． 2020年12月7日;217(12):e20201129。

doi: 10.1084 / jem.20201129。

sars - cov -2触发的中性粒细胞细胞外陷阱介导COVID-19病理

弗拉维奥·普罗塔西奥·维拉斯¹²， Marjorie Cornejo Pontelli^3.4， Camila Meirelles Silva¹²， Juliana E Toller-Kawahisa¹²，米哈伊尔·德·利马¹²，丹尼尔·卡瓦略·纳西门托¹²，艾达·恩里克斯·施奈德¹²，迭戈Caetite¹²，卢卡斯·阿尔维斯·塔瓦雷斯^3.4，伊莎多拉·M·派瓦¹²，罗伯塔罗萨莱斯⁴，大卫结肠¹²，罗纳尔多马丁斯^3.4，伊塔洛·阿劳霍·卡斯特罗^3.4，格劳西亚·M·阿尔梅达¹²，玛丽亚·伊莎贝尔·费尔南德斯·洛佩斯⁵， Maíra尼尔森·贝纳蒂⁵， Letícia帕斯托雷利·邦约诺⁵， Marcela Cavichioli Giannini⁵，罗德里戈Luppino-Assad⁵， Sérgio卢娜·阿尔梅达⁵，费尔南多Vilar⁵，罗德里戈·桑塔纳⁵，瓦尔德斯·R·波列拉⁵，玛丽亚Auxiliadora-Martins⁵，马科斯博尔赫斯⁵，卡洛斯·恩里克·米兰达⁵，安东尼奥Pazin-Filho⁵， Luis Lamberti P da Silva^3.4，拉里萨·迪亚斯·库尼亚⁴，达里奥·S·赞博尼¹⁴，菲利普Dal-Pizzol⁶，路易斯·奥·莱利亚¹²，李思源⁷，塞布丽娜Batah⁷，亚历山大Fabro⁷，泰国人Mauad⁸，玛丽莎Dolhnikoff⁸， Amaro Duarte-Neto⁸，保罗Saldiva⁸， Thiago Mattar Cunha¹²， José卡洛斯·阿尔维斯-菲尔霍¹²， Eurico阿鲁达^3.4，保罗Louzada-Junior¹⁵， Renê多尼采蒂·奥利维拉⁵，费尔南多·奎罗斯·库尼亚¹²

从属关系

¹巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院炎症疾病研究中心，Ribeirão普雷托，São保罗。
²巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院，Ribeirão普雷托，São保罗。
^3.巴西São保罗大学Ribeirão Preto医学院病毒学研究中心，Ribeirão Preto, São保罗。
⁴巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院细胞与分子生物学系，Ribeirão普雷托，São保罗。
⁵临床免疫学、急诊、传染病和重症监护室，Ribeirão普雷托医学院，São保罗大学，Ribeirão普雷托，São保罗，巴西。
⁶南圣卡塔琳娜大学健康科学系健康科学研究生项目实验病理生理学实验室，Criciúma，圣卡塔琳娜，巴西。
⁷病理学和法律医学，São保罗大学Ribeirão普雷托医学院，Ribeirão普雷托，São保罗，巴西。
⁸巴西圣保罗São大学医学院病理科，São圣保罗。

PMID:32926098
PMCID:PMC7488868
DOI:10.1084 / jem.20201129

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sars - cov -2触发的中性粒细胞细胞外陷阱介导COVID-19病理

弗拉维奥·普罗塔西奥·维拉斯et al。 J实验医学． 2020．

免费PMC文章

． 2020年12月7日;217(12):e20201129。

doi: 10.1084 / jem.20201129。

作者

从属关系

¹巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院炎症疾病研究中心，Ribeirão普雷托，São保罗。
²巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院，Ribeirão普雷托，São保罗。
^3.巴西São保罗大学Ribeirão Preto医学院病毒学研究中心，Ribeirão Preto, São保罗。
⁴巴西São保罗大学Ribeirão普雷托医学院细胞与分子生物学系，Ribeirão普雷托，São保罗。
⁵临床免疫学、急诊、传染病和重症监护室，Ribeirão普雷托医学院，São保罗大学，Ribeirão普雷托，São保罗，巴西。
⁶南圣卡塔琳娜大学健康科学系健康科学研究生项目实验病理生理学实验室，Criciúma，圣卡塔琳娜，巴西。
⁷病理学和法律医学，São保罗大学Ribeirão普雷托医学院，Ribeirão普雷托，São保罗，巴西。
⁸巴西圣保罗São大学医学院病理科，São圣保罗。

PMID:32926098
PMCID:PMC7488868
DOI:10.1084 / jem.20201129

摘要

重症COVID-19患者会出现急性呼吸窘迫综合征，可能发展为细胞因子风暴综合征、器官功能障碍和死亡。考虑到中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)已被描述为炎症性疾病中组织损伤的重要介质，我们研究了NETs是否参与COVID-19的病理生理学。纳入了32名确诊为COVID-19的住院患者和健康对照者。在COVID-19患者的血浆、气管吸出物和肺尸检组织中，NETs的浓度升高，其中性粒细胞释放的NETs水平升高。值得注意的是，我们发现活的SARS-CoV-2可以直接诱导健康中性粒细胞释放NETs。在机制上，由SARS-CoV-2引发的NETs依赖于血管紧张素转换酶2、丝氨酸蛋白酶、病毒复制和PAD-4。最后，sars - cov -2激活的中性粒细胞释放的NETs促进体外肺上皮细胞死亡。这些结果揭示了NETs在COVID-19病理生理学中可能的有害作用。因此，抑制NETs是COVID-19的潜在治疗靶点。

利益冲突声明

披露:作者声明不存在竞争利益。

数据

**图S1。**
**COVID-19患者免疫病理特征。** **(一)**所有流式细胞仪分析均采用前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)门控排除双胞。用固定活力染色和侧散射区(SSC-A)门控法鉴定活细胞。中性粒细胞被鉴定为CD15染色细胞⁺CD16⁺中CD14⁻CD19⁻细胞。**(B)**流式细胞术分析健康对照(H.Control)或COVID-19患者全血活细胞。**(C)**CD15的频率和绝对数⁺CD16⁺中性粒细胞门控CD14⁻CD19⁻来自健康对照者全血的活细胞(n= 7)或COVID-19患者(n= 7)。**(D)**一名死于COVID-19的患者的胸部CT。从根尖到基底段(I到IV)的图像显示周围和支气管血管周围分布的多处空气支气管影实变，下叶更明显，伴有磨玻璃样混浊。**(E)**10例具有代表性的肺组织学表现，超声引导下进行微创解剖。I:间质性和肺泡中性粒细胞性肺炎，弥漫性肺泡损伤，肺泡间隙有透明膜(黑色箭头)。有白细胞边缘的间隔血管和腔内早期纤维蛋白血栓(绿色星形)。II:中性粒细胞性肺炎(红色箭头)、鼻中隔增厚、上皮脱屑和鳞状化生(黑色箭头)。I和II: H&E。比例尺表示50µm。数据代表至少两个独立的实验，一个实验，并显示为平均值±SEM。P值由双尾未配对Student确定t测试(C)。

**图1所示。**
**COVID-19患者产生高浓度的NETs。**从健康对照组和COVID-19患者中分离出血浆和中性粒细胞。**(一)**用MPO-DNA PicoGreen法定量健康对照组(H.Control;n= 21)或COVID-19患者(n= 32)。**(B)**来自健康对照的血分离中性粒细胞培养的上清(n= 10)或COVID-19患者(n= 11)。NET定量采用MPO-DNA PicoGreen法。**(C)**从健康对照中分离的中性粒细胞释放NETs的代表性共聚焦分析(n= 10)或COVID-19患者(n= 11)，在37°C下培养4 h。细胞细胞核(DAPI，蓝色)、MPO(绿色)和h3it(红色)染色。比例尺表示50µm。**(D)**健康对照之间DAPI和MPO的共定位(n= 10)和COVID-19 (n= 10)。数据描述了Fiji/ImageJ软件评估的Pearson相关系数。**(E)**COVID-19患者中性粒细胞NETosis百分比(n= 7)。**(F)**净长度量化。**(G)**应用MPO-DNA PicoGreen法定量新冠肺炎患者血分离中性粒细胞上清中的NET (n= 3)与PAD-4抑制剂(Cl-Amidine;200 μ M)在37°C下加热4小时。**(H)**具有代表性的共聚焦图像显示，来自COVID-19患者的分离中性粒细胞中存在NETs，无论是否使用Cl-Amidine(200µM)治疗。细胞细胞核(DAPI，蓝色)、MPO(绿色)和h3it(红色)染色。比例尺表示50µm。数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由双尾未配对(A, B，和D-F)或配对(G)学生确定t测试。

**图2。**
**NET在COVID-19患者肺部的释放。(一)**新型冠状病毒肺炎患者气管吸出物MPO-DNA PicoGreen法NET定量分析(n= 12)和健康对照组的盐水诱导气道液体(H.Control;n= 9)。**(B)**新型冠状病毒肺炎患者气管吸入液中性粒细胞NETs的代表性共聚焦分析(n= 5)。染色细胞的细胞核(DAPI，蓝色)，MPO(绿色)，h3it(红色)。比例尺表示50µm。**(C)**阴性对照尸检肺组织中net存在的代表性共聚焦图像(n= 3)或COVID-19 (n= 6)病人。细胞细胞核(DAPI，蓝色)、MPO(绿色)和h3it(红色)染色。比例尺表示50µm。数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由双尾未配对Student确定t测试(一个)。

**图3。**
**SARS-CoV-2诱导健康中性粒细胞释放NETs。**从健康对照中分离中性粒细胞，并与Mock、灭活SARS-CoV-2或SARS-CoV-2 (MOI = 0.5或1.0)孵育。一组用SARS-CoV-2 MOI = 1.0培养的细胞用PAD-4抑制剂(Cl-Amidine, 200µM)预处理。**(一)**NET发布的代表性图片。细胞细胞核(DAPI，蓝色)、MPO(绿色)和h3it(红色)染色。比例尺表示50µm。**(B及C)**用MPO-DNA PicoGreen法定量NET (B)和中性粒细胞上清中NET长度的定量(C;n= 6)。**(D)**用Mock或SARS-CoV-2培养的中性粒细胞(MOI = 1.0)的细胞核(DAPI，白色)、MPO(绿色)、H3Cit(红色)和SARS-CoV-2(青色)免疫染色的代表性图像。比例尺表示50µm。**(E)**net阳性细胞对SARS-CoV-2抗原染色或未染色的百分比(分析10个域)。sars - cov -2感染的中性粒细胞(MOI = 1.0，n= 3)用10µM TDF (RNA聚合酶抑制剂)预处理。**(F及G)**采用MPO-DNA PicoGreen法定量NETs (F)和感染后4 h中性粒细胞颗粒RT-PCR检测SARS-CoV-2病毒载量(G)。采用相对于SARS-CoV-2组的倍数变化。**(H)**来自健康对照组的中性粒细胞(n= 3)用10µM TDF预处理或未处理的PMA刺激。培养4 h后中性粒细胞上清液采用MPO-DNA PicoGreen法定量NET。**(我)**感染后2、4小时dsRNA(红色)免疫染色检测复制情况。细胞核(DAPI，蓝色)和MPO(绿色)作为中性粒细胞染色的对照。比例尺表示50µm。数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由单向方差分析和Bonferroni事后检验(B, C和E-H)确定。

**图S2。**
**新冠肺炎患者感染的中性粒细胞诱导肺上皮细胞凋亡。** **(一)**显示COVID-19患者血液中性粒细胞中SARS-CoV-2抗原检测的代表性共聚焦图像(n= 5)，但在来自健康对照组的中性粒细胞中没有(H.Control;n= 5)。细胞核(DAPI，白色)，MPO(绿色)，H3Cit(红色)，SARS-CoV-2(青色)染色。比例尺表示50µm。**(B)**net阳性细胞对SARS-CoV-2抗原染色或未染色的百分比。血分离中性粒细胞(10⁶细胞)从健康对照(n= 3)或COVID-19患者(n= 3)与A549肺上皮细胞共培养(5 × 10⁴细胞)24小时，在37°C。**(C)**的表达*ACE2*通过常规PCR (C)在Caco-2中检测hACE2转导的HeLa细胞(HeLa -*ACE2*)， HeLa细胞，并从健康对照中分离出中性粒细胞。*GAPDH*表达量作为基因表达的负荷控制。这些样本在相同的凝胶上运行，虚线代表不相关的车道。**(D)**A549 Annexin V的FACS分析的代表性点图⁺细胞。**(E)**膜联蛋白V的频率⁺A549细胞。数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由双尾未配对Student确定t测试(两场/病人;B)或单向方差分析，然后进行Bonferroni的事后测试(E)。

**图4。**
**中性粒细胞中SARS-CoV-2感染依赖于ACE2和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2途径形成NETs。** **(一)**通过Western blot (A)检测acaco -2、hACE2转导的HeLa细胞中ACE2的表达*ACE2*)， HeLa细胞，并从健康对照中分离出中性粒细胞。以β-肌动蛋白表达量作为蛋白表达负荷控制。用中和性抗ace2抗体(αACE2, 0.5µg/ml)和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2抑制剂camostat(10µM)预处理sars - cov -2感染的中性粒细胞(MOI = 1.0)。**(B)**用MPO-DNA PicoGreen法定量中性粒细胞上清液中的NETs (n= 6)。**(C)**细胞核免疫染色(DAPI，蓝色)，MPO(绿色)，H3Cit(红色)。比例尺表示50µm。**(D)**中性粒细胞球团SARS-CoV-2病毒载量检测(n= 3)感染4 h后进行RT-PCR检测。相对于SARS-CoV-2组的折叠变化。**(E)**来自健康对照组的pma刺激中性粒细胞(n= 3)用0.5µg/ml αACE2和10µM camostat预处理或不预处理。PMA刺激4 h后中性粒细胞上清液中采用MPO-DNA PicoGreen法定量NET。数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由单向方差分析和Bonferroni事后检验(B, D, E)确定。

**图5。**
**NETs诱导肺上皮细胞凋亡。** **(一)**血分离中性粒细胞(10⁶细胞)来自健康供体，用cl -脒(200 μ M)预处理或未处理，与活SARS-CoV-2 (n= 6).由BioRender.com创建。1 h后，中性粒细胞与A549肺上皮细胞共培养(5 × 10⁴细胞)24小时，在37°C。**(B)**Annexin V的FACS分析的代表性点图⁺细胞。**(C)**膜联蛋白V的频率⁺A549细胞。**(D)**用PMA (50 nM)在37°C刺激4小时，从健康中性粒细胞中纯化NETs。Annexin V的FACS分析的代表性点图⁺A549细胞与纯化的NETs (10 ng/ml)孵育，或未与rhDNase (0.5 mg/ml)在37°C孵育24小时。**(E)**膜联蛋白V的频率⁺A549细胞。**(F)**纯化NETs (10 ng/ml)孵育24 h后A549细胞角蛋白-17表达的免疫荧光分析染色细胞的细胞核(DAPI，蓝色)和细胞角蛋白-17(红色)，一种上皮标记物。比例尺表示50µm。**(G)**A549细胞角蛋白-17平均荧光强度(MFI)的定量(15场/组)数据代表至少两个独立的实验，并用均值±SEM表示。P值由单向方差分析和Bonferroni事后检验(C, E和G)确定。

**图S3。**
**sars - cov -2感染中性粒细胞免疫染色**来自健康捐献者的中性粒细胞(n= 3)分别与Mock或SARS-CoV-2 (MOI = 1.0)孵育4 h。**(一)**细胞细胞核(DAPI，白色)，驴抗兔IgG AlexaFluor 488(绿色)，驴抗小鼠IgG AlexaFluor 647(红色)，抗人IgG生物素偶联与酪胺Cy3(青色)孵育。比例尺表示50µm。**(B)**代表性共聚焦图像显示，net存在于孤立的中性粒细胞(DAPI，白色)，MPO(绿色)和H3Cit(红色)染色的细胞核中。使用健康供体的免疫前血清，对照SARS-CoV-2染色(青色)。比例尺表示50µm。

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