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。 2021年7月1;58 (1):2002978。
doi: 10.1183/13993003.02978 -2020人。 打印2021年7月。

间充质基质细胞细胞外囊泡救援线粒体功能障碍和改善ARDS的临床相关模型的屏障的完整性

Johnatas南美洲席尔瓦1, 悦苏1, 卡罗琳S Calfee234, 凯文·L卢基5, 丹尼尔·韦斯6, 丹尼F McAuley1, 塞西莉亚O 'Kane1, 安娜D Krasnodembskaya7
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间充质基质细胞细胞外囊泡救援线粒体功能障碍和改善ARDS的临床相关模型的屏障的完整性

Johnatas南美洲席尔瓦et al。 欧元和J。 。
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肺泡epithelial-capillary屏障破坏的一个特点是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。线粒体功能障碍的贡献在ARDS妥协alveolar-capillary障碍尚不清楚。间充质基质细胞细胞外囊泡(MSC-EVs)颗粒治疗ARDS的作为。线粒体转移被证明是重要的对msc和MSC-EVs的治疗效果。这里我们研究线粒体功能障碍的贡献的损伤肺泡上皮和内皮细胞障碍在ARDS和MSC-EVs的调节能力alveolar-capillary屏障完整性通过线粒体转移。主要人类小气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞和人类精密切肺片(pcl)和内毒素刺激或ARDS患者的血浆样本和治疗与MSC-EVs屏障属性和线粒体功能进行评估。脂多糖(LPS)受伤的老鼠接受MSC-EVs和程度的肺损伤和肺组织线粒体呼吸的评估。炎症刺激导致增加渗透率加上明显的线粒体功能障碍两种类型的主细胞和pcl。细胞外囊泡来自正常msc屏障完整性和恢复正常水平的氧化磷酸化而不含有线粒体的细胞外囊泡的准备并不是有效的。在活的有机体内对于细胞外囊泡,线粒体的存在是至关重要的减少肺损伤和恢复能力在肺组织线粒体呼吸。在ARDS环境中,MSC-EVs改善alveolar-capillary屏障性能至少部分通过恢复线粒体功能通过线粒体转移。

利益冲突声明

利益冲突:j .南美洲席尔瓦没有披露。利益冲突:y苏没有披露。利益冲突:C.S. Calfee报告从国家卫生研究院资助,在进行研究;助学金和罗氏的个人费用咨询/基因泰克和拜耳,个人费用从夸克制药和Prometic顾问委员会的工作,个人费用从Gen1e生命科学和Vasomune咨询公司,在提交工作。利益冲突:K.L.卢基没有披露。利益冲突:d·维斯没有披露。利益冲突:测向McAuley报告个人费用从咨询公司葛兰素史克,勃林格殷格翰集团、拜耳在提交工作;他的机构已经收到英国NIHR赠款,威康信托基金会和其他;有一个专利发给他对治疗ARDS的机构;和主任研究重症监护社会和NIHR高速项目主任。 Conflict of interest: C. O'Kane reports grants from Wellcome Trust, MRC and NI HSC R& D, outside the submitted work, and that her spouse has received consultancy fees from GlaxoSmithKline, Boehringer Ingelheim and Bayer. Conflict of interest: A.D. Krasnodembskaya reports grants from Medical Research Council, UK, during the conduct of the study.

数据

图1
图1
描述的MSC-derived细胞外囊泡(MSC-EVs)。)描述MSC-EVs使用纳米粒子跟踪分析(直方图生成从五个独立的测量)。b)代表透射电子显微镜(TEM),图像显示了:多泡体(左上角,规模酒吧= 50海里),液(左下,规模酒吧= 100海里),线粒体结构等(右上角,比例尺= 1µm)和线粒体结构(右下角,规模酒吧200海里)。图片使用TEM显微镜拍摄(JEOL JEM 1400 +,日本)。c)蛋白表达水平的免疫印迹TOM20 MSC-EVs和MSC-EVs-Rho溶解产物。所有航线都含有相同数量的总蛋白质。d)代表流式细胞术块MSC-EVs共轭4µm珠子展示电动车数量双CD44阳性和MitoTracker深红色调频(19.1%)和电动汽车数量双阳性CD63, MitoTracker深红色调频(23.8%)。e)代表纳米粒子跟踪的柱状图分析EVs隔绝Rhodamine-6G预处理的MSC(生成直方图从五个独立的测量)。f)免疫印迹蛋白质表达水平的TOM20 Rho-EVs溶解产物。所有航线都含有相同数量的总蛋白c。
图2
图2
MSC-EVs改善人类原发性肺上皮和内皮细胞屏障完整性的通过转移功能的线粒体。)代表生活的图像MSC-EVs线粒体掩饰人类小气道上皮细胞(HSAECs)和人类肺微血管内皮细胞(HPMECs)(规模酒吧= 50海里(左面板)和10 nm(右面板))。b和c) M1系数co-localisation HSAECs (b)和HPMECs (c),图像被使用尼康6 d Eclipse Ti-E倒置显微镜与Okolab温度单位和公司联系2环境室(尼康仪器、日本)(40×干超级计划萤石ELWD目标0.6 NA)。数据均值± sd十图像帧。d和e)白介素8 (IL)分泌的水平HSAECs (d)和HPMECs (e), f)代表实时阻抗分析HSAECs暴露在脂多糖(LPS)和处理MSC-EVs或MSC-EVs-Rho。g)细胞阻抗的HSAECs XCelligence RTCA测量。数据均值± sd(n = 3)。实时阻抗分析h)代表HPMECs暴露与MSC-EVs或MSC-EVs-Rho有限合伙人和治疗。我)细胞阻抗HPMECs XCelligence RTCA测量。数据均值± sd(n = 3)。ns:不显著;*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试(d和e)。单向方差分析分析事后Bonferroni测试(g)。
图3
图3
脂多糖(LPS)诱导线粒体功能异常在人类原发性肺上皮和内皮细胞由转移缓解MSC-EVs线粒体功能。)代表生活JC-1染料荧光的图片作为一个指示器的人类小气道上皮细胞线粒体膜电位(HSAECs)和人类肺微血管内皮细胞(HPMECs)与MSC-EVs或MSC-EVs-Rho接触有限合伙人和治疗后24 h。白色箭头指着的动摇线粒体膜(JC-1单体)和红色箭头指示两极分化的线粒体膜(JC-1总量)。FCCP被用作控制线粒体两极化。图像被使用尼康6 d Eclipse Ti-E倒置显微镜(比例尺= 100µm)。b和c)量化HSAECs的红/绿荧光强度比值(b)和HPMECs (c)。数据均值± sd十个图片。d)代表生活HSAECs和HPMECs线粒体超氧化物生产的图像检测与接触有限合伙人和治疗后MitoSOX MSC-EVs MSC-EVs-Rho 24 h或预处理与MitoTempo (Mt), 4 h之前刺激。白色箭头表明线粒体ROS HSAECs和HPMECs形成。图像被使用尼康6 d Eclipse Ti-E倒置显微镜(比例尺= 100µm)。e和f)定量荧光强度的MitoSOX HSAECs (e)和HPMECs (f)。数据均值± sd十个图片。g)代表海马水压力试验显示在HSAECs耗氧速率(OCR)。h-j)呼吸参数的计算值:基底呼吸(h)、最大呼吸(i)和ATP生产(j), (n = 3)。k)代表海马水压力试验显示HPMECs OCR。l-n)呼吸参数的计算值:基底呼吸(l),最大呼吸(m)和ATP生产(n), (n = 3)。数据意味着± sd。ns:不显著;*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试(c, d, f和g)。单向方差分析分析事后Bonferroni的测试(h-j和l-n)。
图4
图4
炎性环境扰乱人类原发性肺上皮和内皮细胞线粒体内稳态MSC-EVs缓解的。)代表共焦显微镜的人类小气道上皮细胞(HSAECs)和人类肺微血管内皮细胞(HPMECs)显示细胞核(DAPI),线粒体(红色)和LC3-II在不同的实验条件(绿色)。箭头表示co-localisation,表明公司的线粒体自噬小体。图像被使用徕卡SP8共焦显微镜和40×油浸物镜(比例尺= 50µm)。b和c) Mitophagy评估co-localisation线粒体特定的红色荧光绿色自噬小体标记LC3-II HSAECs (b)和HPMECs (c),数据均值± sd十图像帧。d)代表共焦显微镜显示生物起源HSAECs和HPMECs细胞的线粒体。箭头指向的胞质积累BrdU-positive mtDNA。图像被使用徕卡SP8共焦显微镜和40×油浸物镜(比例尺= 50µm)。e和f)的量化比例BrdU-positive mtDNA每细胞质体积HSAECs (e)和HPMECs (f)。数据意味着± sd十图像帧。ns:不显著;* *:p < 0.01;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试。
图5
图5
MSC-EVs抑制炎症反应和恢复人类肺组织线粒体功能通过线粒体转移体外人工培养的精密切肺片(pcl)。a)白介素8 (IL)分泌水平pcl上层清液在24 h后暴露在有限合伙人(n = 6 - 8 3捐助者)。b)的肿瘤坏死因子(TNF)水平在pcl -α分泌在24 h后上层清液接触有限合伙人(n = 6 - 8 3捐助者)。c)的受体水平先进的糖化终端产品(愤怒)分泌在pcl在24 h后上层清液接触有限合伙人(n = 6 - 8 3捐助者)。d) pcl可行性以乳酸脱氢酶(LDH)释放(n = 8 - 10, 3捐助者)。e)代表住在pcl JC-1荧光的图片作为线粒体膜电位的指标。FCCP作为积极控制完整的线粒体膜两极化。白色箭头指向线粒体膜电位较低的区域(JC-1单体的积累)和橙色箭头指向的正常分化线粒体膜(JC-1积累总量)的肺部组织。图像被使用尼康6 d Eclipse Ti-E倒置显微镜(比例尺= 1毫米)。f)量化的红绿色JC-1荧光比率在pcl被ImageJ分析软件。 Data represented as mean± sd十图像帧。g)代表线粒体超氧化物生产检测的图像在pcl MitoSOX。图像被使用尼康6 d Eclipse Ti-E倒置显微镜(比例尺= 1毫米)。ImageJ h)定量荧光强度分析的软件。数据表示为± sd十图像帧。我)代表海马水压力测试分析显示在pcl耗氧速率(OCR)。j-l)计算值是正常控制pcl呼吸参数:基础呼吸(j),最大呼吸(k) (l)和ATP生产。(n = 3独立实验,3捐助者)。数据表示为± sd。ns:不显著;*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试。
图6
图6
MSC-EVs调节炎症反应和部分恢复上皮和内皮屏障属性通过线粒体在ARDS环境中转移在体外。a, b)白介素8 (IL)分泌水平由人类小气道上皮细胞(HSAECs) (a)和人类肺微血管内皮细胞(HPMECs)在24小时(b)两种类型的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等离子体(n = 3)。c)代表实时阻抗分析HSAECs暴露hypo-inflammatory ARDS等离子体。d)细胞阻抗分析XCelligence RTCA测量HSAECs (n = 3)。e)代表实时阻抗HPMECs暴露hypo-inflammatory ARDS等离子体。f)细胞阻抗分析XCelligence RTCA测量HPMECs (n = 3)。g)代表实时阻抗HSAECs暴露hyper-inflammatory ARDS等离子体。h)细胞阻抗分析XCelligence RTCA测量HSAECs (n = 3)。我)代表实时阻抗分析HPMECs暴露hyper-inflammatory ARDS血浆样本。j)细胞阻抗分析XCelligence RTCA测量HPMECs (n = 3)。 k and l). Calculated values for mitochondrial ATP production of HSAECs (k) and HPMECs (l) in both ARDS microenvironments (n=3). Data represented as mean± sd。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试。
图7
图7
MSC-EVs angiopoetin水平表达下调(Ang) 2由人类原发性肺上皮和内皮细胞分泌。)Ang-2分泌水平的人类肺微血管内皮细胞(HPMECs)上层清液接触后24 h有限合伙人(n = 4)和PBS和治疗,MSC-EVs MSC-EVs-Rho或Mitotempo (Mt)。b)水平的Ang-2人类小气道上皮细胞分泌后24 h (HSAECs)浮在表面的接触有限合伙人(n = 5)和PBS,对待MSC-EVs MSC-EVs-Rho或Mitotempo (Mt)。c) Ang-2分泌水平HPMECs上层清液在24小时两种类型的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等离子体(n = 3)和PBS和治疗,MSC-EVs MSC-EVs-Rho或Mitotempo (Mt)。d)水平的HSAECs Ang-2分泌的上层清液在两种类型的24小时ARDS等离子体(n = 5)和PBS和治疗,MSC-EVs MSC-EVs-Rho或Mitotempo (Mt)。数据表示为± sd。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试。
图8
图8
MSC-EVs减少LPS-induced肺损伤和恢复小鼠肺组织中线粒体的呼吸在活的有机体内。)总蛋白浓度的支气管肺泡灌洗液(BALF)样品(n = 8 - 10老鼠每组)。罪犯)总细胞数(b),绝对中性粒细胞绝对计数(c)和单核细胞计数(d) BALF中样品(n = 6小鼠每组)。e)代表的图像BALF cytospin准备演示炎性细胞招聘使用徕卡的空域被DM5500显微镜数字化(原来的放大,x20)。f) BALF的肿瘤坏死因子-α水平(TNF-α)。g) BALF keratinocyte-derived趋化因子水平(KC,小鼠模拟interleukin-8)。h)的示意图表示代小鼠精密cut-lung片(mPCLSs)。我)代表海马水压力测试分析显示在mPCLSs耗氧速率(OCR)。j-l)为基底呼吸(j)计算值,最大呼吸(k)和ATP生产mPCLSs (l)。数据表示为± sd。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001;* * * *:p < 0.0001。克鲁斯卡尔-沃利斯测试事后邓恩的测试。
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