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． 2022年3月3日;59(3):2101798。
doi: 10.1183/13993003.01798 -2021人。 2022年3月打印

吸烟者和COPD患者外周血中免疫细胞蛋白酶体的激活:对治疗的意义

Ilona E Kammerl1， 苏菲哈迪12， 克劳迪娅弯曲3.， 安德里亚Urmann1， 茱莉亚Peierl1， Yuqin王1， 奥利弗Vosyka1， 马里昂私生子14， 凯特琳Milger15， 尤尔根•贝赫15， 安德里亚·科赫16， Juliane Merl-Pham7， Stefanie M Hauck7， 查尔斯Pilette2， Holger舒尔茨3.， Silke Meiners8910
从属关系
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吸烟者和COPD患者外周血中免疫细胞蛋白酶体的激活:对治疗的意义

Ilona E Kammerlet al。 欧元呼吸． ．
免费PMC文章

摘要

背景:免疫细胞含有一种特殊类型的蛋白酶体，即。免疫蛋白酶体，细胞内蛋白质降解所需要的免疫蛋白酶体免疫蛋白酶体是免疫细胞分化、炎症激活和自身免疫的关键调节因子。吸烟和慢性阻塞性肺疾病(COPD)可改变外周免疫细胞的免疫蛋白酶体功能，从而影响免疫细胞反应。

方法:我们分析了从健康男性年轻吸烟者和严重慢性阻塞性肺病患者外周血单个核细胞(PBMCs)中蛋白酶体复合物的表达和活性，并将其与对照进行比较。

结果:通过定量逆转录pcr和质谱蛋白组学分析，慢性阻塞性肺病患者中蛋白酶体表达上调。用活性探针和天然凝胶分析量化蛋白酶体活性。我们观察到年轻男性吸烟者和重度COPD患者外周血细胞中免疫蛋白酶体的明显激活。原生凝胶分析和线性回归模型证实了20S蛋白酶体的活跃和组装水平升高，这与COPD患者肺功能参数降低显著相关。慢性阻塞性肺疾病患者的免疫蛋白酶体在PBMCs的炎性细胞因子刺激下明显激活在体外．抑制免疫蛋白酶体可减少copd来源的血液免疫细胞中促炎细胞因子的表达。

结论:鉴于慢性炎症信号的重要作用和自身免疫反应在慢性阻塞性肺疾病中的作用，免疫蛋白酶体的靶向治疗可能是慢性阻塞性肺疾病的一个新的治疗概念。

利益冲突陈述书

利益冲突:即Kammerl没有什么可透露的。利益冲突:s·哈代没什么可透露的。利益冲突:C. Flexeder没有什么可透露的。利益冲突:A. Urmann没有什么可透露的。利益冲突:J. Peierl没有什么可透露的。利益冲突:王颖没有什么可透露的。利益冲突:O. Vosyka没有什么要透露的。利益冲突:弗兰肯伯格先生没有什么可透露的。利益冲突:K. Milger报告了来自阿斯利康、柏林化学、葛兰素史克、诺华和赛诺菲的个人讲座费用，这些讲座都是在提交的作品之外进行的。利益冲突:J. Behr公司没有什么可透露的。 Conflict of interest: A. Koch has nothing to disclose. Conflict of interest: J. Merl-Pham has nothing to disclose. Conflict of interest: S.M. Hauck has nothing to disclose. Conflict of interest: C. Pilette has nothing to disclose. Conflict of interest: H. Schulz has nothing to disclose. Conflict of interest: S. Meiners has nothing to disclose.

数据

图1
图1
本研究中蛋白酶体复合物的分析综述。a) 26S蛋白酶体复合体由一个中心20S核心粒子和一个或两个19S调控粒子组成。20S颗粒由四个环组成，每个环有七个亚基，两个外部α-环和两个内部β-环，其中三个蛋白水解活性亚基存在:β1、β2和β5构成标准蛋白酶体;三种免疫亚单位LMP2、MECL-1和LMP7可以被诱导，如。干扰素(IFN)-γ，但在免疫细胞中高水平表达。b)用于区分免疫蛋白酶体和标准蛋白酶体的基因/蛋白质名称、酶活性和基于活性的探针(ABPs)的命名。
图2
图2
年轻健康吸烟者和非吸烟者外周血单个核细胞蛋白酶体活性谱分析a)基于活性探针(ABP)分析吸烟者(n=20)和非吸烟者(n= 18-19) PBMCs中的蛋白酶体活性，使用泛反应型MV151、β1和lmp2特异性LW124和β5和lmp7特异性MVB127 ABPs进行信号量化(标记强度)。所有样品在一个大凝胶上运行，以便直接比较信号。b)吸烟者(S) (n=20)和非吸烟者(NS) (n=19) PBMCs的原生蛋白裂解物的原生凝胶分析，用荧光活性测定蛋白酶体的凝乳胰蛋白酶样(CT-L)活性。随后使用针对20S催化核心α1-7亚基的抗体对原生凝胶进行免疫印迹，以量化蛋白酶体复合体的丰度。凝胶的密度分析表明其活性为相对信号强度。样品在四种不同的凝胶上运行，每个样品都归一化到对照的平均强度。具体活度定义为活度/丰度;具体来说，20S、26S的活性信号或两者的总和(总活性)除以用于免疫染色的密度信号，即。各自复杂的丰度。数据以中位数±四分位数表示;须表示范围。Mann-Whitney u检验:*:p<0.05;* *: p < 0.01。
图3
图3
健康对照组和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的蛋白酶体活性原生凝胶分析健康对照(Ctrl)受试者(n=15: n=9从不吸烟者，n=2前吸烟者和n=4现吸烟者)和COPD患者(n=12)的PBMC原生蛋白裂解物，荧光活性测定蛋白酶体的凝乳胰蛋白酶样活性，随后使用α1-7亚基抗体对原生凝胶进行免疫印迹检测蛋白酶体复合体的丰富度( 补充图S3a)．样品在四种不同的凝胶上运行，每个样品都归一化到对照的平均强度。凝胶的密度分析显示为归一化信号到控制的平均值。比活度以每丰度的活度比表示。统计分析:中位数±四分位数;须表示范围。Mann-Whitney u检验:*:p<0.05;* *: p < 0.01;* * *: p < 0.001。
图4
图4
健康对照组和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血单个核细胞(PBMCs)蛋白酶体表达谱分析a)对健康对照组(n= 21-22)和COPD患者(n= 27-29) PBMCs中α-亚基PSMA3、免疫蛋白酶体亚基PSMB8-10和19S亚基PSMC3和PSMD11进行逆转录pcr定量分析。RPL19和HPRT作为管家基因。折叠变化的控制显示。b)对COPD (C)患者(n=10)和对照组(Ctrl)受试者(n=10) PBMCs中总蛋白的质谱蛋白质组学分析，使用所有20S (PSMA和PSMB)和19S亚基(PSMC和PSMD)的热图。显著上调的亚基用红色标出，显著下调的亚基用蓝色标出。数据以中位数±四分位数表示;须表示范围。Mann-Whitney u检验:*:p<0.05;* *: p < 0.01。
图5
图5
蛋白酶体复合体与临床参数的相关性和线性回归分析。a)肺功能的Spearman相关性(1 s用力呼气量(FEV)1)/用力肺活量(FVC)1/FVC) % pred[26])与蛋白酶体复合参数活性、丰度和比活性(活性/丰度)有关。显著相关用蓝色(负相关)和红色(正相关)突出显示。b, c)蛋白酶体复合体分析的参数根据性别、年龄和体重指数(BMI)(模型2)、共病和颗粒细胞百分比(模型3)、淋巴细胞百分比(模型4)或每L血的白细胞数量(模型5)以及免疫抑制药物(模型6)进行调整。模型1显示了未调整的值。在计算回归系数β(95%置信区间)之前对数据进行标准化。显著回归估计用黑色表示，非显著回归估计用灰色表示。看到 补充表S4对应的值。
图6
图6
干扰素(IFN)-γ或脂多糖(LPS)治疗从健康对照和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者分离的外周血单个核细胞(PBMCs)时蛋白酶体活性的改变健康对照组(n= 6-14)和COPD患者(n= 6-10)的pbmc用a) 75 U·mL治疗−1IFN-γ或b) 1µg·mL−1LPS作用24小时。使用特定于各自活性的化学发光底物分析了蛋白酶体糜凝胰蛋白酶样蛋白(CT-L)、caspase样蛋白(C-L)和胰蛋白酶样蛋白(T-L)活性，并显示为各自未处理对照的折叠。c)测定健康对照组(n=9)和COPD患者(n=7)在免疫蛋白酶体抑制剂LU-005i(0.5µM, 2 h预处理)和LPS(1µg·mL预处理)PBMCs中细胞因子IL -1B、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA表达−1， 24小时)。RPL19和HPRT作为管家基因。对照组(Ctrl)和COPD组以及所有样品合并(Comb)的溶剂对照的折叠变化显示。a, b)数据以中位数±四分位数表示;须表示范围。单样本Wilcoxon检验:*:p<0.05;* *: p < 0.01。c)组内配对t检验:*:p<0.05。lps治疗组与COPD组差异Mann-Whitney u检验:# #: p < 0.01;# # #: p < 0.001。
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