16S rRNA扩增测序，我们的目的是表征健康猫的粪便、OP、血液和下气道微生物群随时间的变化。健康猫的呼吸微生物群尚未被表征，这项工作为未来的猫哮喘研究奠定了基础，在这些研究中，猫可以作为人类的比较和转化模型。分别于第0天、第2周和第10周从6只健康的研究猫身上收集粪便、OP和BALF样本;第10周采血。提取DNA, PCR扩增，Illumina MiSeq平台测序。鉴定了具有代表性的操作分类单位(OTUs)，并评估了微生物的丰富度和多样性。主成分分析(PCA)用于显示样品的相关性，PERMANOVA用于检测微生物群落组成的显著差异。 Fecal and OP swabs provided abundant DNA yielding a mean±SEM of 65,653±6,145 and 20,6323±4,360 sequences per sample, respectively while BALF and blood samples had lower coverage (1,489±430 and 269±18 sequences per sample, respectively). Oropharyngeal and fecal swabs were significantly richer than BALF (mean number OTUs 93, 88 and 36, respectively;p< 0.001)，差异无统计学意义(p= 0.180)。主成分分析显示粪便、上呼吸道和下呼吸道中存在特定部位的微生物群落。相比之下，血液与BALF在一些优势类群上有明显的相似性，但与粪便有更多的OTUs共享。样本在时间上的聚类多于在个体上的聚类，OP拭子在主观上比其他样本有更大的变异。综上所述，健康的猫具有丰富而独特的下气道微生物群，具有动态的细菌种群。微生物群可能会因年龄、环境影响和疾病状态等因素而改变。需要进一步的数据来确定来自上下呼吸道、粪便和血液的不同猫科微生物群是如何建立和进化的。这些数据可用于健康猫和患有呼吸道疾病的猫之间的比较。

引用:Vientós-Plotts AI, Ericsson AC, Rindt H, Grobman ME, Graham A, Bishop K，等。(2017)健康幼猫呼吸道微生物群的动态变化及其与粪便和血液微生物群的关系。PLoS ONE 12(3): e0173818。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818

编辑器:Brenda A. Wilson，伊利诺伊大学香槟分校，美国

收到:2016年11月22日;接受:2017年2月27日;发表:2017年3月9日

版权:©2017 Vientós-Plotts等。这是一篇开放获取的文章188滚球软件，根据创作共用署名许可协议它允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是要注明原作者和出处。

数据可用性:所有序列数据已存放在NCBI短读档案(SRA)中，登录号为[SRA: PRJNA350163]。

资助:作者在这项工作中没有得到具体的资助。

利益冲突:作者宣称不存在竞争利益。

缩写:支气管肺泡灌洗液;OP,口咽;OTU，业务分类单位;主成分分析

简介

人类微生物组项目通过使用基于dna的测序来表征常驻细菌种群，为研究位点特异性微生物群落提供了一个平台。到目前为止，胃肠道微生物群是研究最多的地方，这些研究继续为这些复杂的微生物群落对宿主健康和疾病的影响提供证据。早期对特定部位微生物群落的研究不包括呼吸道，因为人们认为人类肺部是无菌的，从下呼吸道分离出的生物表明疾病或上呼吸道的细菌易位。在不依赖培养的技术的帮助下，已证明健康的人类气道含有复杂的微生物群，有时被称为“核心气道微生物群”[1］．这些微生物群落的改变已被记录在人类各种炎症性气道疾病中，包括哮喘，慢性阻塞性肺病[2，3.]，以及囊性纤维化[4］．然而，目前尚不清楚这些微生物群落在宿主健康、预防或加剧疾病方面可能发挥什么作用。

大多数关于气道微生物群的研究都是在人类身上进行的，而关于与我们共享环境的伴侣动物气道微生物群组成的知识是有限的。炎症性气道疾病在狗和猫中很常见，尤其是两种动物的慢性支气管炎和猫的过敏性哮喘。最近的研究表明，健康的狗具有丰富而复杂的下气道微生物群，这与其他部位(包括上呼吸道和胃肠道)不同[5］．健康犬的这些数据对于了解微生物群落在传染性和非传染性炎症性犬呼吸道疾病中的作用至关重要。猫被认为是过敏性气道疾病的比较和转化模型，因为实验诱导和自发的猫哮喘与人类过敏性哮喘具有相似的特征[6，7］．在人类中，健康气道和哮喘气道之间的微生物组成存在差异[8- - - - - -10］．迄今为止，记录健康气道微生物群的存在和特征的研究尚未在猫中发表。

本研究的主要目的是记录健康猫体内呼吸道微生物群的存在和特征。作为次要目标，粪便和血液样本也被收集和分析，以调查在每个地点发现的微生物群落之间可能的相关性。据推测，气道微生物组的建立可能是微生物通过微吸、吸入细菌和直接粘膜分散而迁移的结果[11]，比较上下呼吸道和粪便微生物群提供了证据，尽管种群之间有重叠，但每个位点都是不同的。就像肺一样，直到最近，血液也被认为是无菌环境，然而，它也被证明具有微生物群[12］．此外，据推测，血液微生物组可能是肠道生态失调和糖尿病等其他疾病之间的联系[13]、心血管疾病[14]、肝纤维化[15]，以及其他炎症性疾病[16］．通过包括血液样本，我们能够表征健康猫体内存在的循环微生物DNA，这可能为未来研究评估人类和兽医患者的健康和疾病中血液和呼吸道微生物群之间的潜在相关性提供试点数据。

材料与方法

道德声明

所有研究均按照《实验动物使用和护理指南》进行，并得到密苏里大学机构动物护理和使用委员会(MU IACUC议定书#7891)的批准。

猫

猫是在一个群体(密苏里州哥伦比亚密苏里大学比较内科实验室)中饲养的，所有猫都是性完整的，年龄小于1岁(研究结束时为25-35周)。猫属于两窝中的一窝:A窝由3只母猫组成，B窝由2只公猫和1只母猫组成。在研究开始时，A窝和B窝的猫分别是24周龄和14周龄。猫被按性别分组，2只公猫和4只母猫被安置在独立的大型奔跑中，有可攀爬的高架平台，悬挂的吊床和各种丰富的玩具。猫被研究团队的成员社会化。平均体重(±标准差)为3.0±1.3 kg。猫在4周大时过渡到为生长而配制的商业干性饮食(Purina生长配方，圣路易斯，密苏里州)，并在研究期间保持这种饮食。提供了食物和清洁饮用水随意．在麻醉采集样本之前，猫被禁食至少12小时，以尽量减少误吸的可能性。经委员会认证的兽医内科专家进行了正常的身体检查，并且从支气管肺泡灌洗液(BALF)样本中缺乏感染或炎症的细胞学证据，因此确定猫是健康的。安乐死并不是这项研究的终点;所有的猫随后都被收养到私人家庭。

样品收集

在研究开始(第0天)、第2周和第10周收集粪便拭子、口咽拭子(OP)和BALF。第10周采集血液。用4 mg/kg氯胺酮静脉麻醉猫。在麻醉诱导后插管前，将无菌棉签插入直肠至少4厘米处以获得粪便样本，同时避免与肛周区域接触。第二根湿润无菌拭子用力摩擦口咽尾背侧，手动张开嘴，舌头向前拉，同时避免与口腔接触。口咽拭子和直肠拭子分别加入5ml无菌生理盐水中，放在冰上，以便运送到实验室。猫插管使用无菌3.5至4法国气管插管。为了收集BALF，无菌的8法国红橡胶导管穿过无菌气管内管，直到轻轻插入下气道。注入20毫升无菌生理盐水，抽吸，置于冰上。通过颈静脉穿刺(局部剃毛，用乙醇制备)获得四毫升全血，放入含有抗凝剂EDTA的无菌管中。

收集后立即将粪便、OP、BALF和血液样本离心成颗粒状细菌细胞。丢弃上清液，将微球重悬于Yu等人配制的800 μL裂解缓冲液中(4%十二烷基硫酸钠、50 mM EDTA、500 mM NaCl和50 mM Tris-HCl pH 8.0) [17］．所有样本都保存在-80°C下，直到研究结束，DNA作为单批次提取。

DNA提取

从粪便、OP和BALF中提取DNA，使用珠子敲打加柱法，如前所述[5］．从4 mL抗凝全血中分离血液DNA。加入40 mL低渗ACK缓冲液(150 mM NH)裂解细胞4氯，10毫米KHCO3.， 1 mM EDTA pH 7.2)，在室温下孵育10分钟。样品在室温下离心20分钟，浓度为2500 ×g。重复1次，弃上清，加入2 mL裂解缓冲液(500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 4% SDS)和0.1 mg/mL蛋白酶K。样品在60°C下孵育3小时，然后进行有机溶剂萃取。DNA用0.1 mg/mL RNase A在37℃孵育30 min后，用乙醇沉淀，再悬浮于0.5mL TE (10 mM Tris-HCl pH 8.2, 1 mM EDTA)中，样品保存于-20℃，直到PCR和测序。

16S rRNA文库制备、测序和信息学

如前所述，在密苏里大学DNA核心设施完成了文库建设和测序[5］．DNA序列的组装、过滤、分箱和注释在MU信息学研究核心设施进行，如前所述[5]除了1/4根转换数据的主成分分析是使用Past 3.13 (www.folk.uio.no ohammer /历史/)．

统计snalysis

使用Sigma Plot 12.3 (Systat Software Inc.， Carlsbad, CA)进行统计分析。样本采集点之间在DNA产量、覆盖率、丰富度和相对丰度方面的差异采用重复测量方差分析，并通过Tukey检验进行事后比较。通过PERMANOVA，使用Past 3.13进行测试，以确定样品位点之间的β-多样性差异。结果被认为有统计学意义p取值≤0.05。

结果

下气道和血液代表生物量低于粪便和上呼吸道的部位

采用宽范围dsDNA试剂盒进行荧光测量，结果显示不同部位的DNA产率差异很大:粪便样本(平均±SEM为2.05±0.48 ng/μL)、OP拭子(0.63±0.45 ng/μL)、BALF(15.31±3.61 ng/μL)和血液(52.06±12.27 ng/μL)。18份粪便样本中有3份，18份口咽样本中有6份低于检测限度。低于检出限的样品不排除进一步分析。为了使模板加载量最大化，所有样品都被浓缩到PCR所需的最小体积。

在扩增和测序后，检测到的高质量序列的总数(即覆盖率)因部位而异，粪便样本其次是OP样本，每个样本的序列数量最多(平均值±SEM分别为65,653±6,145和20,633±4,360)。正如预期的那样，与直肠拭子和OP拭子相比，BALF和血液的覆盖率显著降低(分别为1489±430和269±18)(图1)．

缩略图
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图1所示。从6只健康幼猫的支气管肺泡灌洗液(BALF)、口咽拭子(OP)、粪便拭子和血液样本中提取的DNA中检测到的平均(SEM)覆盖(每个样本的序列数)的均值±标准误差。

类似字母表示重要(p< 0.05)差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g001

对于所有样品，即使生物量较低，DNA产量低于检测极限，也能获得一致和可解释的数据。

直肠拭子和OP拭子丰富度高于BALF和血液;操作分类单元(OTUs，至少97%核苷酸相同的序列组)的平均数量分别为88、93、36和15个(图2)．这并不意外，因为下呼吸道和血液的DNA产量较低，这与生物量较低的地点一致。丰富度的动态变化因场地而异。在粪便中，各时间点间丰富度无显著差异。在OP样本中，从第6周到第10周，丰富度显著增加(平均OTUs分别为79和105;p= 0.012)。相反，在BALF中，从第2周到第10周，丰富度显著降低(分别为41和27;p= 0.043)。

缩略图
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图2所示。均数±标准误差的平均(SEM)丰富度(在同一样品中检测到的唯一操作分类单元(OTUs)的数量。

类似字母表示重要(p< 0.05)差异。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g002

变形菌门支配健康猫科动物的气道

粪便和气道样本的微生物种群在分类水平上有明显的差异。图3)．与之前关于狗的报道一致[5]和人类[18]，但与之前关于猫的报道相比[19]直肠拭子检出的优势菌门为拟杆菌门(平均±SEM相对丰度33.26±3.11%)，厚壁菌门(31.55±4.21%)，变形菌门(21.70±3.11%)Fusobacteria(11.68±2.40%)。变形菌门上、下气道门含量最高(OP为60.00±3.23%，BALF为62.36±6.72%)。类似于直肠拭子，与之前的人类报告相反[12］拟杆菌门(67.60±1.36%)变形菌门(22.26±0.56%)，为血标本的优势门。

缩略图
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图3所示。在第0天、第2周和第10周采集的粪便、口咽拭子(OP)、支气管肺泡灌洗液(BAL)和血液中检测到所有类群的相对丰度，标记为门的分类水平。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g003

从第0天到第10周，相对丰度有显著增加拟杆菌门粪便中(18.8±4.33% ~ 33.05±3.46%;pOP(17.6±2.63% ~ 31.19±2.2%;pBALF(14.41±6.35% ~ 55.01±4.94%;p< 0.001)。相比之下，的相对丰度显著下降变形菌门术前0 ~ 10周(74.28±3.15% ~ 54.78±2.89%;pBALF(81.65±6.63% ~ 27.26±1.33%;p< 0.001)。门的相对丰度厚壁菌门而且Fusobacteria并没有随时间发生显著变化。

解析到科的分类学层面(图4)，不同部位微生物组成的差异尤其突出，尤其是在比较直肠拭子与气道样本时。的门拟杆菌门在粪便、OP拭子和血液样本中检测到相对于BALF的相对丰度更高，但它包含不同的细菌家族和OTUs。在直肠拭子中，门拟杆菌门主要由生物组成类杆菌家族(30.12±3.60%)。在OP拭子中，该门以Porphyromonadaceae而且Paraprevotellaceae家族(分别为12.45±1.29%和5.46±0.87%)。虽然是微生物门拟杆菌门与BALF相比，在血液中存在的比例要高得多，该门中的大多数微生物属于该家族Sphingobacteriaceae(血液和BALF分别为64.24±2.38%和22.56±5.08%)。

缩略图
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图4所示。在第0天、第2周和第10周采集的粪便、口咽拭子(OP)、支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中检测到所有类群的相对丰度，标记为科的分类水平。

右边显示的是显性OTUs的身份。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g004

门中的微生物厚壁菌门由家属代表吗Tissierellaceae而且Lachnospiraceae(10.31±3.87%、10.00±1.87%)Fusobacteria被家族所控制Fusobacteriaceae(11.68±2.40%)。这些家族主要存在于粪便样本中，在其他样本点检测到的丰度相对较低。变形菌门在粪便和血液样本中检测到的频率相似;然而，DNA被标记为不同的家族。在直肠拭子中，主要以家庭为代表Campylobacteraceae而且肠杆菌科(8.87±3.32%，7.09±1.57%)，其他样地均为罕见。在血液样本中，Bradyrhizobiaceae(19.71±2.30%)是该门中数量最多的科，在粪便和OP样本中很少发现。气道主要由变形菌门,巴斯德氏菌科，Moraxellaceae,假单胞菌科OP样本中数量最多(分别为15.99±1.93%、14.79±1.73%和10.21±3.69%)。假单胞菌科而且BradyrhizobiaceaeBALF样本中，家族数最多(分别为34.24±7.16%和15.83±2.18%)。所有在至少一个样点检测到的平均相对丰度大于0.50%的类群均列于表1．

缩略图
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表1。在至少一个样本部位(粪便、口咽拭子(OP)、支气管肺泡灌洗液(BAL)或血液)检测到的所有类群的相对丰度大于平均相对丰度0.50%，并标注为门、科和操作分类单位(OTU)水平。

数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.t001

健康的气道在门内关键家族的相对丰度上有动态变化变形菌门而且拟杆菌门

在研究期间，粪便微生物群相对稳定。微生物家族相对丰度的唯一显著变化是Paraprevotellaceae，假单胞菌科,Alcaligenaceae这些人口从未超过总人口的2.5%。在OP样本中，随时间的变化包括相对丰度的降低假单胞菌科0 ~ 10周(30.57±3.84% ~ 0.05±0.01%;p< 0.001)以及家庭成员相对数量的增加Moraxellaceae0 ~ 10周(11.15±2.4% ~ 22.34±1.80%;p= 0.008)。在第2周至第10周期间，下气道微生物群发生了显著变化，其中微生物的相对丰度显著降低假单胞菌科(52.64±10% ~ 0.08±0.01%;p= 0.005)的相对丰度同时增加Sphingobacteriaceae(从7.5±3.19%到47.2±5.4%;p< 0.001)。

各样点检测到的微生物群落多样性差异显著

主成分分析(PCA)用于评价各部位细菌种群的β多样性。当将所有地点的样本纳入分析时，占样本变异33.51%的主成分1 (PC1)显示粪便和OP微生物种群与BALF和血液完全分离(图5)．有趣的是，血液和BALF样本在前两个主要成分上紧密聚集在一起，反映了堆叠柱状图中所见的相似性。通过PERMANOVA测试样本点和时间点之间的群落结构差异。最初进行双向PERMANOVA以确定由于固定变量而导致的主要效应的存在或强度;样本地点和采集日期均有显著差异(p= 0.0001;F = 32.26和9.62)。此外，在变量(p= 0.0088;F = -0.23)。为了处理这些交互并提供成对比较，执行了单向的PERMANOVA。首先考虑采样点内和时间点间的差异，各时间点OP拭子差异最大，粪便样本差异最小。具体而言，在任何给定的采集时间，OP拭子与其他两次采集有显著差异，F值在2.20至10.58之间)(表2)．相反，粪便样本的成分仅在第0天和第10周样本之间存在差异，且差异的强度较低(p= 0.04;F = 2.03)。根据堆叠柱状图(图4)，第10周BALF样本与前两个样本有显著差异，但第0天与第2周无差异。考虑到样本点之间的差异，无论何时收集样本，所有样本点之间的两两比较都检测到显著差异。这些数据表明，在每个样本部位检测到的微生物群落有显著差异，并且随着时间的推移，气道微生物群落可能比粪便微生物群落更具活力。此外，应该指出的是，虽然在血液样本中检测到的少量DNA在组成上与在最终的BALF样本中检测到的DNA非常相似，但统计分析发现了这两个位点之间的差异。对每个部位至少一个样本中发现的OTUs进行主观比较，进一步证明了血液中检测到的细菌与呼吸道和粪便样本之间的关系(图6)．具体来说，在血液中检测到的所有OTUs也在至少一个粪便样本中检测到。

缩略图
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图5所示。主成分分析显示β多样性。

对来自所有四个样本部位(粪便、BALF、OP和血液)的样品进行无加权主成分分析PC1与PC2;右边是传说。椭圆表示95%的区间。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g005

缩略图
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图6所示。维恩图显示了健康猫(n = 6)在三个时间点之一的至少一个支气管肺泡灌洗(BALF)、口咽拭子(OP)或粪便拭子中检测到的操作分类单位(OTUs)的分布。

红色的数字表示在血液中检测到的该组OTUs的数量。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.g006

缩略图
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表2。来自健康成年猫(n = 6)的支气管肺泡灌洗样品(BALF)、口咽拭子(OP)、直肠拭子(粪便)和第0天(D0)、第2周(W2)或第10周(W10)采集的血液中检测到的微生物DNA的Bray-Curtis相似性指数的单因素PERMANOVA产生的p值(右上)和F值(左下)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0173818.t002

讨论

据作者所知，目前的数据提供了健康猫中丰富且动态的下呼吸道微生物群的第一个证据。以前，从健康猫气道中分离出少量细菌的标准培养技术导致人们猜测，在没有下气道炎症的情况下，猫体内的微生物种类有限，数量较少，这可能是因为口咽分泌物的吸入[20.，21］．在目前的研究中，胃肠道、上呼吸道(OP)和下呼吸道(BALF)都有独特的微生物群落，而血液样本中检测到的微生物OTUs与胃肠道中发现的微生物OTUs完全重叠。虽然BALF中约92%的OTUs存在于OP样本中，但存在一定程度的区域连续性(图6)，通过多样性指数评估的细菌群落表明BALF和OP种群完全分离，因此是不同的。这可能代表了对独特利基的适应。

身体的不同部位有不同的、动态的微生物群落。身体内的每个群落的结构因所处位置而异[22］．胃肠道是研究过的最复杂的生态系统之一，常驻生物提供了一种防御机制，防止病原微生物的定植，有助于营养代谢和免疫调节。反过来，胃肠道为常驻生物提供了一个稳定的、营养丰富的环境[23］．正是这种共生关系帮助健康个体维持体内平衡[24］．微生物群落中这种复杂平衡的改变可能是由多种因素引起的，包括环境影响、接触致病菌以及使用包括抗生素在内的药物。微生物群落成员相对丰度或多样性的异常改变，特别是那些对健康有有害影响的改变，被称为生态失调。导致生态失调的变化可能因生态系统而异。例如，在胃肠道中，生物多样性高与健康有关，据报道，生物多样性降低与疾病有关，而在阴道中则相反[25，26］．

在这一猫群中，直肠拭子检测到的优势门为拟杆菌门(平均±SEM相对丰度33.26±3.11%)，厚壁菌门(31.55±4.21%)，这与以往对健康猫的研究相反。在一份报告中[27]，大部份(87.3%)属门厚壁菌门而只有2.4%属于拟杆菌门。另一项研究[28报告说厚壁菌门是猫中数量最多的门(92%)，只有0.45%的OTUs属于门拟杆菌门．这两项研究都从生活在不同环境、饮食多样、年龄跨度大的异质宠物猫中采样。因此，这种差异可能是由于种群的差异，本研究的种群由年龄范围相似、环境和饮食稳定的猫组成。另一点需要考虑的是一项研究[19]，评估了健康猫胃肠道的微生物多样性，发现大多数OTUs属于门拟杆菌门分别从回肠和结肠中分离出(分别为13%和50%)，其次是在直肠中分离出5%。因此，直肠拭子可能比排泄的排泄物更能代表结肠中的微生物群。

人类下气道微生物群的存在和特征最近才成为研究的焦点。在使用非培养技术之前，在下呼吸道中发现的微生物种群被认为与来自上呼吸道的疾病或污染有关。最近比较人类上气道和下气道微生物群的研究得出结论，在每个部位都存在不同的微生物群[29- - - - - -32］．气道初始定殖的基础尚不清楚，但潜在的来源包括子宫-胎盘环境;产妇产道;以及通过吸入和微吸引入的肠道、皮肤和其他环境生物[33］．即使生物量较低，肺微生物组也可促进健康状态，并容易受到外部因素的干扰，包括系统性(如抗生素)和吸入性(如香烟烟雾、污染物等)物质[31，34］．

在呼吸道，生态失调已在哮喘、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化中被描述，并在吸烟者和非吸烟者的比较中被注意到[10，29，35，36］．有益微生物的丧失、潜在有害或致病生物的扩大以及整体多样性的丧失都被认为是生态失调的促成因素[37］．对疾病中发生的核心微生物组变化的描述和理解导致了关于治疗干预的潜在机会的问题[38］．有必要进一步研究恢复“健康相关”微生物群落是否可以代表呼吸道疾病的另一种治疗方法。

健康气道微生物组的知识为确定与人类健康相关的猫科呼吸道疾病的生态失调状态奠定了基础。猫是唯一一种自然发展出与人类过敏性哮喘相似的嗜酸性气道炎症、气道高反应性和气道重塑相关病症的动物物种[7］．虽然存在一些差异，但人类和猫在解剖学、生理学和免疫学上有许多共同的特征。环境过敏原与猫和人的哮喘都有牵连。有了这些知识，一个由屋尘螨过敏原或百慕大草过敏原的猫的致敏和挑战以及哮喘表型发展组成的模型已被用于研究人类和猫的哮喘[39］．由于人类和宠物猫生活在共同的环境中，宠物猫容易患上类似的疾病，如哮喘，这使它们成为极好的临床前模型[7］．

在成年人中，在下气道中检测到的最丰富的门是拟杆菌门（普氏菌而且Porphyromonas spp)和厚壁菌门（韦永氏球菌属而且Streptococus spp);属于门的生物变形菌门（假单胞菌，不动杆菌)的数量较少[1，29，31，40，41］．尽管在整个研究期间，所有猫BALF样本中都发现了这些类群，但它们在门水平上的相对丰度存在显著差异。第0天和第2周的样本以变形菌门．然而，该门显著减少，同时增加拟杆菌门观察时间为第2 ~ 10周。这些变化可能与成熟有关。这项研究中的猫在研究结束时至少6个月大;这是猫性成熟的年龄。小鼠和人类新生儿呼吸微生物群门水平的相对丰度也有类似变化的报道[42，43］．一项针对儿童的纵向研究表明，在生命的头两年里，呼吸道微生物群落可能会向更像成年人的组成转变[44］．

目前的研究规模相对较小，样本是在10周内获得的，因此，气道微生物组可能仍在随着成熟而变化。样本量小无法提供足够的功率[45]以确定微生物群落组成随时间变化的重要性。然而，这项研究的目的是表征微生物的组成，而不是随着时间的推移进行比较。虽然灌洗的频率与猫的细胞数量或类型随时间的变化没有关联，[46但随着时间的推移，反复灌洗仍有可能影响微生物群落组成的变化。此外，饮食、水、空气质量和住房等环境因素也可能对气道细菌组成的改变产生影响。然而，由于猫是在一个受控的环境中，这些因素不太可能影响观察到的变化。

2001年首次在健康人群中记录到血液中存在细菌16S rRNA [16，47］．最近的一份报告描述，健康成年人的血液微生物组与胃肠道微生物组有显著不同，因为它主要由门的分类单元组成变形菌门用最小的分类群代表拟杆菌门而且厚壁菌门(12］．在我们的研究中，在血液中发现的所有OTUs也在粪便拭子中发现。虽然血液微生物组在健康和疾病中的作用仍有待确定，但有人假设它可能在肠-脑轴和肠-肺轴的发育中起重要作用[48- - - - - -51］．需要进一步的研究来更好地了解血液微生物组是否可以为全身性疾病的免疫调节、诊断或治疗干预提供手段。

结论

直到最近，呼吸道微生物学一直强调，从肺部培养的细菌是病原体，与疾病有关。这项研究首次记录了健康猫体内存在丰富多样的气道微生物群。细菌群落可能是动态的，这取决于个体的年龄和环境。宏基因组学的进步可以帮助描述在疾病中可能被破坏的动态呼吸生态系统，改变宿主和微生物群之间的稳态。更好地了解健康气道和炎症气道中微生物群落的差异，为未来的研究奠定了基础，以确定是否可以调节微生物群来减轻疾病和/或恢复免疫耐受。

致谢

作者希望感谢凯伦克利福德的帮助格式化图表。

作者的贡献

  1. 概念:ACE哭泣。
  2. 数据管理:AVP的王牌。
  3. 正式的分析:首席助理。
  4. 调查:Avp CRR Meg ag KB lac hr。
  5. 项目管理:副总CRR hr。
  6. 监督:哭泣。
  7. 可视化:首席助理。
  8. 写作-初稿:首席助理。
  9. 写作-审阅编辑:Avp ace CRR Meg lac hr。

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